Un método de extracción multiómica para el análisis en profundidad de cultivos sincronizados del verde Alga Chlamydomonas reinhardtii

Los estudios de todo el sistema son cruciales para la comprensión en profundidad de las funciones biológicas. Sin embargo, se requieren varias muestras independientes para diferentes plataformas de ómica, introduciendo una gran cantidad de variabilidad en los datos. Este método ofrece una estrategia robusta y de alto rendimiento para la extracción simultánea de clorofila, lípidos, metabolitos, proteínas y almidón de una sola muestra del modelo de alga verde, Chlamydomonas reinhardtii.

Para la extracción de clorofila, lípidos y metabolitos, organizar los tubos de gránulos celulares de Chlamydomonas cosechados en nitrógeno líquido. Resuspender el pellet en cada tubo con un mililitro de 20 grados tampón de extracción uno. Para evitar la evaporación del tampón de extracción de baja viscosidad, vórtice rápidamente los tubos hasta que las células estén bien homogeneizadas dentro de la mezcla de extracción y aliquot la solución en dos tubos de microcentrífuga de mililitro.

Sonicar las culturas en un baño de sonicación en agua helada durante 10 minutos antes de la incubación en un agitador orbital a 1.000 rotaciones por minuto durante 60 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, añadir 650 microlitros de tampón de extracción dos y vórtice brevemente las muestras antes de la centrifugación. Para alícuotar las fracciones, transfiera 500 microlitros de la fase lipídica MTBE superior a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros.

Utilice una pipeta de 200 microlitros para eliminar la fase lipídica y transferir 650 microlitros de la fase inferior de metabolito polar y semipolar a nuevos tubos etiquetados. Aspirar el exceso de volumen para eliminar la fase inferior restante y congelar los pellets sólidos en nitrógeno líquido para un almacenamiento de 80 grados. Para la determinación de metabolitos polares, resuspender el pellet seco de la fase polar en solución de piridina de clorhidrato de metoxiamina para metoximación de los grupos de carbonilo y calentar las muestras a 30 grados celsius durante 90 minutos.

Al final de la incubación, derivar las muestras con n-metil-n-trifluoracetamida durante 30 minutos a 37 grados Celsius de acuerdo con los protocolos estándar. Utilice cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas en el tiempo de vuelo para analizar los metabolitos primarios. Para la determinación de metabolitos no polares, resuspender el pellet seco de la fase no polar en una mezcla de siete a tres volúmenes de acetonitrilo a isopropanol y sedimentar los pellets por centrifugación.

A continuación, separe las muestras en una columna C8 de fase inversa en un sistema de cromatografía líquida de ultraperforma. Para la determinación del contenido de clorofila, mezcle 100 microlitros de la fase MTBE con 900 microlitros de 90% metanol para el método en blanco, así como las muestras experimentales. A continuación, mida la absorbancia en un espectrofotómetro a 655 y 652 longitudes de onda de nanómetro para distinguir entre la clorofila a y la clorofila b y calcule el contenido de clorofila a y b y el contenido total de clorofila.

Para la extracción de proteínas, disolver el pellet de fase inferior en 200 microlitros de tampón proteico e incubar la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, centrifuga la muestra y transfiera el sobrenadante que contiene proteínas a un tubo nuevo. Mida la concentración de proteínas utilizando el ensayo Bradford.

Para digerir la proteína, reduzca 15 microgramos de la muestra en cinco ditiothreitol mili evolucionadores durante 30 minutos, seguido de alquilación con 10 yodoacetamida milimétrica durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la alquilación, mezcle la solución de Trypsin/Lys-C en una proporción de proteína a proteasa de 25 a una e incubar la muestra durante tres horas a 37 grados centígrados. Diluir la muestra seis veces en 50 tris mililitros Hcl para una incubación nocturna a 37 grados centígrados.

A la mañana siguiente, terminar la digestión con ácido trifluoroacético a una concentración final de 0.5 a 1%Después de la digestión, concentrar las muestras a cerca de la sequedad, dejando de dos a cinco microlitros de solución en un concentrador de vacío sin calentamiento. Resuspender la muestra en el búfer de carga. Analizar las mezclas de péptidos mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución conectado a un sistema de cromatografía líquida de nano ultra presión.

Para separar los péptidos, cargue cuatro microlitros de muestra en una columna híbrida de superficie cargada en fase inversa de 20 centímetros con un diámetro interno de 75 micrómetros y un tamaño de partícula de 1,7 micrómetros. Utilice la configuración sin conexión de bucle parcial con un degradado isocrático establecido en el 3% del búfer B, mantenido durante 14 minutos antes de que el bucle se desplace a la posición en línea con la columna, después de lo cual el degradado se incrementará linealmente durante 50 minutos hasta que se alcance el 20% de búfer B. Se puede observar un cambio en el volumen de la celda a medida que las células crecen en tamaño a lo largo de la fase de luz, seguido de la liberación de células hijas a partir del final de la fase de luz a partir de 10 horas.

Una vez que todas las células hijas han sido liberadas, se puede observar un cambio en el volumen de la célula, ya que las células hijas recién liberadas se eliminan para comenzar el siguiente ciclo. Basándose en el análisis de espectrometría de masas de cromatografía de gases de la fracción polar, en este experimento representativo, se anotaron 65 metabolitos. El análisis de espectrometría de masas de cromatografía líquida de la fase neutra que contiene lípidos condujo a la identificación de 204 especies lipídicas distintas que cubren varias clases de lípidos.

El análisis de componentes principales se puede utilizar para visualizar los cambios globales en los metabolitos y lípidos a lo largo del ciclo celular con una separación de las fases clara y oscura, así como las fases semicíclicas observadas tanto para los datos metabolómicos como los lipidómicos. Aquí, se muestra una visión general del enriquecimiento funcional de 2.463 proteínas enriquecidas identificadas. El pellet restante después de la extracción de proteína se puede utilizar para la cuantificación reproducible del almidón, como lo indica la baja desviación estándar entre varias réplicas.

Es importante evitar el secado de la fase orgánica de clorofila superior, ya que esto puede influir en los niveles de clorofila en el disolvente, afectando el factor de normalización de las muestras. Se pueden implementar varios procedimientos analíticos para la caracterización bioquímica de las especies moleculares extraídas.