Name: En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a monitorear en tiempo real la activación de receptores olfatorios mediante estimulación con odorantes en fase vapor in vitro. Este método permite estudiar la cinética de la percepción olfativa y desarrollar biosensores.

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Este trabajo fue financiado por becas del NIH (DC014423 y DC016224) y el defensa avanzada proyecto Agencia RealNose proyecto de investigación. YF me alojé en Duke University con apoyo financiero del programa JSP para avance estratégico internacional redes acelerar la circulación de investigadores talentosos (R2801). Agradecemos a Sahar Kaleem para la edición del manuscrito.

1. Hana3A las células de cultura
<ol><li>Preparar M10 (medio esencial mínimo (MEM) más 10% v/v suero fetal bovino (FBS)) y M10PSF (M10 más 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B).</li>
	<li>Las células en 10 mL de M10PSF en una placa de cultivo celular de 100 mm en una incubadora a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono (CO2) de la cultura.</li>
	<li>Las células se dividen cada 2 días en una proporción de 20%: cuando la confluencia 100% de las células (aproximadamente 1.1 x 107 células) se observa bajo un microscopio de contraste de fase, aspiran los medios de comunicación y lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Aspire PBS y añadir 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,48 mM). Dejar actuar durante aproximadamente 1 minuto, hasta que disocian las células de la placa.</li>
	<li>Añadir 5 mL de M10 para inactivar la tripsina y finalmente separar las células todavía conectadas a la placa mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Transfiera el volumen (8 mL) a un tubo de 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 min aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de M10PSF transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier celular masiva. Evitar la creación de burbujas en el tubo.</li>
	<li>Transferir 1 mL de la solución de células resuspendidos en una placa de cultivo de células de 100 mm nuevo y agregar 9 mL de M10PSF fresco. Incubar a 37 ° C y 5% CO2.</li>
</ol>2. preparación de las células para transfección
<ol><li>Evaluar la confluencia, o el número de células, mediante la observación bajo el microscopio de contraste de fase. Al menos 10% confluencia (aproximadamente 1.1 x 106 células) es necesaria para una placa.</li>
	<li>Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células con 10 mL de PBS. Aspire PBS y añadir 3 mL de EDTA. Dejar actuar durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente, hasta que disocian las células de la placa.</li>
	<li>Añadir 5 mL de M10 para inactivar la tripsina y finalmente separar las células todavía conectadas a la placa mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir el volumen (8 mL) a un tubo de 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de M10PSF transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier celular masiva. Evitar la creación de burbujas en el tubo.</li>
	<li>Dependiendo del número de placas a ser transfectadas, transfiera una cantidad adecuada de células en un depósito con el correspondiente volumen adecuado de M10PSF. Una placa de 96 pocillos debe ser plateada con 1/10 de un plato de 100 mm confluentes de 100% (aproximadamente 1.1 x 106 células) diluido en M10PSF para llegar a un volumen total de 6 mL. Para una placa de 96 pozos a partir de un plato de 100 mm de 100% de confluencia, agregar 500 μl de 5 mL de células resuspendidas a 5,5 mL de M10PSF fresco. Mezcle las células y M10PSF sin generar burbujas de aire.</li>
	<li>Pipetear 50 μl de las células suspendidas en cada pocillo de la placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante una noche a 37 ° C y 5% CO2.</li>
</ol>3. transfección del plásmido
<ol><li>Observar la placa de 96 pocillos con un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre 30% y 50%.</li>
	<li>Preparar una mezcla de transfección primera que contiene la plásmidos comunes a toda la placa (RTP1S, o y Glosensor proteínas, véase Tabla de materiales) después de los volúmenes en la tabla 1. Tenga en cuenta que la cantidad de OR tagged Rho debe dividirse por el número de RUP si varias SRO. Nota: Fuertemente Consejo añadir un vector vacío negative control (aquí Rho-pCI) y control positivo (conocido OR responder al olor prueba) para el plan del experimento.</li>
	<li>Preparar una mezcla de transfección segundo conteniendo 500 μl de MEM y 20 μl del reactivo Lipofectamine 2000 (válido para una placa de 96 pocillos, véase Tabla de materiales). Añadir la mezcla del segundo al primero y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Añadir 5 mL de M10 y mezclar suavemente.</li>
	<li>Vuelva a colocar el M10PSF en la placa de 96 pocillos previamente platted 50 μl de los medios de comunicación de final de la transfección. Incubar en un set de incubadora a 37 ° C y 5% CO2 y la cámara del luminómetro durante la noche siguiente el procedimiento descrito en el paso 6 del vacío.</li>
</ol>4. sustrato incubación
<ol><li>Observar la placa de 96 pocillos con un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre 60% y 100%. Preparar una solución de estimulación de Hank balanceado sal solución (HBSS) que contiene 10 mM de ácido-1-ácido de hidroxietilo (HEPES) y 5 mM de D-glucosa.</li>
	<li>Diluir 75 μl de reactivo de campo (ver tabla de materiales) solución a 2,75 mL de la solución de estimulación. Retire el medio de transfección de la placa de 96 pocillos y lavar las células añadiendo 50 μl de solución fresca de la estimulación a cada pocillo.</li>
	<li>Retirar la solución de estimulación y añada 25 μl de solución de campo reactivo preparado en el paso 4.2 a cada pocillo. Incubar la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y sin olor (por ejemplo, un cajón limpio vacío lejos de productos químicos o de cualquier fuente de olor) por 2 h.</li>
</ol>5. olor estimulación
<ol><li>En primer lugar, equilibrar la cámara luminómetro con moléculas volátiles odorantes. Diluir el olor a la concentración deseada en 10 mL de aceite mineral (figura 2A). Antes de finalizar el tiempo de incubación de campo reactivo, añadir 25 μl de la solución de olor en una placa de 96 pocillos nuevo (no uno que contiene las células). Incubar este olor la placa a temperatura ambiente en la cámara de luminómetro para 5 minutos (figura 2B) (ningún registro de luminómetro se requiere aquí).</li>
	<li>Establecer el luminómetro para grabar la luminiscencia con 0 s de retraso durante 20 ciclos de medida de la placa de 90 s con 0,7 s de intervalo entre los ciclos.</li>
	<li>Justo antes de leer la placa, quite la placa de odorante de la cámara. Añada 25 μl de olor entre los pocillos de la placa de 96 pocillos que contienen las células (no agregar el aroma en los pozos que contienen las células) y rápidamente iniciar la medición de la luminiscencia de todos los pozos de 20 ciclos dentro de 30 minutos (figura 2C).</li>
</ol>6. eliminación de olor restantes dentro del luminómetro
<ol><li>Abrir la puerta del luminómetro. Inserte el tubo conectado a la bomba de vacío.</li>
	<li>Cámara de vacío odorantes en la leyendo extensivamente (al menos 2 h, preferiblemente durante la noche) entre dos aceites para evitar la contaminación cruzada de volátiles de olor de un experimento a otro. Reemplazar con aire fresco mediante el envío de aire comprimido durante 5 min antes de incubar el aroma próximo.</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>Exportar los datos del software del luminómetro.</li>
	<li>Promedio de las repeticiones de la misma o de cada hora. Calcular la respuesta normalizada de OR a cualquier eventual control (por ejemplo, vector vacío, figura 3A y sección resultados representativos) dividiendo el valor de control promediado del o un promedio de valor en cada momento de grabación (figura 3B y la sección de resultados representativos).</li>
	<li>Normalizar la cada respuesta OR su actividad basal dividiendo la respuesta promedio de OR en 0 s a cada respuesta de tiempo de grabación (véase la figura 3C y sección resultados representativos).</li>
	<li>Calcular el área bajo la curva de cada o para obtener un único valor de respuesta OR. Para ello, suma todos los valores de luminiscencia de cada hora por cada o.</li>
</ol>

Dufr, H. K y H.M. presentaron una solicitud de patente correspondiente a este trabajo en 27 de octubre de 2016.

La percepción del olor es fundamentalmente dependiente de la activación de las RUP. En consecuencia, entendimiento de su funcionalidad es necesaria para romper los complejos mecanismos que utiliza el cerebro para percibir su entorno químico volátil. Sin embargo, la comprensión de este proceso ha sido obstaculizada por las dificultades en el establecimiento de un método robusto para el repertorio de OR para funcionalidad contra olores in vitro. de la pantalla Célula de expresión heteróloga y superficie de ORs se ...

El sentido del olfato permite que los animales terrestres interactuar con su ambiente químico volátil para coche comportamientos y emociones. Fundamentalmente, el proceso de detección de olor comienza con la primera interacción de moléculas de olor con el sistema olfativo, en el nivel de odorante receptores (SRO)1. En los mamíferos, ORs individualmente se expresan en neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizadas en el epitelio olfatorio2. Pertenecen a la familia de receptores (GPCR) proteína G acoplada y más precisamente a la subfamilia rhodopsin-como (también llamado clase A). Pareja de SRO con el estimulante G proteínas Golf cuya activación conduce a campo producción seguido por la apertura de canales de nucleótido cíclico cerrado y la generación de potenciales de acción. Se acepta que el percept de un olor se basa en un patrón específico de ORs activado3,4 y por lo tanto reconocimiento de olor sigue un esquema de codificación combinatorio, donde uno OR puede ser activado por un conjunto de olores y un odorante puede activar una combinación de ORs. Y a través de tal codificación combinatoria, se postula que los organismos pueden detectar y discriminar entre un gran número de moléculas de olor volátil. Una de las claves para entender cómo se perciben los olores es entender cómo y que ORs son activados por un olor determinado.
En un intento de aclarar olor- o interacciones, ensayos funcionales in vitro han jugado un papel esencial. La identificación de ligandos los agonistas para el huérfano ORs (orphanization de OR) ha sido un campo muy activo durante los últimos veinte años, mediante el uso de vario in vitro, ex vivo e in vivo análisis funcional5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
Sistemas de ensayo in vitro son los más adecuados para la caracterización funcional detallada de ORs, incluyendo identificación de los dominios funcionales y residuos críticos de SRO, así como posibles usos de la ingeniería. Sin embargo, más desarrollo de valiosos sistemas in vitro para SRO ha sido un reto, en parte debido a la dificultad de cultivo OSNs y expresión funcional de las RUP en células heterólogas. El primer desafío había sido establecer protocolos que permitían la expresión superficial de la célula de SRO funcional en el mapeo de olor-interacciones de OR. Un número de grupos independientes ha utilizado varios enfoques5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Uno de los primeros logros fue hecha por Krautwurst et en la etiqueta el N-terminal de SRO con una secuencia acortada de la rodopsina (Rho-tag) y observó una mejor expresión superficial en células de riñón embrionario humano (HEK)13. Variaciones a la etiqueta colocada en la secuencia OR sigue siendo un camino explorado para mejorar OR expresión y funcionalidad de19,21. Saito et al.. identificado entonces transporte de receptores Proteína 1 (RTP1) y RTP2 que facilitan el tráfico de OR. 22 una versión reducida de RTP1, llamado RTP1S, también ha demostrado ser incluso más eficaz que la proteína original23. El desarrollo de una línea celular (Hana3A) que expresa estable Golf, REEP1 y RTP1, RTP2 24, juntada con el uso de reporteros de monofosfato de adenosina cíclico (campo) ha permitido la identificación de olor-interacciones de OR. El mecanismo por el cual la familia RTP de proteínas promueve la expresión superficial de la célula de ORs queda por determinarse.
Una advertencia de estos métodos establecidos es que cuentan con estímulo odorante en fase líquida, lo que significa que olores se disuelven previamente en un medio de estimulación y estimulan las células mediante la sustitución del medio. Esto es muy distinto de las condiciones fisiológicas donde odorante moléculas alcanzan el epitelio olfatorio en fase de vapor y activan ORs por disolución en la mucosa nasal. Para asemejan más exposición estímulo fisiológico relevantes, Sanz et al.20 propone un análisis basado en la estimulación de vapor aplicando una gota de solución de odorante para colgar debajo de la cara interior de una película plástica colocada en la parte superior de pozos de la célula. Grabaron las respuestas de calcio mediante el control de intensidad de fluorescencia. Este método fue el primero en utilizar la estimulación olfativa de fase de aire, pero que no permitió una proyección grande de la activación de la OR.
Aquí, hemos desarrollado un nuevo método que permite la monitorización en tiempo real de la activación de OR in vitro mediante la estimulación de odorante de fase de vapor por el análisis de Glosensor (figura 1). Este análisis se ha utilizado previamente en el contexto de olor líquido estimulación18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. la cámara de vigilancia de luminómetro primero es equilibrada con aroma vaporizado antes de la placa (figura 1A) de lectura. Las moléculas de olor son entonces solvated en el búfer, bañando las células Hana3A expresan la o de interés, RTP1S y la Glosensor de proteínas (figura 1B). Si el olor es un agonista de la o, o cambiar a una conformación activa y enlazar la Golf, activación del cyclase del adenylyl (AC) y en última instancia causar los niveles de campo aumenten. Este campo creciente se unen y activan a la proteína de Glosensor para generar luminiscencia catalizando luciferin. Esta luminiscencia es luego registrado por el luminómetro y permite el seguimiento de la activación de OR. Este método es de gran interés en el contexto de deorphanization OR que trae sistemas in vitro más cercano a la percepción natural de los olores.

<table><tbody><tr><td>0.05 % tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% Tripsina - EDTA (1x), rojo fenol - almacenar a 4&grados; Placa</td></tr> de <tr><td>cultivo celular C de 100 mm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td>plato de cultivo celular de 100 mm x 20 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td>tubos cónicos de 17 mm x 120 mm</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3843</td><td>de 96 pocillos, con tapa LE blanca con fondo transparente Poliestireno recubierto de poli-D-lisina</td></tr><tr><td>Anfotericina</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Anfotericina B 250 &micro; g/mL - almacenar a 4 & grados; </td></tr><tr><td>Máquina centrífuga</td><td>C Jouan</td><td>C312</td><td>Máquina centrífuga con rotor de cangilón oscilante para campana</td></tr><tr><td>extractora de 15 mL Clase II Tipo A/B3</td><td>NUAIRE</td><td>NU-407-500</td><td>campana extractora para cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Suero fetal bovino - almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Reactivo</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td>GloSensor cAMP Reactivo Sustrato de proteína luminiscente - almacenar a -20 °C; </td></tr><tr><td>C Incubadora 37 &deg; C; 5 % CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-604</td><td>Incubadora para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Reactivo Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reactivo Lipofectamine 2000 1mg/ml Reactivo de transfección - almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Luminómetro POLARstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>descatalogado</td><td>Lector de placas de 96 pocillos para luminiscencia</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Disolvente para odorantes - almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Medio Esencial Mínimo (MEM)</td><td>Corning cellgro</td><td>10-010-CV</td><td>Medio Esencial Mínimo Águila con Earle' S sales & L-glutamina - almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>Solución de penicilina-estreptomicina estabilizada con 10,000 U de penicilina y 10 mg de estreptomicina - almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>pGlosensor</td><td>Promega</td><td>E2301</td><td>pGloSensor-22F cAMP plásmido de proteína luminiscente - almacenar a 4 & grados; </td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase C Microscopio de contraste</td><td>de fase Leica</td><td>090-131.001</td><td>con objetivos x4, x10, x20</td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>H. Matsunami</td><td></td> <td>lab-100 ng/&micro; Plásmido L - almacenar a 4 & grados; C</td></tr></tbody></table>

en tiempo real en el seguimiento de vitro de la activación del receptor odorante por un olor en la fase de vapor

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Percepción olfativa comienza con la interacción de olores con los receptores de olor (o) expresados por las neuronas sensoriales olfativas (OSN). Reconocimiento de olor sigue un esquema de codificación combinatorio, donde uno OR puede ser activado por un conjunto de olores y un odorante puede activar una combinación de ORs. A través de tal codificación combinatoria, organismos pueden detectar y discriminar entre un gran número de moléculas de olor volátil. Así, un olor a una concentración determinada puede ser descrito por un patrón de activación de las RUP, que es específica para cada olor. En ese sentido, se agrieta los mecanismos que el cerebro utiliza para percibir el olor requiere el olor comprensión-interacciones de OR. Por esta razón la comunidad de olfato se ha comprometido a "la orphanize" estos receptores. Sistemas in vitro convencionales usados para identificar el olor- o interacciones han utilizado incubación media de células con olor, que es distinta de la natural detección de olores mediante disolución de Odorantes de vapor en la mucosa nasal antes de interactuar con la SRO. Aquí, describimos un nuevo método que permite la monitorización en tiempo real de la activación de OR por olores fase de vapor. Nuestro método se basa en medir campo liberación por luminiscencia usando el análisis de Glosensor. Puentes actuales brechas entre los métodos in vivo e in vitro y proporciona una base para un sensor químico volátil biomiméticos.

Defendimos la respuesta de tres ORs de ratón, Olfr746, Olfr124 y Olfr1093 utilizando la estimulación de vapor del cinamaldehído (figura 3). Al mismo tiempo, utilizamos un control vector vacío (Rho-pCI) para asegurar que las actividades inducidas por el olor de las RUP probadas fueron específicas (figura 3A). La activación en tiempo real de las RUP a estímulos de olor de vapor fue monitoreada medición de más de 20 ciclos. Los datos para cada bien...

Fisiológicamente, los receptores odorantes son activados por moléculas odorantes inhaladas en la fase de vapor. Sin embargo, más sistemas in vitro utilizan la estimulación olfativa de fase líquida. Aquí, presentamos un método que permite en tiempo real monitoreo in vitro de la activación del receptor odorante al estímulo odorante en fase de vapor.

En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Nuestro protocolo permite medir la detección y discriminación de olores volátiles con un panel de receptores de olores. Este método abre la posibilidad de desarrollar biosensores basados en receptores de olores. Esta técnica permite el monitoreo in vitro en tiempo real de la activación del receptor de olores sobre moléculas de olor en fase de vapor.Llena el vacío entre los enfoques in vitro e in vivo. Este método se puede utilizar para entender la cinética de los eventos que conducen a la percepción del olor, incluyendo el papel de las enzimas metabólicas mucosas. Para empezar, prepare M10 y M10 PSF de acuerdo con el manuscrito.Las células se cultivan en 10 mililitros de PSF M10 a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Observe el plato de cultivo bajo un microscopio de contraste de fase. Cuando alcance el 100% de confluencia, divida las células a una concentración más baja aspirando los medios y lavando las células suavemente con 10 mililitros de PBS.A continuación, aspirar el PBS y añadir tres mililitros de trippsina-EDTA. Dejar reaccionar durante aproximadamente un minuto hasta que las células se disocien del plato. Agregue cinco mililitros de M10 para inactivar la tri

real-time-vitro-monitoring-odorant-receptor-activation-an-odorant

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Investigación

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Neurociencia

En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Este artículo presenta los protocolos de la intrínseca señales ópticas y señales de autofluorescencia flavoproteínas imágenes de mapa de olor evoca las actividades en la superficie del bulbo olfatorio de los ratones.

Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

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Monitorización en tiempo real de la activación del receptor odorante en células recombinantes

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Vertical T-laberinto Choice Ensayo para la respuesta a los olores artrópodos

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Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa

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Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

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Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

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