Name: Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende a extraer metabolitos acuosos de células adherentes para análisis metabolómicos mediante electroforesis capilar-espectrometría de masas. Este protocolo optimizado facilita la investigación del cáncer y otras líneas celulares.

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Agradecemos a todos los miembros del centro regional de promoción de la industria Shonai por su ayuda. Este trabajo fue apoyado en parte por los fondos de investigación de la Prefectura de Yamagata y la ciudad de Tsuruoka, por el Fondo Nacional de investigación y desarrollo del centro oncológico [Grant número 28-A-9], y por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI [conceder número 17K07189] a HM.

1. cultivo celular el día 1
Nota: cada muestra para la extracción de metabolitos debe prepararse a partir de un único plato de cultivo de tejido de 100 mm que sea moderadamente pero no completamente confluido (que contiene aproximadamente 2 – 5 millones de células). Calcular el número de platos necesarios para el ensayo y prepararlos en consecuencia.
<ol><li>Cultivo HCC827 y células PC-9 en 5% CO2 a 37 ° c en rpmi-1640 medio complementado con 10% suero bovino fetal (FBS).</li>
	<li>Aspiran los medios de cultivo celular de los platos de cultivo de 100 mm.</li>
	<li>Lave las células de cada plato con 2 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio. Rocía suavemente cada plato para que la solución PBS cubra completamente la superficie del plato.</li>
	<li>Aspiran el tampón de lavado de los platos de cultivo.</li>
	<li>Calentar un 0,25% de solución de tripsina-EDTA a 37 ° c y añadir 2 mL de solución de tripsina-EDTA con una picada serológica de 5 mL. Rocía suavemente cada plato para que la tripsina cubra completamente la superficie del plato.</li>
	<li>Incubar los platos de cultivo a 37 ° c durante aproximadamente 5 min.</li>
	<li>Añadir 4 mL de medio de crecimiento completo pre-calentado por plato. Resuspenda las células en medio, pipeteando suavemente varias veces.</li>
	<li>Transfiera cada suspensión celular a un tubo cónico separado de 15 mL y centrifugue a 800 × g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspend cada pellet de células en 2 mL de medio de crecimiento completo pre-calentado.</li>
	<li>Determinar el número total y la viabilidad porcentual de las células utilizando el contador de células automatizado y 0,4% solución azul tripan.<ol>
<li>Mezclar 10 μL de suspensión celular y 10 μL de solución 0,4% azul tripan.</li>
		<li>Cargue 10 μL de muestra en la cámara de recuento de células deslizando la acción capilar.</li>
		<li>Inserte el deslizamiento de la cámara en el contador de celdas automatizado. La luz transmitida se ilumina automáticamente y el instrumento automático se enfoca en la célula.</li>
		<li>Pulse el botón Capture para capturar la imagen y visualizar los resultados.</li>
		<li>Si es necesario, agregue un medio de crecimiento adicional para obtener la concentración de células deseada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siembra aproximadamente 1 – 2,5 millones de células por plato de cultivo celular de 100 mm. Nota: las concentraciones de metabolito determinadas por el análisis CE-MS se normalizarán en función del número de células viables. A los efectos del conteo de células, es necesario preparar al menos un plato de cultivo adicional para cada grupo.</li>
	<li>Incubar los platos de cultivo en 5% CO2 a 37 ° c durante 18 h.</li>
</ol>2. preparación de los reactivos
<ol><li>Diluir una solución estándar interna comercial incluyendo L-metionina sulfona y d-Camphor-10-sulfonic acid 1000-fold en agua ultrapura. Nota: para menos de 80 muestras, basta con mezclar 50 μL de la solución estándar interna 1 y 45 mL de agua ultrapura en un matraz aforado de 50 mL y, a continuación, llevar la solución hasta 50 mL con agua ultrapura.</li>
	<li>Prepare una solución de manitol 0,05 g/mL en agua ultrapura como tampón de lavado. Nota: para menos de 30 muestras, simplemente disuelva 25 g de manitol en 500 mL de agua ultrapura. Se requieren aproximadamente 15 mL de tampón de lavado por plato de cultivo de 100 mm, así que prepare un volumen suficiente de tampón de lavado según el número de muestras.</li>
</ol>3. pre-lavado de las unidades de filtro centrífugo
<ol><li>Pipetear 250 μL de agua ultrapura en el vaso filtrante de cada unidad filtrante centrífuga (ver tabla de materiales). Nota: se requieren dos unidades de filtro por muestra.</li>
	<li>Tapar las unidades de filtro firmemente y centrifugar a 9.100 × g a 4 ° c durante 5 min.</li>
	<li>Compruebe el volumen de cada filtrado — si se ha acumulado un filtrado significativo durante el primer centrifugado corto, la unidad filtrante puede estar defectuosa. En este caso, deseche la unidad de filtro y utilice en su lugar una nueva unidad de filtro.</li>
	<li>Cierre las tapas de las unidades de filtro firmemente y centrifugue de nuevo a 9.100 × g a 4 ° c durante 30 min.</li>
	<li>Asegúrese de que no quede agua ultrapura en ninguna de las tazas de filtro; retirar el agua ultrapura filtrada en cada tubo de recogida con una picada y desechar. Nota: no intente retirar el agua residual de un vaso filtrante con una pileta, ya que puede dañar el filtro.</li>
	<li>Reemplace las tazas de filtro en sus tubos de recolección. Nota: Utilice las unidades filtrantes centrífugas en el plazo de una hora ya que los filtros pueden dañarse tras el secado.</li>
</ol>4. cultivo celular el día 2
<ol><li>
Sacar los platos de cultivo de 100 mm de la incubadora. Nota: la duración recomendada del cultivo celular es de 18 h.</li>
	<li>Aspiran el medio de cultivo celular de cada plato de cultivo de 100 mm.</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio de cultivo celular que incluya las concentraciones apropiadas de compuestos o fármacos a cada plato, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Nota: para fines demostrativos, añadimos 10 μL de diamida de 250 mM disuelto en PBS (concentración final de 250 μM) en este experimento.</li>
	<li>Incubar los platos de cultivo a 37 ° c durante 30 min en presencia de diamida o PBS como control.</li>
	<li>Aspiran el medio de cultivo celular de cada plato de cultivo de 100 mm.</li>
	<li>Lave las células añadiendo suavemente 2 mL de solución de manitol al borde de cada plato con un 5%, cuidando de no perturbar la capa celular, luego Incline levemente el plato. Nota: PBS o solución salina interfiere con el análisis metabolómico basado en CE-MS y afecta negativamente a los resultados de la medición, y por lo tanto no debe ser utilizado como tampón de lavado.</li>
	<li>Aspire el tampón de lavado de cada plato de cultivo, luego lave las células de nuevo añadiendo suavemente 10 mL de tampón de lavado por plato y inclinando ligeramente el plato.</li>
	<li>Aspire por completo el tampón de lavado desde el borde de cada plato de cultivo. Nota: aspiran tanto como sea posible el tampón de lavado, prestando atención a no aspirar las células. Manitol residual puede interferir con el análisis CE-MS; aspiración de las células disminuirá el número de celdas y así convertirse en una fuente de error en la normalización de datos.</li>
</ol>5. extracción de metabolitos de células cultivadas
<ol><li>Añadir 800 μL de 99,7% de metanol por plato de cultivo. Rocía suavemente cada plato de cultivo de ida y vuelta para cubrir toda su superficie. Dejar los platos a temperatura ambiente durante 30 s.</li>
	<li>Añada lentamente 550 μL de la solución estándar interna diluida por plato sumertiendo la punta de la picada en el metanol y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces.</li>
	<li>Rocía suavemente cada plato de cultivo de ida y vuelta para cubrir toda su superficie.</li>
	<li>Dejar los platos a temperatura ambiente durante 30 s.</li>
</ol>6. ultrafiltración de extractos celulares
<ol><li>Transfiera la solución extraída de cada plato de cultivo a un tubo de microcentrífuga 1,5 mL separado.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 2.300 × g a 4 ° c durante 5 min.</li>
	<li>Transfiera 350 μL de cada sobrenadante en dos unidades filtrantes centrífugas por muestra. Nota: de cada plato de cultivo, se transfiere un total de 700 μL de la solución extraída a dos tubos filtrantes (350 μL/tubo).</li>
	<li>Centrifugar los tubos filtrantes a 9.100 × g a 4 ° c durante aproximadamente 2 h hasta que no quede líquido en las copas del filtro.</li>
	<li>Retire las copas del filtro y cierre bien las tapas de los tubos de recogida.</li>
</ol>7. muestra la evaporación
<ol><li>Prepare un evaporador centrífugo — típicamente, esto consiste en un evaporador, una trampa fría, y una bomba de vacío.</li>
	<li>Coloque los tubos de recolección en el evaporador centrífugo. Nota: deje las tapas de los tubos abiertas.</li>
	<li>Evaporar las soluciones de muestra extraídas en condiciones de vacío a temperatura ambiente. Nota: las configuraciones típicas para el número de rotaciones y la presión son 1.500 rpm y 1.000 PA, respectivamente, y por lo general toma aproximadamente 3 h para evaporar completamente las muestras.</li>
	<li>Confirme que no quede líquido en ninguno de los tubos de recogida y cierre las tapas de los tubos firmemente.</li>
	<li>Almacene los tubos de recolección en un congelador profundo de temperatura ultrabaja (− 80 ° c) hasta el análisis metabolómicos.</li>
</ol>8. análisis metabolómico por CE-MS
<ol><li>Resuspend el filtrado en 50 μL de agua ultrapura inmediatamente antes del análisis CE-MS.</li>
	<li>Realizar análisis CE-MS por métodos descritos anteriormente12,13 utilizando sistema de electroforesis capilar y el sistema de espectrómetro de masa de tiempo de vuelo equipado con una bomba isocrática, un adaptador de CE-MS, y un pulverizador CE-ESI-ms. Nota: ambos sistemas pueden ser controlados por el software de los vendedores del sistema y están conectados por un capilar de sílice fundido (50 μm de diámetro interno × 80 cm de longitud total).<ol>
<li>Configure instrumentos y viales de muestra, prepare el capilar con un cassette capilar, reponga los líquidos de la vaina y los búferes de electroforesis apropiados dependiendo del modo de análisis de aniones o cationes, y luego aplique tensiones. Nota: las condiciones analíticas y de instrumentación se describen detalladamente en otros12,13.</li>
		<li>Abra el software y prepare un pool de trabajo que contenga métodos de adquisición de datos e información de muestra.</li>
		<li>Iniciar una ejecución de prueba y comprobar los datos como la intensidad de la señal y la forma de pico de los estándares internos y la resolución de picos de otros compuestos estándar.</li>
		<li>Ajuste las condiciones analíticas si es necesario.</li>
		<li>Inyectar las soluciones de muestra a 50 mbar durante 3 s y una tensión de 30 kV. Nota: CE-MS se llevó a cabo ya sea en el modo de iones positivo o negativo. Fije el espectrómetro para escanear el rango de masa m/z 50 – 1000. La tensión capilar se estableció en 4 kV; el caudal de gas nitrógeno (temperatura del calentador 300 ° c). Para el modo positivo, el fragmentor, el skimmer y el voltaje OCT RFV se configuraron en 75, 50 y 125 V, respectivamente. Para el modo de iones negativos, el fragmentor, el skimmer y el voltaje OCT RFV se configuraron en 100, 50 y 200 V, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analice los datos del espectro.<ol>
<li>Extraiga los picos de los datos espectrales de masas utilizando el software de integración automática para obtener información de picos incluyendo m/z, área de pico y tiempo de migración (MT). Nota: el método se describe detalladamente en otro lugar14.</li>
		<li>Excluir picos de señal correspondientes a isotopomers, iones aductos y otros iones de producto de metabolitos conocidos.</li>
		<li>Anote los picos restantes con información de la base de datos del metabolito HMT según los valores m/z y mts.</li>
		<li>Normalizar las áreas de los picos anotados a niveles estándar internos y números de celdas por muestra.</li>
		<li>Evaluar la concentración de cada metabolito en las células cultivadas (pmol/106 células) utilizando curvas estándar preparadas para cada metabolito.</li>
		<li>Utilice las concentraciones de metabolito cuantificados para análisis estadísticos posteriores e interpretaciones biológicas14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
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<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Characterization+of+Antifolate+Responsiveness+and+Non-responsiveness+in+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).</li>
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<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos una metodología ampliamente accesible para preparar metabolitos de células cancerosas cultivadas para el análisis metabolómico basado en CE-MS. Uno de los puntos más críticos en este protocolo es la preparación adecuada de las células cancerosas, porque las concentraciones de metabolito medidos se normalizan al número de células viables. Para la estimación precisa del número de célula, es necesario preparar al menos un plato de cultivo adicional por grupo experimental para contar el número de células viables en paralelo con la extracción de metabolitos para el análisis metablomico. Además, el mismo número de células debe ser sembrada en cada plato para las réplicas y en el plato para el conteo; en el futuro, esto sería ayudado por un rápido y libre de estrés (por ejemplo, libre de tripsina) protocolo de conteo de células que permite que el mismo plato que se utilizará para el conteo de células viables y extraer metabolitos. Se debe tener cuidado durante los lavados para que las células no se separen de la superficie de los platos. Las pruebas de citotoxicidad severa y otros experimentos que reducen la adherencia de las células pueden ser inadecuados para este protocolo de extracción debido a la pérdida potencial de células durante el procedimiento de lavado.
Es importante utilizar una solución de manitol al 5% como tampón de lavado para extraer metabolitos de células cultivadas para el análisis metabolómico basado en CE-MS, porque los tampones a base de sal, como el PBS, interfieren con el análisis metabolómico y afectan negativamente a la medición.
Dos o tres platos se pueden combinar como una sola muestra mediante la extracción individual de metabolitos de cada plato y luego la agrupación de muestras; sin embargo, la combinación de múltiples platos a menudo aumenta el manitol residual en la solución de metabolito extraído. Esto también puede interferir con el análisis metabolómico por CE-MS. por lo tanto, se recomienda no utilizar varios platos o pozos como una sola muestra.
Este método de análisis metabolómico que utiliza CE-MS se ha desarrollado para la medición exhaustiva de moléculas cargadas con pesos moleculares entre 50 y 1000 da; por lo tanto, este protocolo está optimizado para la extracción de compuestos acuosos, de bajo peso molecular. Por lo tanto, este Protocolo no es adecuado para la extracción de metabolitos hidrófobos como los lípidos o macromoléculas como las proteínas y los ácidos nucleicos. Dado que existe una creciente demanda de análisis lipídicos integrales o lipidómica de muestras de células cultivadas, se necesita el desarrollo de un protocolo fácil y eficaz para la extracción simultánea de metabolitos hidrofílicos e hidrófobos.
El primer paso de extracción del metabolito — medio aspirador y células de lavado con manitol — se debe realizar lo más rápidamente posible para minimizar los cambios en el perfil metabólico de las células. El tratamiento de las células con metanol después del lavado con manitol se asume para desnaturalizar las proteínas y así evitar que las enzimas catalizar otras reacciones metabólicas. Sin embargo, incluso después del tratamiento con metanol, pueden tener lugar reacciones químicas no enzimáticas — como reacciones redox, algunos procesos de descarboxilación y vínculos tioles —. Como tal, cualquier concentración de metabolitos implicada en estas reacciones medidas por este protocolo debe interpretarse con precaución. En contraste con el genoma o transcriptoma, el metaboloma consiste en moléculas con una amplia variedad de propiedades químicas; por lo tanto, ningún protocolo único puede extraer todos los metabolitos sin ninguna pérdida o alteración. Para mediciones más precisas de estos metabolitos altamente reactivos, se debe consultar un protocolo específicamente diseñado para extraer ciertos grupos de metabolitos, que requieren fraccionaciones y derivatizaciones. El protocolo presentado aquí, sin embargo, describe una extracción simple y rápida de metabolitos acuosos de muestras de células cultivadas para el análisis metabolómico por CE-MS. En este documento no pudimos describir cómo configurar CE-MS en detalle porque el enfoque del presente manuscrito es diferente, sin embargo, describir los pasos detallados para configurar CE-MS puede requerir un artículo dedicado separado.

Otto Warburg observó que las células cancerosas adquieren la capacidad inusual de tomar glucosa y fermentar para producir lactato en presencia de oxígeno adecuado, un fenómeno denominado efecto Warburg o glicolysis aeróbica1,2. Los defectos de respiración mitocondrial se especula como la base subyacente para la glicolisis aeróbica en las células cancerosas3. De hecho, el efecto de Warburg es la base para la toma de imágenes del tumor por fluorodeoxiglucosa (FDG)-tomografía por emisión de positrones (PET), que es ampliamente utilizado en la práctica clínica4,5. Una alta tasa de glicolisis aeróbica se considera una característica clave del cáncer y se ha adoptado recientemente como una de las conocidas "señas de identidad del cáncer", según lo descrito por D. HANAHAN y B. Weinberg6. Mutaciones somáticas en oncogenes y genes supresores de tumores, como Hras/KRAS/NRAS, EGFR, BRAF, MYC, TP53, Isocitrato deshidrogenasa (IDH) y fumarato hidratasa (FH ) — se han relacionado con cambios metabólicos específicos en las células cancerosas, que se cree que son el resultado del efecto Warburg7.
El análisis metabérmico es un enfoque prometedor no sólo para entender la regulación metabólica en las células cancerosas, sino también para identificar los biomarcadores de cáncer en estadios tempranos y la predicción de respuesta a la quimioterapia. Tras el tratamiento de células cancerosas sensibles o resistentes con compuestos anticancerígenos, el seguimiento de sus respuestas metabólicas facilita la identificación de biomarcadores metabólicos para predecir la eficacia de terapias específicas contra el cáncer en pacientes con cáncer8 ,9,10,11. En este artículo, las líneas celulares de cáncer derivadas de un adenocarcinoma pulmonar con una mutación EGFR tratada con diamida, que causa estrés oxidativo, se utilizaron como modelos para el análisis metabérmico. La ventaja de este método analítico utilizando electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS) es su medida completa de metabolitos cargados con el rango de masa m/z 50-100012,13. El propósito de este artículo es proporcionar a los novatos un detallado protocolo visual escalonado para la preparación de metabolitos acuosos de células cancerosas cultivadas y posteriores análisis metabolómicos, particularmente por CE-MS.

<table><tbody><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Software de integración automática</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>versión B.02.00</td></tr><tr><td>Sistema CE</td><td>Agilent Technologies Agilent</td><td>7100 Sistema</td><td></td></tr><tr><td>CE Kit adaptador CE/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pulverización CE-ESI-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos para cámara de recuento de células</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Portaobjetos para cámara de recuento de células Countess</td></tr><tr><td>Dispositivo de filtro centrífugo, 5 kDa</td> Human <td>Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno estéril, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico estéril de polipropileno, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Stripette Costar, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Manitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de electroforesis</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3301-1001</td><td>para análisis</td>de</tr><tr><td>cationes Tampón de electroforesis</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3302-1021</td><td>para análisis de aniones</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Punta de filtro, 1000 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S Punta de</td><td></td></tr><tr><td>filtro, 20 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Punta de filtro, 200 &mu; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; M I.D. y Times; 80 cm de longitud total</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>Colección de cultivos tipo americano</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Solución estándar interna</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Bomba isocrática</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent Serie Agilent 1100 Bomba</td><td></td>isocrática</tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, grado LC/MS</td></tr><tr><td>Microtubo, 1,5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Software operativo</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>versión B.03.01 para CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa estéril de cultivo de tejidos, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo</td><td>Agilent Tecnologías</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Solución azul de tripano, 0,4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q agua</td><td>18.2 M&Omega; &#183; cm agua pura</td></tr><tr><td>Matraz aforado, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

El análisis metabolomic es un enfoque de la economía prometedora para no sólo entender la regulación metabólica específica en las células cancerosas en comparación con las células normales, sino también para identificar los biomarcadores para la detección temprana del cáncer y la predicción de la respuesta de la quimioterapia en pacientes con cáncer. La preparación de muestras uniformes para el análisis metabolómicos es una cuestión crítica que queda por abordar. Aquí, presentamos un protocolo fácil y fiable para la extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para el análisis metabolómico utilizando electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS). Los metabolitos acuosos de las células cultivadas se analizan mediante el cultivo y el lavado de células, el tratamiento de células con metanol, la extracción de metabolitos y la eliminación de proteínas y macromoléculas con columnas de centrifugado para el análisis CE-MS. Resultados representativos utilizando líneas celulares de cáncer de pulmón tratadas con diamida, un reactivo oxidativo, ilustran el cambio metabólico claramente observable de las células bajo estrés oxidativo. Este artículo sería especialmente valioso para los estudiantes e investigadores involucrados en la investigación metabolómica, que son nuevos en la cosecha de metabolitos de líneas celulares para el análisis por CE-MS.

Dado que las concentraciones de metabolito en las células cancerosas (pmol/106 células) se normalizan para el número de células viables, se deben establecer condiciones experimentales con cuidado para minimizar la variación en el número de células viables entre las condiciones. Por ejemplo, el tratamiento con diamida estaba en una concentración relativamente alta (250 μm), pero por un corto tiempo para permitir que todas las células crecieran lo más equitativamente posible, igualando así el número de células viables analizadas. Bajo estas condiciones experimentales, las células HCC827 y PC-9 crecieron por igual para 3 h (figura 1). El análisis CE-MS de las células tratadas con diamida en comparación con las células tratadas con PBS (control) reveló metabolitos diferenciales 175 y 150 en las células HCC827 y PC-9, respectivamente. Entre estos, varios intermedios en la vía de fosfato de pentosa (PPP) y en la glicolisis superior fueron significativamente más altos en las condiciones tratadas con diamida en ambas líneas celulares, mientras que unos pocos intermedios de ciclo de Ácido tricarboxílico (TCA) fueron más bajos en el tratamiento condiciones (figura 2 y figura 3).
El PPP genera equivalentes reductoras en forma de nicotinamida reducida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), que se utiliza para el mantenimiento de la la homeostasis redox y la biosíntesis de ácidos grasos15. Después del tratamiento con diamida, el nivel de ácido glucónico — una Glucosa oxidada — aumentó 12 veces en células HCC827 y 10 veces en células PC-9; del mismo modo, después del tratamiento con diamida, el nivel de glucosa 6-fosfato (G6P) — una glucosa fosforilada y el primer producto de glicolysis catalizada por hexoquinasa — también aumentó 6,3-y 3,5-se pliega en células HCC827 y PC-9, respectivamente (figura 4). Además, tras el tratamiento con diamida, los niveles de 6-fosfogluconato (6PG) — el primer intermediario en PPP — aumentaron dramáticamente 89 veces en células HCC827 y 231 veces en células PC-9 en comparación con los niveles observados en los controles de PBS (figura 4). Por el contrario, los niveles de otros intermedios glicolíticos, como la fructosa 6-fosfato (F6P) y la fructosa 1, 6-bisfosfato (F1, 6P), no se modifico en la condición experimental de diamida (figura 4). La nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) los niveles fueron casi equivalentes entre el tratamiento con diamida y las condiciones de control de PBS (figura 4), sugiriendo que la glucosa fue catabolizada principalmente a través del PPP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> Figura 1. Números celulares inalterados al tratamiento con diamida. Las respuestas de crecimiento celular a 250 μm de diamida se midieron usando manchas de color azul tripan. Se muestran los números celulares de (A) HCC827 y (B) células PC-9 tratadas con PBS (azul) o diamida (rojo; 250 μm) para 1 o 3 h. Los datos se muestran como la media ± SD (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> Figura 2. Picos MS representativos de metabolitos. Electropherograms anotado como (A) ácido glucónico, (B) glucosa 6-fosfato (G6P), (C) 6-fosfogluconato (6pg), y (D) nicotinamida ADENINA dinucleótido fosfato (NADP+) obtenida mediante análisis CE-ms. Cada línea indica la línea celular (sólido, HCC827; punteado, PC-9) y el tratamiento (azul, PBS, rojo, diamida) utilizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> Figura 3. Perfiles metabolome de metabolitos intracelulares. Doblar los cambios de metabolitos en (A) HCC827 y (B) las células PC-9 tratadas con diamida se muestran como log2(diamida/PBS). En total, 175 y 150 metabolitos fueron anotados en células HCC827 y PC-9, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> Figura 4. Regulación de PPP sobre el tratamiento con diamida. Se muestran las concentraciones intracelulares (pmol/106 células) de los metabolitos clave implicados en la glicolisis y la vía de fosfato de pentosa (PPP) después del tratamiento con diamida. Los metabolitos se extrajeron de las células HCC827 y PC-9 tratadas con PBS (azul) o diamida (rojo, 250 μm) durante 30 min. metabolitos representativos como ácido glucónico, glucosa 6-fosfato (G6P), fructosa 6-fosfato (F6P), 6 -fosfogluconato (6Pg), y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) se muestran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El propósito de este artículo es describir un protocolo para la extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para el análisis metabolómico, particularmente, electroforesis capilar-espectrometría de masas.

Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

El propósito de este artículo es proporcionar un protocolo visual detallado y escalonado para extraer metabolitos acuosos de células cancerosas cultivadas para el análisis posterior del metaboloma. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad y fiabilidad para extraer metabolitos de células adherentes. Pero sobre todo, está bien optimizado para el análisis de metabolomas utilizando espectrometría de masas de electroforesis capilar o CEMS.La metabolómica es una técnica poderosa para identificar biomarcadores o detectar cáncer en estadio temprano y predecir la respuesta de quimioterapia a los pacientes con cáncer. Usamos células cancerosas en esta demostración. Sin embargo, esta técnica también se puede aplicar para cosechar metabolitos de otras células adherentes como fibroblastos en células iPS.Las concentraciones de metabolitos se normalizan en función del número de células viables. Tan cuidadosa preparación de la cultura, esta es la clave para obtener buenos datos reproducibles. Demostrando el procedimiento estará Ami Maruyama, un técnico de mi laboratorio.Para empezar, placa HCC827 y PC-9 células en platos de 100 milímetros que contienen 10 mililitros de RPMI-1640 medio complementado con 10%fetal suero bovino. Coloque los platos en una incubadora en un 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 24 horas al cultivo. Después de la incubación, incline suavemente los platos de cultivo de 100 milímetros para aspirar los medios de cultivo celular.Lave las células de cada plato con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio. Mece suavemente cada plato para que la solución PBS cubra completamente la superficie del plato, luego incline los platos para aspirar el tampón de lavado. Caliente 0.25%trypsin-EDTA solución a 37 grados Celsius.Con una pipeta serológica de cinco mililitros, agregue dos mililitros de la solución calentada de trippsina-EDTA a cada plato. Mece suavemente cada plato para que la trippsina cubra completamente la superficie del plato. Incubar los platos de cultivo a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos.A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de crecimiento completo precalentó a cada plato. Y pipetear suavemente varias veces para volver a suspender las células en el medio. Transfiera cada suspensión celular a un tubo cónico separado de 15 mililitros.Centrifugar a 800 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet celular en dos mililitros del medio de crecimiento completo precalentado. Mezclar 10 microlitros de la suspensión celular con 10 microlitros de 0,4% de solución azul tripano, en un microtubo de 1,5 mililitros.Cargue 10 microlitros de la mezcla en una cámara de conteo celular deslizarse a través de la acción capilar. Inserte la diapositiva de la cámara en el contador de celdas automatizado y presione el botón de captura para capturar la imagen y mostrar los resultados del número total y el porcentaje de viabilidad de las celdas. Si el número total de células es superior a 0,5 millones de células por mililitro, añada un medio de crecimiento adicional al tubo cónico de 15 mililitros para obtener la concentración celular deseada.Ahora, agregue dos a cinco mililitros del cultivo a cada plato de cultivo celular de 100 milímetros para sembrar aproximadamente una a 2 1/2 millón de células por plato. Incubar los platos de cultivo en 5% dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 18 horas. En primer lugar, en un matraz volumétrico de 15 mililitros, diluir una solución estándar interna comercial que contenga sulfola L-metionina y ácido D-Camphor-10-sulfónico 1.000 veces en agua ultrapura.Disolver el manitol en agua ultrapura para preparar una solución de manitol de 0,05 gramos por mililitro en agua ultrapura como tampón de lavado. A continuación, en la taza de filtro de cada unidad de filtro centrífugo, pipeta 250 microlitros de agua ultrapura. Tapa las unidades de filtro firmemente, y centrifugar a 9, 100 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Compruebe el volumen de cada filtrado. Si se ha acumulado un filtrado significativo durante el primer giro corto, la unidad de filtro puede estar defectuosa. Deseche la unidad de filtro y utilice una nueva unidad de filtro en su lugar.Cierre bien las tapas de las unidades de filtro y centrifugar de nuevo a 9, 100 veces g a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Asegúrese de que no quede agua ultrapura en ninguna de las tazas de filtro y retire el agua ultrapura filtrada en cada tubo de recogida con una pipeta. Vuelva a colocar las tazas de filtro en sus tubos de recogida y utilice las unidades de filtro centrífugos en una hora para evitar daños al secarse.Saque los platos de cultivo de 100 milímetros de la incubadora y aspire el medio de cultivo celular de cada plato. Añadir 10 mililitros de medio de cultivo PBS con o sin 250 diamida micromolar a cada plato, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Incubar los platos de cultivo a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo celular de cada plato de cultivo de 100 milímetros. Incline ligeramente el plato y agregue suavemente dos mililitros de 5% de tampón de lavado de manitol al borde de cada plato para lavar las células, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Aspirar el tampón de lavado de cada plato de cultivo, y lavar las células de nuevo inclinando ligeramente el plato y agregando suavemente 10 mililitros de tampón de lavado por plato.A continuación, aspirar completamente el tampón de lavado desde el borde de cada plato de cultivo. Ahora, agregue 800 microlitros de 99.7% metanol por plato de cultivo, y balancee suavemente cada plato de cultivo de ida y vuelta, para cubrir toda su superficie. Deje los platos a temperatura ambiente durante 30 segundos.Añadir lentamente 550 microlitros de la solución estándar interna diluida por plato sumergiendo la punta de la pipeta en el metanol y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, varias veces. Mece suavemente cada plato de cultivo de un lado a otro para cubrir toda su superficie, y dejar los platos a temperatura ambiente durante 30 segundos. A continuación, transfiera la solución extraída de cada plato de cultivo a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros.Centrifugar los tubos a 2.300 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera 700 microlitros de cada sobrenadante en dos unidades de filtro centrífugo, con 350 microlitros por unidad. Centrifugar los tubos del filtro a 9, 100 veces g a cuatro grados Celsius durante aproximadamente dos horas, hasta que no quede líquido en las tazas del filtro.Retire las tazas del filtro y cierre firmemente las tapas de los tubos de recogida. En este estudio, las células HCC827 y PC-9 crecieron por igual durante tres horas. El análisis CEMS indica la diferencia entre las células tratadas con diamida y las células tratadas con PBS para ambas líneas celulares.Entre ellos, varios intermedios en la vía del fosfato de pentosa y en la glucólisis superior fueron significativamente más altos en las condiciones tratadas con diamida, mientras que unos pocos intermedios de ciclo tricarboxílico fueron menores en las condiciones tratadas. Los perfiles de metabolomo de metabolitos intracelulares revelaron 175 y 150 metabolitos diferenciales en células HCC827 y PC-9, respectivamente. Después del tratamiento con diamida, el nivel de ácido glucónico y glucosa oxidada aumentó 12 veces en las células HCC827 y 10 veces en las células PC-9.Del mismo modo, el nivel de glucosa 6-fosfato, una glucosa fosforilada en el primer producto de glucólisis catalizada por hexoquinasa, también aumentó 6.3-y 3.5-fold en las células HCC827 y PC-9, respectivamente. Además, los niveles de 6-fosfogluconato, el primer intermedio en la vía de fosfato de pentosa, aumentaron dramáticamente 89 veces en las células HCC827 y 231 veces en las células PC-9. Por el contrario, los niveles de otros intermedios glucolíticos como la fructosa 6-fosfato no cambiaron en la condición experimental de diamida.Los niveles totales de fosfato de dinucleótido de nicotinamida adenina fueron casi equivalentes entre el tratamiento con diamida y las condiciones de control de PBS. El uso de la solución de 5%manitol, distinto de PBS, como tampón de lavado para las células de lavado es muy importante para el análisis de CEMS, porque los tampones a base de sal interfieren con el análisis y afectan negativamente a la medición. Este protocolo no es adecuado para la extracción de metabolitos hidrófobos como los lípidos, por lo que necesitamos desarrollar un protocolo para extraer convenientemente metabolitos hidrófilos e hidrófobos para un análisis más completo del metaboloma.Esta técnica realiza una fácil extracción de metabolitos de casi cualquier célula adherente, y por lo tanto, es aplicable para una variedad de investigaciones como cáncer, células madre, farmacología, nutrición, y la ciencia cosmética.

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Investigación

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Cancer Research

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