Name: Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprende a separar señales de fluorescencia múltiples mediante microscopía hiperespectral de análisis de excitación. Este método aumenta la velocidad y sensibilidad en sistemas de microscopía confocal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean reconocer el apoyo de NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, y el Fondo de Investigación de Cáncer.

Los doctores Leavesley y Rich revelan interés financiero en una empresa emergente, SpectraCyte LLC, fundada para comercializar la tecnología de imágenes espectrales.

El uso óptimo de una configuración de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación comienza con la construcción de la trayectoria de luz. En particular, la elección de la fuente de luz, los filtros (ajustables y dicoicos), el método de conmutación de filtros y la cámara determinan el rango espectral disponible, la posible velocidad de escaneo, la sensibilidad del detector y el muestreo espacial. Las lámparas de arco de mercurio ofrecen muchos picos de longitud de onda de excitación, pero no proporcionan una salida...

Las imágenes espectrales se pueden realizar de diversas maneras y se hace referencia a varios términos1,2,3,4. En general, las imágenes espectrales se refieren a datos adquiridos en al menos dos dimensiones espaciales y una dimensión espectral. Las imágenes multiespectrales e hiperespectrales se distinguen con mayor frecuencia por el número de bandas de longitud de onda o si las bandas espectrales son contiguas1. Para esta aplicación, los datos hiperespectrales se definen como datos espectrales adquiridos con bandas de longitud de onda contiguas alcanzadas por el espaciado de longitudes de onda centrales no menos de la mitad de la anchura completa a la mitad máxima (FWHM) de cada filtro de paso de banda utilizado para la excitación (es decir, 5 nm espaciado de longitud de onda central para filtros de paso de banda con anchos de banda de 14-20 nm). La naturaleza contigua de las bandas de datos permite un sobremuestreo del conjunto de datos, asegurando que se cumplan los criterios de Nyquist al muestrear el dominio espectral.
Las imágenes hiperespectrales fueron desarrolladas por la NASA en las décadasde 1970 y 1980 en conjunto con el primer satélite Landsat 5,6. La recopilación de datos de varias bandas espectrales contiguas permitió la generación de un espectro de resplandor de cada píxel. La identificación y definición del espectro de resplandor de componentes individuales permitió no sólo detectar materiales superficiales por sus espectros característicos, sino que también permitió la eliminación de señales intervinientes, como variaciones en la señal debido a condiciones atmosféricas. El concepto de detección de materiales utilizando sus espectros característicos se aplicó a los sistemas biológicos en 1996, cuando Schrock et al. utilizaron combinaciones de cinco fluoróforos diferentes y sus espectros conocidos para distinguir los cromosomas etiquetados en un proceso denominado cariotipado espectral7. Esta técnica fue elaborada en 2000 por Tsurui et al. para la toma de imágenes de fluorescencia de muestras de tejido, utilizando siete colorantes fluorescentes y descomposición de valor singular para lograr la separación espectral de cada píxel en combinaciones lineales de espectros en la referencia biblioteca8. Al igual que sus contrapartes de teledetección, la contribución de cada fluoróforo conocido se puede calcular a partir de la imagen hiperespectral, dada la información a priori del espectro de cada fluoróforo.
También se han utilizado imágeneshiperespectrales en las áreas de agricultura 9, astronomía10,biomedicina11, imágenes químicas12,aplicaciones ambientales13,atención ocular14, ciencia de los alimentos15, ciencias forenses16,17, ciencias médicas18, mineralogía19,y vigilancia20. Una limitación clave de los sistemas de imágenes hiperespectrales del microscopio de fluorescencia actual es que la tecnología de imágenes hiperespectrales estándar aísla las señales de fluorescencia en bandas estrechas por 1) primero filtrando la luz de excitación para controlar la excitación de la muestra, luego 2) filtrado adicional de la luz emitida para separar la emisión de fluorescencia en bandas estrechas que más tarde se pueden separar matemáticamente21. Filtrar tanto la iluminación de excitación como la fluorescencia emitida reduce la cantidad de señal disponible, lo que reduce la relación señal-ruido y requiere largos tiempos de adquisición. La señal baja y los largos tiempos de adquisición limitan la aplicabilidad de las imágenes hiperespectrales como herramienta de diagnóstico.
Se ha desarrollado una modalidad de imagen que hace uso de imágenes hiperespectrales pero potencia la señal disponible, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario21,22. Esta nueva modalidad, llamada imagen hiperespectral de análisis de excitación, adquiere datos de imágenes espectrales variando la longitud de onda de excitación y recopilando una amplia gama de luz emitida. Se ha demostrado anteriormente que esta técnica produce órdenes de aumentos de magnitud en la relación señal-ruido en comparación con las técnicas de escaneo de emisiones21,22. El aumento de la relación señal-ruido se debe en gran medida al paso de banda ancho (600 nm) de luz de emisión detectada, mientras que la especificidad se proporciona filtrando sólo la luz de excitación en lugar de la emisión de fluorescencia. Esto permite que todas las luzs emitidas (para cada longitud de onda de excitación) lleguen al detector21. Además, esta técnica se puede utilizar para discriminar la autofluorescencia de etiquetas exógenas. Además, la capacidad de reducir el tiempo de adquisición debido al aumento de la señal detectable reduce el peligro de fotoblanqueo, así como permite escaneos espectrales a una velocidad de adquisición que es aceptable para la imagen de video espectral.
El objetivo de este protocolo es servir como una guía de adquisición de datos para la microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Además, se incluyen descripciones que ayudan a entender la ruta de luz y el hardware. También se describe la implementación de software de código abierto para un microscopio de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Por último, se proporcionan descripciones sobre cómo calibrar el sistema a un estándar rastreable por NIST, ajustar la configuración de software y hardware para obtener resultados precisos y desmezclar la señal detectada en contribuciones de componentes individuales.

<table><tbody><tr><td>Células musculares lisas de las vías respiratorias</td><td>Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (NDRI)</td><td>Aislados de tejidos pulmonares humanos obtenidos de NDRI</td><td>Células altamente autofluorescentes y sensibles al calcio</td></tr><tr><td>Obturador automatizado</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SHB1</td><td>Obturador controlable a distancia para minimizar el fotoblanqueo</td></tr><tr><td>Etapa automatizada</td><td></td> previa <td>H177P1T4</td><td>Etapa controlable a distancia para la recopilación automatizada de múltiples campos de visión o imágenes unidas.</td></tr><tr><td>Controlador de etapa automatizado (XY)</td><td>Prior Scientific</td><td>Proscan III (H31XYZE-US)</td><td>Para la interfaz de la etapa automatizada con el ordenador y el joystick</td></tr><tr><td>Búfer</td><td>De fabricación propia</td><td></td><td>145 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 20 mM de HEPES, 10 mM de D-glucosa, 1 mM de MgCl2 y 1 mM de CaCl2, a pH 7,3</td></tr> Cámara de <tr><td>celdas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Attofluor A7816</td><td>Soporte de cubreobjetos compuesto de acero inoxidable quirúrgico y una junta tórica de goma para sellar el medio y evitar la contaminación de la muestra y/o del objetivo</td></tr><tr><td>Filtros de excitación</td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-378/16 Rango de longitud de</td><td>onda central (340-378 nm), Ancho de banda (mínimo 16 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,88)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-402/16 Rango de longitud de</td><td>onda central (360-400 nm), Ancho de banda (mínimo 16 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-449/15 Rango de longitud de</td><td>onda central (400-448,8 nm), Ancho de banda (mínimo 15 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,8)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-501/15 Rango de longitud de</td><td>onda central (448,8-501,5 nm), Ancho de banda (mínimo 15 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,84)</td></tr><tr><td></td><td>Semrock Inc.</td><td>TBP01-561/14 Rango de longitud de</td><td>onda central (501,5-561 nm), Ancho de banda (mínimo 14 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,83)</td></tr><tr><td>Cubo de filtro de fluorescencia Dichroico Divisor de haz</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF495-Di03</td><td>Separa la excitación y la luz de emisión a 495 nm (>98% de reflexión entre 350-488 nm, >93% de transmisión entre 502-950 nm), Índice efectivo del filtro (1.78)</td></tr><tr><td>Filtro de fluorescencia Cubo de filtro de paso largo</td><td>Semrock Inc.</td><td>FF01 496/LP-25</td><td>Permite el paso de luz a más de 496 nm (>93% de transmisión promedio entre 503.2-1100 nm), Índice de refracción (1.86)</td></tr><tr><td>Sonda GCaMP</td><td>Addgene</td><td>G-CaMP3; Plásmido #22692</td><td>Un indicador de calcio codificado genéticamente basado en GCaMP2 de longitud de onda</td></tr><tr><td>única Esfera integradora Ocean Optics</td><td></td><td>FOIS-1</td><td>Se utiliza para la medición precisa de la iluminación de gran angular</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000</td> Los <td>microscopios invertidos permiten la excitación directa de la muestra sin necesidad de penetrar capas de medios y/o tejidos.</td></tr><tr><td>Mitotracker Green FM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Etiquetas mitocondrias</td></tr><tr><td>Lámpara de calibración trazable al NIST</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>Una lámpara con un espectro conocido para su uso como fluoresceína</td></tr><tr><td>trazable al NIST</td><td>estándar ThermoFisher Scientific</td><td>F36915</td><td>Para verificar la respuesta espectral adecuada del sistema</td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Etiquetas núcleos celulares</td></tr><tr><td>Objetivo (10X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 10X/0.45 &infin;/0.17 MRD00105</td><td>Útil para grandes campos de visión</td></tr><tr><td>Objetivo (20X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75 &infin;/0.17 MRD00205</td><td>Más utilizado para muestras de tejido</td></tr><tr><td>Objetivo (60X)</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>Se utiliza con mayor frecuencia para muestras de células</td></tr><tr><td>sCMOS Camera</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B (Rev A8-062802018)</td><td>Para adquirir imágenes digitales de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Espectrómetro</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>Se utiliza para medir la salida espectral del sistema espectral de excitación-barrido</td></tr><tr><td>Cambiador de filtro sintonizable</td><td>Instrumento Sutter Lambda</td><td>VF-5</td><td>Unidad motorizada para el ajuste automatizado del filtro de excitación/ </td></tr><tr><td>Lámpara de arco de xenón</td> de conmutación <td>Sunoptic Technologies</td><td>Titan 300HP Fuente</td><td>de luz Fuente de luz con salida espectral relativamente uniforme</td></tr></tbody></table>

microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Varias técnicas se basan en la detección de señales de fluorescencia para identificar o estudiar fenómenos o para dilucidar funciones. La separación de estas señales de fluorescencia se demostró engorrosa hasta el advenimiento de imágenes hiperespectrales, en las que las fuentes de fluorescencia pueden separarse entre sí, así como de las señales de fondo y la autofluorescencia (dado el conocimiento de su firmas). Sin embargo, las imágenes hiperespectrales tradicionales de escaneo de emisiones sufren de tiempos de adquisición lentos y bajas relaciones señal-ruido debido al filtrado necesario de excitación y luz de emisión. Se ha demostrado anteriormente que las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación reducen el tiempo de adquisición necesario y al mismo tiempo aumentan la relación señal-ruido de los datos adquiridos. Utilizando equipos disponibles comercialmente, este protocolo describe cómo ensamblar, calibrar y utilizar un sistema de microscopía de imágenes hiperespectrales de escaneo de excitación para la separación de señales de varias fuentes de fluorescencia en una sola muestra. Si bien es muy aplicable a las imágenes microscópicas de células y tejidos, esta técnica también puede ser útil para cualquier tipo de experimento que utilice fluorescencia en la que es posible variar las longitudes de onda de excitación, incluyendo pero no limitado a: imágenes químicas, aplicaciones ambientales, el cuidado de los ojos, la ciencia de los alimentos, la ciencia forense, la ciencia médica y la mineralogía.

Varios pasos importantes de este protocolo son necesarios para garantizar la recopilación de datos que son precisos y carentes de imágenes y artefactos espectrales. Omitir estos pasos puede dar lugar a datos que parezcan significativos pero que no puedan ser verificados o reproducidos con cualquier otro sistema de imágenes espectrales, anulando así efectivamente cualquier conclusión hecha con dichos datos. El principal de estos pasos importantes es la corrección de salida espectral adecua...

Las imágenes espectrales se han convertido en una solución fiable para la identificación y separación de múltiples señales de fluorescencia en una sola muestra y pueden distinguir fácilmente las señales de interés del fondo o la autofluorescencia. Las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación mejoran esta técnica al reducir el tiempo de adquisición de imagen necesario y, al mismo tiempo, aumentar la relación señal-ruido.

Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Este protocolo es significativo, ya que describe un método que se puede utilizar para separar varias señales fluorescentes en una sola muestra. En comparación con los métodos tradicionales, excitación-escaneo puede aumentar la velocidad del experimento y mejorar la sensibilidad de los datos. Mediante el uso de diferentes fuentes de iluminación, como un láser supercontinuum, este método puede ser aplicable a los sistemas de microscopio confocal de escaneo láser o disco giratorio.Al realizar escaneos de excitación, microscopía de imágenes espectrales, es importante comprobar que el pico de excitación de cada etiqueta fluorescente se produce a una longitud de onda diferente. Para empezar, configure un microscopio de fluorescencia invertido y una cámara como se describe en el protocolo de texto. A continuación, cargue la muestra en el escenario.En el menú desplegable de la ventana principal del microrómetro, seleccione 475 nanómetros para la visualización inicial de la muestra. A continuación, haga doble clic en el cuadro situado junto a la exposición e introduzca 100 para establecer el tiempo de exposición en 100 milisegundos. Por último, haga clic en live para ver el ejemplo.Ahora haga clic en Automático. El botón de rango de visualización de intensidad automática para llevar los valores mínimo y máximo a rangos visuales significativos. A continuación, utilice las perillas de enfoque del microscopio para enfocar la muestra.Una vez en foco, ajuste la posición de la muestra para que su borde esté en el centro del campo de visión. A continuación, ajuste el enfoque. La muestra está enfocada cuando las entidades de borde de la imagen aparecen nítidas.Ahora, abra la herramienta de adquisición multidimensional. En el menú, haga clic en el botón de carga y elija un ajuste preestablecido que contenga un rango de longitud de onda adecuado para la adquisición espectral. Una vez confirmada la configuración de adquisición, desplácese a una región en blanco de la muestra y haga clic en adquirir para recopilar una pila de imágenes espectrales que contenga el fondo y el ruido que se usará para restar más adelante.A continuación, desplácese por la muestra para encontrar las regiones más brillantes. Es probable que las muestras tengan fluorescencia más intensa lejos del borde de la muestra. Una vez que se encuentra la región más brillante, tome una sola pila de imágenes.Cargue la imagen adquirida en la imagen J y utilice la función de medición de la imagen J para confirmar que ninguna longitud de onda contiene píxeles sobreexpuestas. Si es necesario reducir el tiempo de exposición debido a la sobreexposición, la imagen de fondo también debe retomarse con un nuevo tiempo de exposición. Si se encontró que alguna de las imágenes contiene el límite de detección ascendente de la cámara, ajuste el tiempo de exposición del escaneo espectral para asegurarse de que la señal máxima en todo el rango espectral no exceda el rango dinámico de la cámara.Con un tiempo de exposición adecuado ahora determinado, coloque una muestra sin etiquetar en el escenario. Adquiera datos de imagen espectral de la muestra sin etiquetar para determinar si hay autofluoresencia subyacente. A continuación, coloque una muestra de una sola etiqueta en el escenario.Adquiera datos de imagen espectral de cada una de las muestras de una sola etiqueta para utilizarlos como controles espectrales para crear una biblioteca espectral. Realice el escaneo de cada muestra de control utilizando un tiempo de exposición de rango de longitud de onda idéntico y ajustes de la cámara. A continuación, coloque una diapositiva que contenga la muestra experimental en el microscopio.Seleccione un campo de visión que haya etiquetado correctamente las celdas y adquiera los datos de imagen espectral de la muestra utilizando la configuración de adquisición determinada. Corrija las imágenes a una respuesta espectral plana restando el espectro de fondo de la imagen de muestra y multiplicando la imagen por el coeficiente de corrección. Aquí, se utiliza un script MATLAB para procesar rápidamente las imágenes.A continuación, genere la biblioteca espectral. Para obtener mejores resultados, normalice cada miembro final a la banda de longitud de onda de mayor intensidad determinando qué banda de longitud de onda tiene el valor más intenso y dividiendo la medición en cada banda de longitud de onda por ese valor máximo. A continuación, guarde los datos espectrales como un archivo dat.Cuando haya terminado, desmezcla los datos espectrales de la imagen. El paso de desmezcla generará una imagen de abundancia para cada etiqueta fluorescente, donde la abundancia es la cantidad de señal fluorescente relativa en la imagen de la etiqueta prospectiva. A continuación, abra cada imagen no mezclada para inspeccionar visualmente la distribución de componentes puros.Compare la magnitud de la imagen de error con la de las imágenes no mezcladas. Si la magnitud de la imagen de error es similar a las imágenes de abundancia no mezcladas, es posible que las señales de los datos de la imagen espectral no se tenga en cuenta con precisión. Por último, compruebe que no hay estructuras residuales no identificadas comparando la imagen de error con las imágenes no mezcladas.Cuando se realiza correctamente, el proceso de desmezcla espectral permite la separación de una pila de imagen espectral en las respectivas contribuciones de cada etiqueta de fluorescencia. Aquí, un conjunto de imágenes espectrales no mezcladas con imágenes individuales que resaltan la autofluorescencia de células musculares lisas de las vías respiratorias, una sonda GCaMP y una etiqueta mitocondrial. Hay un alto error asociado con las regiones nucleares y perinucleares de las células que indica que los espectros medidos de esas regiones no están bien contabilizados por los espectros de la biblioteca espectral.Los espectros puros recogidos de células etiquetadas que también son autofluorescentes probablemente contaminarán el perfil espectral del componente puro. Aquí, se puede ver la diferencia de desmezcla con espectros puros contaminados con autofluorescencia, en comparación con los espectros puros corregidos después de la resta a escala. La adquisición adecuada de datos es esencial cuando se toman imágenes de muestras sensibles, ya que solo pueden sobrevivir a una sola sesión de imágenes a diferencia del fondo y los controles que se pueden volver a crear imágenes.Asegúrese de que la configuración de hardware y adquisición adecuada esté predeterminada tanto como sea posible. Como siguiente paso, los vídeos creados a partir de datos de lapso de tiempo adquiridos con este sistema se pueden utilizar para rastrear fuentes fluorescentes en ubicaciones discretas a lo largo del tiempo, como la localización de la segunda señal de mensajero. Tenga cuidado al usar fuentes de luz potentes para evitar la exposición a los ojos.Además, asegúrese de usar guantes adecuados al manipular etiquetas biológicas.

excitation-scanning-hyperspectral-imaging-microscopy-to-efficiently

Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Deposición amiloidea es una seña de identidad de distintas enfermedades y afecta a muchos órganos diferentes. Este trabajo describe la aplicación de la fluorescencia oligothiophene conjugado luminiscente tinción en combinación con técnicas de microscopía de fluorescencia. Este método de coloración representa una poderosa herramienta para la detección y exploración de agregados proteicos en ajustes clínicos y científicos.

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para obtener datos de imágenes hiperespectrales luminiscentes y para analizar las características de anisotropía óptica de cristales únicos basados en lantanoide utilizando un sistema de imágenes hiperespectrales.

Imágenes hiperespectrales como herramienta para estudiar la anisotropía óptica en cristales únicos moleculares basados en lantanoia

Este artículo presenta la integración de un módulo de enfoque espectral y un láser de pulso de doble salida, lo que permite obtener imágenes hiperespectrales rápidas de nanopartículas de oro y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas ópticas no lineales multimodales en un microscopio de escaneo láser estándar.

Imágenes biomoleculares de la captación celular de nanopartículas mediante microscopía óptica multimodal no lineal

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Se desarrolló un marco de imágenes hiperespectrales rápidas y multimodales para obtener imágenes de generación de suma de frecuencia vibracional (VSFG) de banda ancha, junto con modalidades de imágenes de generación de segundos armónicos (SHG) de campo claro. Debido a que la frecuencia infrarroja es resonante con las vibraciones moleculares, se revela el conocimiento microscópico estructural y de la morfología mesoscópica de las muestras permitidas por simetría.

Imágenes químicas hiperespectrales no lineales multimodales mediante microscopía de generación de suma de frecuencia vibracional de barrido lineal

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

El blanqueo iterativo espectral extiende la multiplexidad (IBEX) se basa en la técnica IBEX base al agregar bloqueo de heparina para minimizar la unión inespecífica y aprovechar la detección espectral con desmezcla computacional para suprimir la autofluorescencia. Este enfoque acelera la adquisición de imágenes al tiempo que reduce las fuentes de fondo, lo que permite análisis proteómicos espaciales robustos de múltiples rondas y altos parámetros.

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

Un maniquí dinámico multicompartimiento se utiliza para simular alguna biología de interés para estudios metabólicos utilizando agentes de resonancia magnética hiperpolarizados.

El uso de un de varios compartimentos dinámico sola enzima fantasma de Estudios de hiperpolarizados Agentes de Resonancia Magnética

Aprende a separar señales de fluorescencia múltiples mediante microscopía hiperespectral de análisis de excitación. Este método aumenta la velocidad y sensibilidad en sistemas de microscopía confocal.

Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia

Explorar más videos