Name: Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprende a modelar el cáncer de mama mediante inyección intraductal de adenovirus Cre en glándulas mamarias de ratón. Este método permite la manipulación específica de eventos oncogénicos sin necesidad de cruces extensos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención R01 CA222560 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y por el Premio Breakthrough del Departamento de Defensa W81XWH-18-1-0037.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Brigham and Women's Hospital.
1. Generación y mantenimiento de ratones floxed
<ol><li>Obtener eliminatoria condicional escamariamente relevante para el cáncer de mama (por ejemplo, Trp53tm1Brn [denominada Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) o líneas de ratón de knock-in condicionales (por ejemplo, Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan) del repositorio the Jackson Laboratory (JAX) o NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Además, para facilitar la persecución de MECs que se someten a recombinación mediada por Cre, también se puede obtener una línea condicional DeX (por ejemplo, Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [denominado R26Y]).</li>
	<li>Criar ratones homocigotos Trp53L/L con ratones reportero sorcigonos R26Y o con ratones homocigotos que lleven los alelos de reportero R26Y y cualquier alelos o alelos de knockout condicionales o knock-in adicionales para diferentes modelos de ratón, para obtener progenie heterocigota F1 masculina y femenina.</li>
	<li>Intercross heterocigoto F1 macho y hembra ratones macho y hembra para obtener ratones hembra compuestos F2 que son homocigotos para cada alelo (como ratones experimentales), así como R26Y-sólo hembras homocigosas (como ratones de control). Ratones Genotipo F2 basados en las imprimaciones PCR y las condiciones de ciclismo enumeradas a continuación, mediante la configuración de dos reacciones pcR estándar de 20 l (utilizando Taq 5X Master Mix) en dos tubos PCR diferentes, uno con las imprimaciones R26Y y el otro con el Trp53L imprimaciones. Use ratones adultos (normalmente alrededor de 2-4 meses de edad) para toda la cría.<ol>
<li>Para R26Y,realice la PCR a 94 oC durante 3 min, luego a 94 oC para 30 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 1 min durante 35 ciclos, seguido de 72 oC durante 3 min, y manteniendo a 14 oC. Utilizar imprimaciones (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG. NOTA: Una sola banda PCR de 250 bp indica un homocigoto R26Y, una sola banda pcR de 500 bp indica un tipo salvaje (WT), y dos bandas de PCR (R26Y: 250 bp, WT: 500 bp) indican un heterocigoto R26Y (Figura1A). Para Trp53L,realice la PCR a 94 oC durante 3 min, luego a 94 oC para 30 s, 60 oC para 30 s y 72 oC durante 1 min durante 35 ciclos, seguido de 72 oC durante 3 min, y manteniendo a 14 oC. Utilizar imprimaciones (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC. NOTA: Una sola banda PCR de 370 bp indica un homocigoto Trp53L/L, una sola banda PCR de 288 bp indica un Trp53+/+ WT, y dos bandas PCR (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) indican un Trp53L /+ heterocigota(Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación preoperatoria
<ol><li>Autoclave todas las herramientas quirúrgicas 1 día antes de la cirugía.</li>
	<li>Preparar el 0,1% de azul bromofenol en solución salina con fosfato (PBS) y almacenarla a 4 oC. Diluir el Ad-Cre que se utilizará para la inyección intraductal en medio DMEM con 0,01 M CaCl2 y azul bromofenol en una proporción de 1:10 (es decir, la mezcla de inyección). NOTA: El Ad-Cre utilizado aquí se obtuvo del Núcleo vectorial viral de la Universidad de Iowa, con un título viral de stock de 1010–1011 pfu/ml.</li>
	<li>Anestesiar al ratón hembra (generación F2 como se describe en el paso 1.2, edad que oscila entre 3 y 4 semanas de edad a adulto) usando una cámara de isoflurano y aplicar pomada para los ojos. Durante el procedimiento, anestesia el ratón continuamente asegurándose de que inhala entre 1% y 2,5% de isoflurano en oxígeno. Compruebe la profundidad de la anestesia al menos cada 15 minutos realizando un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo. Supervise cuidadosamente el ratón para cualquier cambio en la frecuencia respiratoria, ajustando el nivel de isoflurano en consecuencia, si es necesario.</li>
	<li>Inyectar meloxicam como analgesia por vía subcutánea a una dosis de 5 mg/kg, antes del procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Exponer el sitio quirúrgico del pezón mediante la aplicación de varias gotas de crema para la depilación; eliminar la crema excesiva y el cabello suelto con toallas de papel suave. NOTA: Realice este paso en un área separada de donde se va a realizar la cirugía. No se recomienda afeitarse para evitar daños en los pezones. Tenga cuidado para eliminar el agente depilator químico de manera oportuna. Dejar el agente encendido durante demasiado tiempo puede provocar quemaduras químicas en la piel</li>
	<li>Desinfectar el sitio quirúrgico con iodofors primero, seguido de 70% de alcohol, y terminar con una aplicación final de yodoforos exfoliantes. Haga esto en un movimiento circular desde el centro del área de trabajo hacia la periferia usando una esponja de gasa o un aplicador con punta de algodón. Repita el ciclo 3x–4x.</li>
</ol>3. Inyección intraductal
<ol><li>Utilice técnicas asépticas durante todo el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Hacer un sitio de incisión en la piel a una longitud de 1 cm entre los dos cuartos GM inguinales (Figura2). Separe cuidadosamente el colgajo de la piel (con el MG) del peritoneo parietal para visualizar el árbol ducal mamario.</li>
	<li>Sostenga cuidadosamente el pezón con fórceps de Watchmaker y retire el pezón exterior sin cortar ninguna piel cercana, usando una tijera de microdisección.</li>
	<li>Cargue la mezcla de inyección de Ad-Cre de 3 a 5 l en una jeringa de Hamilton de 25 ml con una aguja de cubo metálico de 33 G colocada. Estimar el volumen de la mezcla de inyección en la jeringa en función del tinte azul incluido en la mezcla. NOTA: Utilice un volumen más pequeño (p. ej., 3 l) al inyectar en MM de 3-4 semanas de edad hembras y un volumen mayor (por ejemplo, 10 l) al inyectar en los GM de las hembras lactantes.</li>
	<li>Sujete suavemente el borde de la solapa de la piel con una pinza curvada fina e inyecte lentamente la mezcla de inyección ad-cre en el pezón, mientras tanto monitoreando la propagación del tinte azul en el árbol ducal mamario. Mantenga la tasa de inyección lo más baja posible para evitar daños en el lumen ductal. NOTA: El líquido inyectado (como se ilustra en el tinte azul de bromofenol incluido) que se extiende por todo el árbol ductal sin fugas en el compartimento estroveral indica una inyección intraductal exitosa.</li>
	<li>Retire suavemente la aguja del pezón para evitar cualquier fuga del líquido inyectado.</li>
	<li>Examine el lado distal (es decir, lejos del pezón) de la MG o el área circundante del pezón inyectado. Tenga en cuenta que la hinchazón de tinte azul (es decir, tinte que se difunde en el estroma cercano) indica una inyección de almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección intraductal exitosa.</li>
	<li>Cierre las heridas quirúrgicas (del paso 3.2) en la piel con clips de heridas.</li>
</ol>4. Cuidado postoperatorio
<ol><li>Retire el ratón de la anestesia y colóquelo en una almohadilla de calentamiento dentro de una jaula limpia para su recuperación.</li>
	<li>Administrar meloxicam por vía subcutánea a 5 mg/kg de nuevo, 24 h después de la cirugía.</li>
	<li>Controlar las condiciones generales del animal y buscar signos de infección en el lugar de la incisión durante 5 días.</li>
	<li>Los clips de la herida se retiran de 7 a 10 días después de la cirugía.</li>
</ol>5. Seguimiento del desarrollo del tumor mamario
<ol><li>Supervise a los ratones inyectados dos veces por semana por palpación para detectar cualquier signo de desarrollo del tumor mamario.</li>
	<li>Una vez que el tumor es palpable, monitoree el ratón diariamente y mida el tamaño del tumor hasta que llegue a la variable experimental, según lo determine el tamaño (por ejemplo, alcanzando entre el 10% y el 15% del peso corporal del ratón) o la condición (por ejemplo, ulcerosa o necrótica) del tumor, o por el salud general del ratón (p. ej., comatosa, moribundo).</li>
	<li>Eutanasia del ratón por asfixia por dióxido de carbono, seguido de un método secundario (por ejemplo, luxación cervical).</li>
	<li>Aísle los tejidos tumorales mamarios y analícelos mediante citometría de flujo, inmunofluorescencia o perfilado de expresión (por ejemplo, mediante secuenciación de ARN [RNAseq] o microarray), como se describió anteriormente12.</li>
	<li>Realizar análisis citométricos de flujo mediante un análisis para las células negativas del linaje (Lin-: negativo para los marcadores de linaje CD45 [marcador de leucocitos], CD31 [marcador de células endoteliales] y TER119 [marcador de eritrocitos]), y analizar las células del tumor en función de su expresión de YFP, CD24 y CD29.</li>
</ol>

<ol><li>Wagner, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).</li>
<li>Selbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+BLG-Cre+mediated+gene+deletion+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland.</a> Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).</li>
<li>van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX1%2C+a+transcription+factor+mutated+in+breast+cancer%2C+controls+the+fate+of+ER-positive+mammary+luminal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells.</a> eLife. 3, e03881(2014).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Long-Lived+Luminal+Subpopulation+Enriched+with+Alveolar+Progenitors+Serves+as+Cellular+Origin+of+Heterogeneous+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors.</a> Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mutation+of+Brca1+in+mammary+epithelial+cells+results+in+blunted+ductal+morphogenesis+and+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation.</a> Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV6-NTRK3+fusion+oncogene+initiates+breast+cancer+from+committed+mammary+progenitors+via+activation+of+AP1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex.</a> Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+loss+of+BRCA1+and+p53+in+mice+induces+mammary+tumors+with+features+of+human+BRCA1-mutated+basal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+multipotency+by+oncogenic+PIK3CA+induces+breast+tumour+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity.</a> Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).</li>
<li>Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+p53+loss+in+mouse+luminal+cells+causes+clonal+expansion+and+development+of+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours.</a> Nature Communications. 8, 14431(2017).</li>
<li>Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+of+Mammary+Epithelial+Cells+Using+Cell-Type-Specific+Cre-Expressing+Adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses.</a> Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>The Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+21+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The life history of 21 breast cancers.</a> Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).</li>
<li>Abba, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Portrait+of+High-Grade+Ductal+Carcinoma+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ.</a> Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El éxito de este enfoque para inducir tumores mamarios de diferentes subpoblaciones de MEC se basa no sólo en la elección de promotores específicos de tipo celular apropiados (para impulsar la expresión De) sino también en el propio procedimiento de inyección intraductal. La idea detrás de este enfoque es que los virus Ad-Cre inyectados se retienen en el árbol ductal, que es una estructura oculta con lumen, y por lo tanto, sólo los MEC están expuestos a los virus y están infectados por Ad-Cre. Debido al espacio de lumen ...

El objetivo general de este método es desarrollar un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en una inyección intraductal de Ad-Cre en el ratón MG. El enfoque genético basado en la recombinación Cre/loxP se ha utilizado ampliamente para modelar el cáncer de mama humano en ratones. La primera generación de modelos de ratón de cáncer de mama basados en Cre/loxP se generan mediante el uso de ratones transgénicos Con confirmación de Cre bajo el control de promotores específicos de MEC (por ejemplo, MMTV-Cre para MECs luminales y una parte de MECs basales, Wap-Cre y Blg-Cre para progenitores luminales y MECs luminales alveolales, K14-Cre para basal y una porción de MECs luminales1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. Sin embargo, si bien estas líneas transgénicas Cre permiten el control espacial de la expresión Cre (es decir, en diferentes subconjuntos de MEC), no permiten el control temporal de la expresión Cre y la manipulación genética mediada por Cre/loxP. La segunda generación de modelos de ratón de cáncer de mama basados en Cre/loxP utilizan enfoques inducibles de actividad/expresión de Cre (por ejemplo, el uso de fusión de receptores Cre-estrógeno [CreER], que sólo puede inducir la recombinación de Cre/loxP tras la administración de tamoxifeno), y como resultado, estas herramientas genéticas permiten controles espaciales y temporales de la activación de eventos oncogénicos en MEC (por ejemplo, modelos basados en K8-CreER- y K5-CreER)10,11,12 . En ambas generaciones de modelos de ratones con cáncer de mama, como promotores utilizados para impulsar la expresión Cre o CreER (por ejemplo, Krt8, Krt5) también pueden estar activos en células epiteliales de otros órganos (es decir, son específicos del tipo celular pero no específicos del órgano) o tienen una expresión de fuga en tipos celulares distintos de las células epiteliales (por ejemplo, MMTV, que tiene actividad con fugas en las células hematopoyéticas de la médula ósea), estos enfoques pueden conducir al desarrollo de cáncer(es) no deseado(s) en otros órganos. Si estos cánceres inesperados causan letalidad en los ratones afectados, el propósito original de modelar el cáncer de mama en estos ratones puede estar prohibido (por ejemplo, eventos oncogénicos impulsados por MMTV-Crepueden conducir a neoplasias malignas hematopoyéticas y muerte temprana de los ratones , debido a la fuga del promotor mmTV en células hematopoyéticas)4.
Aquí informamos de un enfoque de modelado de cáncer de mama en ratones que permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente. Este enfoque se basa en una inyección intraductal de Ad-Cre en los MG de ratón (y es, por lo tanto, específico del órgano). La expresión Cre se puede controlar utilizando diferentes promotores específicos de subpoblación MEC incrustados en el vector adenoviral (por ejemplo, Krt8 para MECs luminales, Krt5 para MECbasals, logrando así la especificidad de tipo celular). La inducción del cáncer en MG se puede controlar temporalmente mediante una inyección de Ad-Cre en ratones a diferentes edades, desde los 3-4 semanas de edad (pubertad) hasta la etapa adulta.

<table><tbody><tr><td>Aguja de calibre 33</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>estilo de punta 3 romo</td></tr> 7mm <tr><td>Reflex Clip</td><td>Braintree Scientific</td><td>RF7 CS</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K5-Cre</td><td>Universidad de Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus, Ad-K8-Cre</td><td>Universidad de Iowa Viral Vector Core</td><td>Ad5mK8-nlsCre</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Fisher</td><td>HC800-1GAL</td><td>Preparado para el 70% en uso</td></tr><tr><td>CD31 biotinilado</td><td>eBiosciences</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45 biotinilado</td><td>eBiosciences</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado TER119</td><td>eBiosciences</td><td>13-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CD24-AF-700</td><td>BD Pharmingen</td><td>564237</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0242-83</td><td></td></tr><tr><td>CD29-APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>CD29-PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0291-82</td><td></td></tr><tr><td>Loción Depiladora</td><td>Nair</td><td></td><td>9 Oz</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton Hamilton</td><td></td><td>7636-01</td><td>0.025 mL</td></tr><tr><td>Yodoforos</td><td>Betadine</td><td></td><td>10% Povidona yodada</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>1-2.5%</td></tr><tr><td>Loxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Pomada Lubricante para los Ojos</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección Pinzas</td> de relojero <td>Pentair</td><td>9M</td><td>Pinzas</td>de</tr><tr><td>microdisección</td><td>Dumont</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Taq 5X Master Mix Nueva</td><td>Inglaterra Biolabs</td><td>M0285L</td><td></td></tr></tbody></table>

modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de adenovirus c-expreso en la glándula mamaria del ratón

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea, posiblemente debido a interacciones complejas entre diferentes células de origen y eventos oncogénicos. Los modelos de ratón son fundamentales para obtener información sobre estos procesos complejos. Aunque muchos modelos de ratón se han desarrollado para estudiar las contribuciones de varios eventos oncogénicos y células de origen a la tumorigenesis de mama, estos modelos a menudo no son de tipo celular u órgano específico o no pueden inducir el inicio de la tumorigenesis mamaria en un temporalmente controlado. Aquí describimos un protocolo para generar un nuevo tipo de modelos de ratón de cáncer de mama basados en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing (Ad-Cre) en glándulas mamarias de ratón (GM). Debido a la inyección directa de Ad-Cre en los conductos mamarios, este enfoque es específico de MG, sin ninguna inducción de cáncer no deseado en otros órganos. El procedimiento de inyección intraductal se puede realizar en ratones en diferentes etapas de su desarrollo MG (por lo tanto, permite el control temporal de la inducción del cáncer, a partir de las 3-4 semanas de edad). La especificidad del tipo de célula se puede lograr mediante el uso de diferentes promotores específicos del tipo de celda para impulsar la expresión Cre en el vector adenoviral. Mostramos que las células epiteliales mamarias luminales y basales (MEC) pueden estar estrechamente dirigidas a la manipulación genética basada en Cre/loxP a través de una inyección intraductal de Ad-Cre bajo el control del promotor de queratina 8 o queratina 5, respectivamente. Al incorporar un reportero Condicional de Cre (por ejemplo, reportero Rosa26-YFP inducible cre/loxP), mostramos que los MEC atacados por Ad-Cre, y las células tumorales derivadas de ellos, se pueden rastrear siguiendo las células positivas del reportero después de la inyección intraductal.

Los resultados representativos del genotipado de PCR para los alelos R26Y y Trp53L se muestran en la Figura1.
Aunque, en principio, los 10 MG pueden someterse al procedimiento de inyección intraductal, prácticamente, los dos cuartos GM inguinales se seleccionan típicamente para inyección, debido a su accesibilidad más fácil y tamaños mg más grandes (Figura<strong class=...

El objetivo de este protocolo es describir un nuevo enfoque de modelado de cáncer de mama basado en la inyección intraductal de adenovirus Cre-expressing en las glándulas mamarias del ratón. Este enfoque permite la manipulación específica del tipo de célula y del órgano de los eventos oncogénicos de una manera controlada temporalmente.

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Este protocolo ayudará a los investigadores a generar un nuevo tipo de modelo de ratón para recapitular el desarrollo del cáncer de mama humano a partir de diferentes subconjuntos de células epiteliales mamarias. Esta técnica permite a los investigadores generar modelos de ratón de cáncer de mama en el tejido del escenario del desarrollo de una manera específica de tipo celular y sin necesidad de una extensa cría de ratón. Para comenzar este procedimiento, genere, mantenga y anesthetice ratones con floxed como se describe en el protocolo de texto.Lleve el ratón a un área separada de donde se va a realizar la cirugía. Después de confirmar la anestesia mediante la realización de un pellizco de los dedos, inyecte Meloxicam como analgesia por vía subcutánea a una dosis de cinco miligramos por kilogramo para prepararse para el procedimiento quirúrgico. Exponga el sitio quirúrgico del pezón aplicando varias gotas de crema de depilación.Retire la crema excesiva y el cabello suelto con toallas de papel suaves. No se recomienda afeitarse para evitar daños en los pezones. Desinfectar el sitio quirúrgico con yodoforos primero seguido de 70%alcohol y terminar con una aplicación final de yodofo

modeling-breast-cancer-via-an-intraductal-injection-cre-expressing

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este artículo discutimos cómo establecer un modelo de cáncer de mama en ratones hembra inyectando células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria. En el protocolo de ejemplo se muestra la inyección ortotópica.

Inyección ortotópica en la almohadilla de grasa mamaria: establecimiento del cáncer de mama en ratones

Este vídeo describe una técnica de inyección intraductal en la que administramos mezcla inyectable en los conductos de las glándulas mamarias de ratón.

Inyección intraductal: administración de la mezcla inyectable en los conductos de la glándula mamaria del ratón

Un protocolo para la entrega intraductal no invasiva de los reactivos acuosos para la glándula mamaria de ratón se describe. El método se aprovecha de la inyección localizada en los pezones de las glándulas mamarias dirigidos específicamente conductos mamarios. Esta técnica es adaptable para una variedad de compuestos que incluyen ARNsi, agentes quimioterapéuticos y moléculas pequeñas.

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

La activación de mutaciones latentes con adenovirus Cre en los resultados del sistema ductal de mama en un cáncer de mama metastásico clínicamente relevante. La incorporación de un promotor YFP permite el seguimiento de las células tumorales metastásicas distales. Este modelo es útil para estudiar la metástasis latentes, la inmunidad anti-tumoral, y para el diseño de nuevas inmunoterapias para tratar el cáncer de mama.

Inicio de la metástasis de carcinoma de mama mediante la Focalización del epitelio ductal con adenovirus Cre: Un modelo de ratón transgénico de Novela del Cáncer de Mama

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Aquí, presentamos un protocolo para implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos forma invasiva y fácil de manejar, y este modelo Murino ortotópico mama cáncer con un entorno de almohadilla de grasa mamaria adecuada puede utilizarse para investigar diversos aspectos de la cáncer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Se describe un método de inyección intraductal de reactivos para una solución ablativa a base de etanol al árbol ductal mamario de ratón para imágenes in vivo y prevención del cáncer de mama. La inyección directamente en la abertura del pezón permite dirigirse a las células epiteliales mamarias con un daño mínimo en el tejido colateral.

Administración intraductal y visualización por rayos X de la solución ablativa a base de etanol para la prevención y el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de ratón

Se describe un procedimiento para la administración de una solución ablativa química al árbol ductal mamario de rata para el tratamiento preventivo guiado por imágenes del cáncer de mama. Las células epiteliales mamarias pueden ser atacadas con un daño tisular colateral mínimo a través de la canulación directamente en la abertura del pezón y la infusión intraductal de una solución ablativa a base de etanol al 70%.

Visualización de rayos X del tratamiento ablativo intraductal a base de etanol para la prevención del cáncer de mama en modelos de rata

El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.

In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

Aprende a modelar el cáncer de mama mediante inyección intraductal de adenovirus Cre en glándulas mamarias de ratón. Este método permite la manipulación específica de eventos oncogénicos sin necesidad de cruces extensos.

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

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