Establecimiento y caracterización de tres afatinas pulmonares resistentes a Afatinib PC-9 Líneas celulares desarrolladas con dosis crecientes de Afatinib

El estudio de nuevos mecanismos de resistencia adquiridos contribuirá al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces y seguras en pacientes con cáncer resistente al agente oncológico y resecable. Desafortunadamente, los casos en los que la resistencia a los medicamentos no se desarrolló generalmente no se notifican. Este método de aumento de dosis escalonada se considera la técnica más fiable para obtener células de resistencia adquirida.

Para determinar la concentración adecuada de resistencia a afatinib, cultivo de células PC-9 en medio de crecimiento en un plato tratado con cultivo celular de 10 centímetros a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Resuspender las células PC-9 en una cuatro veces-10-a-el-cuatro células por mililitro de concentración media de crecimiento, y sentar las células en 50 microlitros de suspensión celular por pozo en una microplaca de 96 pocóter. Después de una incubación nocturna en la incubadora de cultivo celular, tratar las células con 50 microlitros de solución de afatinib per well, a seis réplicas de las concentraciones indicadas, y después de una incubación de 96 horas en la incubadora de cultivo de sacrificio, añadir 15 microlitros de tinte MTT a cada pocóyo.

Después de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular, añadir 100 microlitros de solución de solubilización/ parada a cada pozo, y devolver la placa a la incubadora durante la noche. A la mañana siguiente, mida la densidad óptica a 570 nanómetros en un lector de microplacas. Para la exposición continua a afatinib, cultivo de células PC-9 en platos P-100 que contienen 10 mililitros de medio de crecimiento hasta que las células alcanzan la subconfluencia.

Transfiera los cultivos subconfluentes en tres nuevos platos P-100 de nueve mililitros de medio de crecimiento por plato de cultivo inicial, y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, agregue 0,1 nanomolares, o 1/10 de la concentración inhibitoria medio máxima de afatinib, a cada conjunto de tres platos de cultivo. Cuando las células tratadas con afatinib se conviertan en subconfluentes, utilice una pipeta de un mililitro para mezclar a fondo los cultivos y transfiera un mililitro de células de cada plato a nueve mililitros de medio de crecimiento fresco en nuevos platos P-100.

Añadir 10%a 20%mayores concentraciones de afatinib a los nuevos cultivos, aumentando la concentración de afatinib mediante una escalada de dosis escalonada cada vez que los cultivos alcancen la subconfluencia durante un período de 10 a 12 meses. Cuando se alcance una concentración de afatinib de un micromolar, realice el ensayo de MTT como se ha demostrado para confirmar que las células han desarrollado resistencia a losfatinib. Para determinar la curva de crecimiento de las líneas celulares, cultivo parental PC-9 y las tres líneas celulares resistentes a afatinib en medio de crecimiento en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.

Resuspender las células de cada cultivo en una célula de cinco veces 10 a la tercera por mililitro de concentración media de crecimiento, y asiento 12 100 microlitro replica de cada población celular por pozo en una microplaca de 96 pocénculos. A continuación, realice el ensayo MTT en los días cero, uno, dos, tres, cinco y siete de la cultura como se ha demostrado, y trazar los resultados utilizando un programa de software de análisis estadístico adecuado. Para identificar alteraciones en el receptor del factor de crecimiento epidérmico, o expresión de ADN genómico EGFR, mediante el análisis inverso de la cadena de la transcriptasa polimerasa, aislar el ADN genómico del cultivo celular de interés utilizando un kit de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Mida la concentración de concentraciones de 25 nanogramos-microlitro del ADN genómico aislado en un espectrofotómetro. A continuación, amplificar 50 nanogramos de ADN genómico utilizando una mezcla maestra verde SYBR, y analizar los resultados utilizando un sistema de detección de reacción en cadena de transcriptasa inversa basada en fluorescencia. Para identificar alteraciones en la expresión del ADN genómico del EGFR mediante la secuenciación, amplifique el ADN genómico utilizando imprimaciones específicas para los exones egFR 19 a 21.

A continuación, purifique los productos de PCR amplificados utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y secuencia los amplicons. Para identificar alteraciones en la expresión de la proteína receptora del factor de crecimiento epidérmico mediante el análisis de manchas occidentales, trate las células con afatinib durante 24 horas. Después de 24 horas, lave los cultivos celulares dos veces con cinco mililitros de PBS helado por cultivo por lavado.

Lyse las células en el tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación, complementado con 1%inhibidor de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa coctel dos y tres durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, recoger los lysates por centrifugación. Utilice el ensayo de ácido bicinchoninic para determinar la concentración proteica de las muestras de izado.

Ajuste las muestras de proteínas a 0,5, o un microgramo por concentración de microlitro, en tampón de muestra 4-X, y hierva las muestras a 96 grados centígrados durante cinco minutos. Para el análisis de manchas occidentales de las muestras, monte placas de vidrio y espaciadores limpiados con etanol, y cargue el molde con un gel de poliacrilamida al 8% con los suplementos experimentales apropiados. Mientras el gel está polimerizando, agregue la solución de gel de apilamiento a un molde adecuado, inserte el peine y permita que el gel de apilamiento se polimerice durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente.

Cuando ambos geles se hayan polimerizado, colóquelos en el aparato de electroforesis y llene el tanque con tampón de funcionamiento. A continuación, cargue un volumen de 20 a 30 microlitros de cada muestra de proteína en cada pozo, y ejecute el gel a 180 voltios. Detener la electroforesis después de aproximadamente 60 minutos, una vez que el frente del tinte sale del gel, y lavar el gel con solución salina tris-buffered, complementado con Tween, durante uno a dos minutos.

Transfiera las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno mediante una hinchazón semisequera durante una y media hora a una corriente constante de 300 miliamperios. Bloquee la membrana con 5% de leche seca sin grasa diluida con solución salina trillada tris más solución de Tween durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, sondee la membrana con los anticuerpos de interés apropiados a cuatro grados Celsius durante la noche.

A la mañana siguiente, lave las membranas con tres lavados de 10 minutos de solución salina fresca tamponada por lavado antes de exponer la membrana al anticuerpo secundario adecuado durante una a una y 1/2 hora a temperatura ambiente. A continuación, lave la membrana cinco veces con solución salina fresca tamponada por lavado y exponga la membrana a una solución mejorada de quimiuminescencia para la visualización de señales utilizando películas. Aquí, se ilustra la disminución observada en la proliferación celular de células PC-9 parentales en respuesta al aumento de las concentraciones de afatinib, lo que confirma que las células PC-9 son sensibles a la exposición a afatinib.

Sin embargo, ninguna de las tres líneas celulares resistentes a afatinib demuestra una supresión de la proliferación celular bajo la exposición a afatinib. Las líneas celulares resistentes a Afatinib presentan curvas de crecimiento significativamente más lentas que las células parentales PC-9. Las células resistentes a Afatinib expresan niveles significativamente más altos de ADN genómico EGFR y expresión de proteína EGFR que las células PC-9 parentales.

La secuenciación de EGFR demuestra que las células PC-9 exhiben 15 eliminaciones de pares base en el exón 19 de EGFR, y el EGFR de tipo salvaje en el exón 20. Sin embargo, las células de línea celular resistentes a Afatinib presentan una amplificación de exón de EGFR de tipo salvaje 19. Las tres células resistentes a Afatinib contienen las mismas 15 deleciones del par base en el exón 19 de EGFR que en las células PC-9, pero se observa una mutación puntual en T790M en EGFR exón 20.

El crecimiento celular puede llegar a ser bastante lento cuando la concentración del inhibidor está cerca del valor IC-50. No hables de cultivo, ya que la célula seguirá proliferando gradualmente. Estas estrategias se desarrollaron para imitar las condiciones en las que los pacientes con cáncer desarrollan resistencia clínicamente relevante para evaluar los mecanismos de resistencia adquiridos y desarrollar estrategias terapéuticas seguras y eficaces.