Name: Aspecto técnico de la síntesis automatizada y evaluación cinética en tiempo real de 11C SNAP-7941 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende la síntesis automatizada de [11C]SNAP-7941 para evaluar cinética de unión en tiempo real mediante PET. Este método mejora el estudio de expresión de receptores en células con y sin P-gp.

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Este trabajo fue apoyado por el Fondo De Ciencia de Austria (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Agradecemos el apoyo técnico de T. Zenz y A. Krcal. Además, agradecemos a K. Pallitsch la preparación del AgOTf y H. Spreitzer por distribuir el precursor.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

La radiosíntesis de [11C]SNAP-7941 se estableció en un módulo de síntesis comercial. Debido a la posibilidad de automatizar completamente el procedimiento de preparación, la radiofensisis se demuestra que es fiable, y se lograron mejoras en la protección contra la radiación del operador. La preparación del sintetizador tiene un enorme impacto en la calidad de la radiosonda, especialmente en términos de actividad molar. Por lo tanto, es esencial trabajar constantemente en condiciones inertes (por ejemplo, atmósfera de helio) y vaciar todas las líneas situadas antes del recipiente de reacción (línea objetivo, ciclo de producción y reactor[11C]CH3I (véase la figura 2)). Además, calentar las trampas y hornos respectivos antes del inicio de la síntesis para eliminar la humedad y el carbono atmosférico aumenta la actividad molar ventajosamente. Especialmente la columna AgOTf, impregnada con carbono grafitizado, es extremadamente sensible a la humedad. Incluso pequeñas cantidades de cualquier fuente de humedad perturban la conversión de [11C]CH3I a [11C]CH3OTf. Antes de iniciar la síntesis, la trampa [11C]CO2 y la trampa [11C]CH3I tienen que enfriarse a temperatura ambiente de nuevo para permitir la captura posterior. Además, se recomienda disolver el precursor poco antes de iniciar la síntesis y añadir la base directamente en la solución precursora.
El control de calidad de las radiosondas de carbono-11 debe diseñarse racionalmente para un flujo de trabajo continuo y rápido. Sin embargo, los parámetros más importantes para los estudios de cultivo celular son la pureza radioquímica y la actividad molar para obtener resultados válidos. La evaluación correcta de la actividad molar requiere un método HPLC analítico robusto y la curva de calibración debe cubrir el rango de concentración del producto final. La parte difícil para los radiosondas es lograr una concentración por encima del límite de cuantificación (LOQ) debido a pequeñas cantidades, que se producen durante la radiosíntesis. Por lo tanto, el arte es encontrar el equilibrio entre las actividades molares altas para evitar la saturación del receptor y las concentraciones lo suficientemente altas como para seguir siendo capaz de cuantificar la señal no radioactiva.
[11C] Snap-7941 se confirmó que era un sustrato potente del transportador P-gp humano, ya que no se observó acumulación en las células MDCKII-hMDR1 no tratadas o tratadas por vehículodebido de un flujo rápido. Por el contrario, las configuraciones experimentales (células MDCKII-WT o MDCKII-hMDR1 prebloqueadas) proporcionaron resultados similares (acumulación de [11C]SNAP-7941), apoyando la versatilidad de este ensayo in vitro. Las células MDCKII-hMDR1 son muy adecuadas para experimentos LigandTracer debido a su transfección estable, crecimiento rápido y persistente contra el estrés de cizallamiento causado por el plato de cultivo celular giratorio. Por lo tanto, la falta de una ingesta de [11C]SNAP-7941 en el cerebro de ratas y ratones puede ocurrir causada por el eflujo a través del transportador P-gp. Debido a la transfección de las células renales caninas con la proteína de resistencia multifármaco humana 1 (hMDR-1, P-gp), el valor predictivo de este método para la unión del transportador de eflujo en humanos es alto, lo que es favorable en términos de una futura aplicación clínica. Sin embargo, hasta ahora, no se verificó la selectividad frente a otro transportador de eflujo. Por lo tanto, se pueden utilizar otras líneas celulares, expresando diferentes transportadores prominentes de eflujo como la proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) o proteína de resistencia múltiple-1 (MRP-1), para estudiar las interacciones hacia estos transportadores. El método es en comparación con la acumulación clásica o ensayos de transporte muy simple y da resultados inmediatamente cualitativos. Además, la mayor ventaja es que esta tecnología permite evaluar la interacción directa del trazador PET y el objetivo en tiempo real, en contraste con el experimento convencional utilizando cuantificación indirecta (principalmente desplazamiento). Además, el software de radioensayo en tiempo real proporciona flexibilidad experimental (por ejemplo, corrección de descomposición de nucleidos, tiempo de medición y posiciones, etc.) y, por lo tanto, alta libertad para los usuarios. Por otro lado, las limitaciones del método incluyen un bajo rendimiento de la muestra, ya que solo se puede medir una placa de celda a la vez. Además, deben tenerse en cuenta algunas otras cuestiones técnicas y operativas: la tecnología descrita es muy sensible a la radiación de fondo; por lo tanto, las fuentes de radiación deben mantenerse a distancia y se debe hacer hincapié en la medición de fondo antes del experimento. Otro problema relacionado con los experimentos a temperaturas más altas que la temperatura ambiente, es el calentamiento del soporte inclinado: la evaporación del medio de cultivo celular podría afectar al detector. En lugar de calentar, todo el dispositivo se coloca preferentemente en la incubadora. Además, el método se limita a las líneas celulares adherentes. A través de la rotación de la placa de cultivo celular, las células sensibles al estrés cortante pueden desprenderse del plato, lo que puede conducir a resultados no válidos.
Sin embargo, si el experimentador presta atención a estos inconvenientes menores, el método ofrece resultados rápidos y fiables para el análisis del comportamiento cinético de los pet-trazadores preclínicos.

[11C] SNAP-7941 fue evolucionado como la primera tomografía por emisión de positrones (PET)-trazador dirigido al receptor de la hormona que concentra la melanina 1 (MCHR1) - un receptor principalmente involucrado en la regulación central del apetito y la ingesta de alimentos1. El etiquetado carbono-11 de SNAP-7941, un antagonista bien caracterizado del MCHR1, produjo el auténtico PET-tracer2,3,4,5. Sin embargo, la radiosíntesis totalmente automatizada es muy difícil en términos de eficacia y reproducibilidad del tiempo con el radionúclido de corta duración carbono-11 que ofrece una vida media de 20 min6. El tiempo de síntesis global debe mantenerse al mínimo, y como regla general no debe exceder 2-3 vidas medias (es decir, alrededor de 40-60 min para carbono-11)7. Especialmente, los procedimientos de síntesis para radiosondas dirigidos a sistemas receptores con densidades de baja expresión deben optimizarse ampliamente para obtener rendimientos suficientes y, en consecuencia, una alta actividad molar8. La estrategia sintética a menudo sigue la producción de radionúclidos dentro de un ciclotrón y la liberación de [11C]CO2 al sintetizador. Allí, [11C]CO2 se reduce primero a [11C]CH4 y posteriormente reacciona con yodo para producir [11C]CH3I a través del método de fase gaseosa9,10. El tratamiento posterior con triflato de plata produce [11C]CH3OTf directamente en línea. Después, este intermedio reactivo etiquetado carbono-11 se introduce en una solución que contiene la molécula precursora. Una radiosíntesis automatizada implica además un proceso de purificación con RP-HPLC semipreparativo que incluye la formulación posterior del producto adecuado para estudios preclínicos y clínicos.
Independientemente de la vida media del radionúclido y del esfuerzo de tiempo de la radiosíntesis, la farmacocinética de un radiofármaco es la parte más crítica a evaluar durante el desarrollo del PET-tracer. En términos de neuroimagen, la entrada cerebral del PET-tracer es el principal requisito previo. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BBB), una "frontera de seguridad" del cerebro, expresa altamente transportadores de eflujo que pueden descargar moléculas pequeñas (por ejemplo, PET-tracers) y obstaculizar eficientemente su aplicabilidad.
Un gran inconveniente durante la evaluación preclínica son interacciones inesperadas hacia estos transportadores de eflujo, que a menudo no son reconocidos en experimentos in vitro y que conducen al fracaso del PET-tracer in vivo, como se observó para [11C]SNAP-7941. Las imágenes de PET en ratas demostraron una baja acumulación cerebral, que aumentó drásticamente después de la administración del inhibidor de P-gp tariquidar11. Estos datos sugerían que [11C]SNAP-7941 es un sustrato de este sistema transportador de eflujo que impedía el ligando a la unión al MCHR1 central. Desafortunadamente, todavía hay una falta de modelos in vitro adecuados que permitan la predicción de la penetración de BBB en una etapa temprana del desarrollo del trazador.
Aquí, describimos la síntesis automatizada de [11C]SNAP-7941 utilizando un sintetizador para metilaciones de carbono-11. El énfasis de este trabajo es dar una visión general sobre cómo organizar un enfoque experimental consecutivo que incluya la síntesis automatizada, el control de calidad, así como la evaluación in vitro sucesiva con el muy efímero nuledo carbono-11.
En primer lugar, se describen los pasos clave para una radiosíntesis exitosa con un gasto de tiempo mínimo y un rendimiento máximo. A continuación, se establece un procedimiento de control de calidad fiable que hace que la radiosonda esté disponible para posibles estudios clínicos y cumpla los criterios de la Farmacopea Europea12. La cuantificación de la concentración molar y el cálculo de la actividad molar respectiva es un requisito esencial para las sucesivas mediciones cinéticas.
Por último, se presenta un nuevo y sencillo método in vitro que evalúa las interacciones de [11C]SNAP-7941 hacia el transportador de eflujo, P-gp (hMDR1). El modelo cinético propuesto utiliza un dispositivo fácil de manejar que permite una interpretación inmediata de los datos y requiere un esfuerzo mínimo de cultivo celular13.

<table><tbody><tr><td>Tabla 1: Lista de materiales e instrumentación de la radiosíntesis totalmente automatizada de [11C]SNAP-7941</catalizador ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni</td> fuerte <td>Shimadzu, Kioto, Japón</td><td></td><td>Shimalilte Ni reducido, malla 80/100</td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>1.04761.0100</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>para la síntesis de ADN, < 10 ppm H2</td></tr><tr><td>O Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td><td></td>. Acetato de amonio <td>de grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>Etanol glacial</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>96%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>B. Braun, Melsungen, Alemania</td><td></td><td>0.9% </td></tr><tr><td>Hidróxido de tetrabutilamonio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr>.<td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td>. Cartucho SPE <td>de grado HPLC</td>Waters, Milford, MA, EE. <td></td></tr><tr><td></td><td>UU</td><td></td>. <td>SepPak C18plus</td></tr><tr><td>Columna RP-HPLC semipreparativa</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm</td></tr><tr><td>Precolumna</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td></td><td>Chromolith Guard RP-18e, 5-4,6 mm</td></tr><tr><td>Precursor</td><td>Universidad de Viena, Austria</td><td></td><td>SNAP-acid</td></tr><tr><td>Compuesto de referencia</td><td>Universidad de Viena, Austria</td><td></td><td>SNAP-7941</td></tr><tr><td>Trifluorometanosulfonato de plata</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Graphpa GC</td><td>Alltech, Deerfield, IL, EE. UU</td><td></td>. <td>Malla 80/100</td></tr><tr><td>Ciclotrón PET trace 860</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Suecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[11C]CO2 objetivo de alta presión</td><td>Air Liquide, Viena, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRACERlabFX2 C</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Suecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 + 1% O2</td><td>Air Liquide, Viena, Austria</td><td></td><td>Objetivo: gas</td></tr><tr><td>Nombre</strong</td><td>>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Tabla 2: Lista de materiales e instrumentación del control de calidad de [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Hitachi LaChrom, L-7100</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Viena, Austria)</td><td></td><td>Bomba de HPLC</td></tr><tr><td>Merck Hitachi, L7400</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokio, Japón)</td><td></td><td>Detector UV</td></tr><tr><td>Radiodetector de NaI</td><td>Raytest (Straubenhardt, Alemania)</td><td></td><td>Radiodetector de NaI</td></tr><tr><td>Chromolith Performance RP-18e, 100-4,6 mm</td><td>Merck (Darmstadt, Alemania)</td><td></td><td>Columna de HPLC</td></tr><tr><td>430-GC</td><td>Bruker (Bremen, Alemania)</td><td></td><td>Cromatógrafo de gases</td></tr><tr><td>Columna capilar ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm</td><td>SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)</td><td></td><td>Capilar de gas</td></tr><tr><td>Wesco, osmómetro Vapro 5600</td><td>Sanoya Medical Systems (Viena, Austria)</td><td></td><td>Osmómetro</td></tr><tr><td>g-espectrómetro</td><td>g-spectrómetro</td><td></td><td></td> Software de</tr><tr><td>control de cromatografía de gases</td><td>VARIAN (Palo Alto, California, EE.UU.)</td><td></td> <td>Galaxie Versión 1.9.302.952</td></tr><tr><td>Espectrómetro gamma software de control</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, EE.UU.)</td><td></td><td>Maestro para Windows Versión 6.06</td></tr><tr><td>Software de recuperación de espectro gamma</td><td>ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)</td><td></td><td>Winplots versión 3.21</td></tr><tr><td>Software de control de HPLC</td><td>Raytest (Straubenhardt, Alemania)</td><td></td><td>Gina Star Versión 5.9</td></tr><tr><td>inolab 740</td><td>WTW (Weilheim, Alemania)</td><td></td><td>Medidor de pH</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tabla 3: Lista de materiales e instrumentación para la evaluación del comportamiento cinético en tiempo real de [11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de riñón canino Madin-Darby (MDCKII-hMDR1)</td>Instituto del Cáncer de los <td>Países Bajos (NKI, Ámsterdam, Países Bajos)</td><td></td><td>Expresión de la glicoproteína P humana (hMDR1)</td></tr><tr><td>Línea celular de riñón canino Madin-Darby (MDCKII-WT)</td><td>Instituto Oncológico de los Países Bajos (NKI, Ámsterdam, Países Bajos)</td><td></td><td>Wildtype (WT)</td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Viena, Austria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros (FCS)</td><td>VWR International GmbH, Viena, Austria</td><td></td><td>Gibco 10270-106</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>VWR International GmbH, Viena, Austria</td><td></td><td>Gibco 15140</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>Experimentos</td><td></td><td></td><td></td>in vitro</tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Viena, Austria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-Clorhidrato de verapamilo</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, EE. UU.)</td><td></td><td>276855-100 mL</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>Pipetas de plástico desechables estériles</td><td>VWR International GmbH, Viena, Austria</td><td></td><td>Sterilin, 5 mL &ndash; 25 mL</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles</td><td>VWR International GmbH, Viena, Austria</td><td></td><td>Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 y micro; L &ndash; 200 y micro; L</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania</td><td></td><td>Cellstar 250 mL, 75 cm2 rojo tapón de rosca, N.º de fabricante658175</td></tr><tr><td>Control LigandTracer Versión 2.2.2</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suecia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer Yellow</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suecia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer White</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Suecia.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado de mano</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Scepter (Cat.No. PHC00000)</td></tr><tr><td>Sensores de contador de células</td><td>Millipore Corporation Billerica MA01821</td><td></td><td>Scepter Sensor 60 &micro; m (Cat.No. PHCC60050)</td></tr></tbody></table>

aspecto técnico de la síntesis automatizada y evaluación cinética en tiempo real de [11c]snap-7941

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

La tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de imagen molecular esencial que proporciona información sobre las vías y utiliza radioligands específicos para investigaciones in vivo. Dentro de este protocolo, se describe una radiosíntesis controlada remota mente robusta y confiable de [11C]SNAP-7941, un antagonista del receptor de la hormona que concentra la melanina 1. La radiosíntesis comienza con el ciclotrón producido [11C]CO2 que posteriormente se reacciona a través de una transición en fase gaseosa a [11C]CH3OTf. Entonces, este intermedio reactivo se introduce a la solución precursora y forma la radiosonda respectiva. La pureza química y radioquímica se determina por medio de RP-HPLC, implementado rutinariamente en el proceso de control de calidad radiofármaco. Además, la actividad molar se calcula ya que es una necesidad para las siguientes investigaciones cinéticas en tiempo real. Además, [11C]SNAP-7941 se aplica a las células MDCKII-WT y MDCKII-hMDR1 para evaluar el impacto de la expresión de p-glicoproteína (P-gp) en la acumulación celular. Por esta razón, la línea celular de expresión de P-gp (MDCKII-hMDR1) se utiliza sin o con bloqueo antes de los experimentos por medio del sustrato de P-gp (-)-verapamil y los resultados se comparan con los observados para las células de tipo silvestre. El enfoque experimental general demuestra la importancia de una gestión precisa del tiempo que es esencial para cada estudio preclínico y clínico utilizando marcadores PET radiomarcados con nucleidos de corta duración, como el carbono-11 (vida media: 20 min).

La radiofensisis totalmente automatizada de [11C]SNAP-7941 produjo 5,7 x 2,5 GBq (4,6 a 2,0% en EOB, 14,9 a 5,9% sobre la base de [11C]CH3OTf; n a 10) del producto formulado. La síntesis global duró alrededor de 40 min, donde se requirieron 15 min para la preparación de [11C]CH3OTf a través del método de fase gaseosa, otros 5 min fueron necesarios para el radioetiquetado del precursor, seguido de 10 min de semi-preparative Purificación RP-HPLC y 10 min para la extracción y formulación de fase sólida del cartucho C18. A continuación, se entregó una pequeña alícuota (aprox. 100-200 l) a la persona responsable del control de calidad, mientras que el vial del producto original que contenía el trazador listo para usar se pasó al experimentador del análisis cinético en tiempo real.
El control de calidad se completó dentro de los 10 minutos después del final de la síntesis. La actividad molar se encontraba en un rango de 72 a 41 GBq/mol (n a 10) y la pureza radioquímica siempre fue &gt; 95%. Todos los demás parámetros (pH, osmolalidad, disolventes residuales) cumplieron con los criterios de liberación. Para el ensayo cinético en tiempo real, se eligieron tres configuraciones experimentales diferentes: (A) células MDCKII-WT tratadas y no tratadas (vehículo), (B) no tratadas o tratadas con células MDCKII-hMDR1 del vehículo y (C) la última línea celular con bloqueo previo al tiempo real ensayo cinético del transportador utilizando el uso de la tecnología de transporte (-verapamil). La aplicación de [11C]SNAP-7941 a la línea celular de tipo silvestre MDCKII-WT (P-gp non-expressing) y MDCKII-hMDR1 (P-gp expressing) muestra un comportamiento cinético diferente, ya que hay una rápida acumulación en la línea celular de tipo salvaje, mientras que no se observó acumulación para las células MDCKII-hMDR1. Sin embargo, el bloqueo del transportador de eflujo P-gp en las células MDCKII-hMDR1 con (-)-verapamil condujo a una cinética en tiempo real comparable como ya se ha visto para la línea celular de tipo salvaje (Figura5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig1.jpg"> Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo. Flujo de trabajo de la radiosíntesis, control de calidad y rendimiento de la medición cinética en tiempo real de [11C]SNAP-7941. Las flechas negras indican la forma de transporte de la radiactividad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig2.jpg"> Figura 2: Esquema radiosintético del sintetizador automatizado. Circuito de conmutación del sintetizador automatizado, comenzando con la unidad de circulación para [11C]CH3I/[11C]CH3Producción de OTf, reactor para la introducción de la actividad en la solución precursora y purificación SPE (SPE ) extracción de fase sólida; PCV - vial de recogida de productos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig3.jpg"> Figura 3: Cromatogramas representativos de la radiosíntesis totalmente automatizada de [11C]SNAP-7841. El cromatograma semi-preparativo RP-HPLC se ilustra en la parte superior y el analítico después de la purificación en la parte inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig4.jpg"> Figura 4: Preparación de platos de cultivo celular para experimentos en tiempo real. El paso 1 incluye la sembración de 2.5 x 105 hasta 1 x 106 dependiendo del tipo de celda y su tasa de crecimiento. Posteriormente, el plato de cultivo se coloca en un plano oblicuo (aproximadamente 30-45o). Por lo tanto, el aparato de metal suministrado o la tapa de un plato de cultivo celular se puede utilizar en la incubadora para estabilizar la posición de la lancha del plato. Al día siguiente (24 h) el plato se ajusta horizontalmente, y se añade un medio de cultivo celular fresco para cubrir completamente la superficie celular. El día del experimento, se examinan la viabilidad celular y la confluencia. De acuerdo con el protocolo experimental, las células se lavan con DPBS, el medio se sustituye por un medio libre de suero (2 ml), y el plato de cultivo se reposiciona a una posición oblicua hasta el inicio de los experimentos. A partir de ahora, las células pueden ser tratadas con el inhibidor o el vehículo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig5.jpg"> Figura 5: Mediciones cinéticas en tiempo real de [11C]SNAP-7941. La cinética representativa en tiempo real de [11C]SNAP-7941 se muestra en tres configuraciones diferentes: utilizando células MDCKII-WT; Células MDCKII-hMDR1 prebloqueadas con (-verapamilo como inhibidor de P-gp y células MDCKII-hMDR1 sin obstrucción. El eje Y ilustra la tasa de aumento de las células MDCKII-hMDR1 y WT prebloqueadas en comparación con los resultados de las células MDCKII-MDR1 no tratadas o tratadas por vehículos, respectivamente (sin admisión, 0%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, representamos un protocolo para el marcado radioeléctrico totalmente automatizado de [11C]SNAP-7941 y el análisis de la cinética en tiempo real de este PET-tracer en células de expresión y no expresión de P-gp.

Aspecto técnico de la síntesis automatizada y evaluación cinética en tiempo real de [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

El radioetiquetado de carbono-11 permite utilizar pequeños compuestos para la tomografía por emisión de positrones o PET sin cambiar la molécula. Esto es esencial para investigar los niveles de expresión del receptor. La ventaja del radioetiquetado de carbono-11 es que podemos utilizar PET para evaluar directamente la cinética de las fijaciones de SNAP hacia el receptor hormonal concentrado de melanina en tiempo real.SNAP como antagonista del receptor de la hormona concentrante de melanina contribuirá a una mejor comprensión de este receptor y su asociación con condiciones metabólicas como la obesidad y la diabetes. Los transportadores de eflujo expresados en la barrera hematoencefálica pueden obstaculizar significativamente el uso de radiofármacos para la toma de imágenes de expresión de receptores centrales. Por lo tanto, es importante evaluar las trazas in vitro.La radiosíntesis automatizada de SNAP es ampliamente aplicable a compuestos radiomarcados de bajo peso molecular con un grupo metilo fácilmente evaluable. Una vez establecido este procedimiento se puede adaptar para otros compuestos. La asistencia en la demostración serán las estudiantes senior de doctorado Sarah Pfaff y Theresa Balber.Para comenzar la síntesis snap de carbono-11, configure un módulo de síntesis automatizado de carbono-11 limpio con los reactivos y materiales adecuados. Inicie el proceso de síntesis de SNAP en el módulo informático que comenzará con las comprobaciones y el acondicionamiento del sistema. Unos 30 a 40 minutos antes de que el módulo esté listo para la entrega de C-11, seleccione el objetivo de dióxido de carbono C-11 en el ciclotrón e inicie el haz a 65 microamperios.Una vez que el módulo está listo para la entrega, cierre la ventana interior y la puerta exterior. Confirme que la trampa de CO2 se ha enfriado a por lo menos 40 grados Celsius y que la trampa de metano ha comenzado a enfriarse. Una vez que el ciclotrón ha producido alrededor de 120 gigabecquerels de C-11 CO2 haga clic en Aceptar en el software del módulo para abrir la ruta desde el objetivo a través de la trampa de CO2.En la computadora de ciclotrón comience a entregar C-11 CO2 al módulo. Supervise la transferencia de actividad en el ordenador del módulo y asegúrese de que procede a la reducción de CO2 a metano después de tres minutos. Monitorear el proceso a medida que el metano resultante se enjuaga a la trampa de metano y se convierte en yoduro de metilo por circulación a través del horno de yodo.Al final de la secuencia de conversión espere mientras los subproductos se vacían de la trampa de yoduro de metilo para agotarse y luego confirme que el reactor está listo para recibir actividad haciendo clic en Aceptar. Monitorear el sistema como el yoduro de metilo se libera de la trampa, se enjuaga a través del horno de triflato de metilo y atrapado en el reactor. Cuando la actividad en las mesetas del reactor confirma que el reventado está completo. Espere mientras la mezcla de reacción reacciona a 75 grados Centígrados durante tres minutos.A continuación, monitoree el sistema mientras la mezcla de reacción se enfría a menos de 35 grados centígrados y se apaga con 1,5 mililitros de agua. Supervise el sistema a medida que la mezcla de reacción se carga en el bucle de inyección HPLC y se inyecta en la columna HPLC semi-preparatoria. Observe los rastros del detector UV y gamma mientras procede la cromatografía.Cuando el pico del producto comience a aparecer manualmente, comience a recoger el producto en el matraz de recogida de fondo redondo en el módulo. Finalizar manualmente la recolección cuando la señal gamma cae por debajo de unos 400 recuentos por segundo. Observe el nivel de líquido en el matraz inferior redondo mientras el producto se carga en un cartucho de extracción de fase sólida bajo presión de helio.Una vez que el matraz esté vacío y el líquido haya pasado a través del cartucho SPE, haga clic en Aceptar para comenzar a lavar los productos atrapados en el cartucho. A continuación, controle la actividad en el vial de recogida de productos, ya que el producto se eluye primero del cartucho en el vial y luego se diluye con una solución salina al 0,9%. Observe cómo la solución del producto se transfiere al vial del producto a través del filtro estéril bajo presión de helio.Cuando la transferencia se haya completado, cierre la válvula de salida del producto. Cuando la radiosonda llega al vial del producto mide el rendimiento radiactivo absoluto. A continuación, utilice una jeringa con plomo blindado para transferir 100 microlitros del trazador a un pequeño vial para el control de calidad.Lleve la muestra de control de calidad a un área de trabajo de control de calidad blindada. Extraiga 40 microlitros de la muestra de control de calidad en una jeringa hermética al gas, cárguelo en un instrumento HPLC preparado equipado con una columna analítica e inyecte el producto. Realice otras mediciones de control de calidad durante la ejecución de HPLC.Una vez que la carrera de HPLC ha terminado integrar todos los picos en el cromatograma del detector de radiactividad para determinar si la pureza química de radio SNAP es mayor que 95%Integrar los picos en el cromatograma UV para determinar la pureza química del producto. Utilice el área bajo el pico del producto UV para calcular la actividad específica. Una vez confirmado el producto para cumplir con los requisitos de uso, suelte el trazador de radio al laboratorio de experimentos cinéticos en tiempo real.Al menos 30 minutos antes del experimento lave el tipo silvestre preparado o las células trans infectadas con DPBS y agregue dos mililitros de medio de crecimiento sin suero. Para bloquear las células trans infectadas, agregue 0,98 microlitros de una solución de 20,4 milimolares de clorhidrato de verapamilo racémico en dimetilslfóxido. Incubar las células en un plano oblicuo durante 30 minutos.A continuación, encienda el instrumento de ensayo en tiempo real y el ordenador asociado. Abra el software de control y elija un destino. Establezca el número de posiciones en dos, el tiempo de detección en tres segundos, el tiempo de retardo de detección en dos segundos y el nombre de la primera fase en línea de base.Inserte la placa de cultivo celular en el soporte inclinado del dispositivo con el poste de la celda en la parte inferior. Asegúrese de que el polo celular esté cubierto en un medio de cultivo celular. Inicie una medición de fondo de 10 minutos y establezca el nombre de archivo y la ruta de acceso.Establezca la escala de tiempo en minutos y la colección de nucleidos en carbono-11. Configure el gráfico para mostrar los datos de destino restados de fondo, destino y fondo. Una vez que el trazador de radio ha sido entregado y aprobado para su uso, tome una pequeña muestra para el ensayo.Calcule el volumen necesario de solución de trazador de radio y prepare una pipeta. En el software de instrumentos, detenga la carrera y espere a que se detenga la rotación del plato. Abra la tapa del dispositivo, gire el soporte 90 grados a la izquierda, añada el trazador de radio con la pipeta preparada y devuelva el dispositivo a su posición inicial.Cierre la tapa del dispositivo e reanude inmediatamente el experimento. Deje que el experimento se ejecute durante 20 minutos antes de finalizarlo. Procesar y analizar los datos para evaluar la captación de SNAP en las celdas.Ahora el procedimiento se puede repetir para el plato de cultivo celular de control tratado con DMSO y la línea de celdas de tipo salvaje. Los ensayos cinéticos en tiempo real se realizaron con células de tipo salvaje no PGP que expresan, células que expresan PGP prebloqueadas con verapamilo como inhibidor de PGP y células PGP desbloqueadas. No se observó ninguna diferencia significativa entre las células no tratadas y las células tratadas con vehículos.Carbon-11 SNAP se acumuló rápidamente en células de tipo salvaje mientras no se observó acumulación en células que expresan PGP. El bloqueo previo del transportador de eflujo PGP con verapamilo dio lugar a la acumulación de SNAP en las células PGP comparable a la de las células de tipo salvaje. En combinación con las mediciones cinéticas en tiempo real, esta configuración permite una amplia comprensión de la farmacocinética de los compuestos de bajo peso molecular y, por lo tanto, es muy importante para el desarrollo preclínica de radiofármacos.El tiempo y la organización son los ingredientes principales para una radiosíntesis exitosa de carbono-11 con experimentos cinéticos posteriores en tiempo real, ya que la vida media del carbono-11 es de sólo 20 minutos. Debido a una corta vida media de carbono-11 muchas partes de este procedimiento se realizan simultáneamente. Es importante que todos los involucrados entiendan el alcance y el momento de su función.Tanto la seguridad del producto como la protección contra la radiación son fundamentales para la preparación de radiofármacos. Todos los experimentos deben seguir lo más bajo que sea razonablemente alcanzable o el principio ALARA para limitar la exposición a la radiación del operador.

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