Name: Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a evaluar la angiogénesis terapéutica en un modelo de isquemia de extremidades posteriores en ratones. Este protocolo permite analizar efectos funcionales, histológicos y moleculares de agentes angiogénicos con potencial aplicación clínica.

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Agradecemos a José Rino y a Tonia Carvalho, jefes del Centro de Bioimagen y del Laboratorio de Histología y Patología Comparada del Instituto de Medicina Molecular Joao Lobo Antunes, respectivamente. También agradecemos a Vyacheslav Sushchyk del Departamento de Anatomía de la Escuela de Medicina Nova/Faculdade de Ciencias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Referencia de financiación: proyecto financiado por UID/IC/0306/2016 Fundación para la Ciencia y una Tecnología. Paula de Oliveira cuenta con el apoyo de una beca (SFRH/BD/80483/2011) de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología.

Todos los procedimientos animales se ajustan a la Directiva 2010/63/UE y han sido aprobados por el Organismo Institucional de Bienestar Animal y autorizados por DGAV, la autoridad competente portuguesa para la protección animal (número de licencia 023861/2013)
ADVERTENCIA: Varios de los productos químicos utilizados en los protocolos son tóxicos y dañinos. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas y equipo de protección personal (guantes, abrigo de laboratorio, pantalones de longitud completa y zapatos de punta cerrada)
1. El modelo murino de la isquemia de las extremidades posteriores
NOTA: Todos los experimentos se realizan en ratones hembra C57BL/6 de 22 semanas de edad.
<ol><li>Preparación de soluciones
	<ol>
<li>
Preparación de la solución anestésica Nota: Esta combinación anestésica (medetomidina y ketamina) proporciona hasta 30 minutos de inmovilización y una ventana quirúrgica de 15 min. El efecto puede ser revertido por la administración de atipamezol.<ol>
<li>Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 1 ml de medetomidina (1 mg/kg de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguela a un tubo de halcón de 15 ml.</li>
			<li>Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 0,75 ml de ketamina (75 mg/Kg de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguela a un tubo de halcón de 15 ml que contenga la medetomidina.</li>
			<li>Añadir 8,25 ml de solución salina estéril (0,9% NaCl), para obtener 10 ml de solución anestésica.</li>
			<li>Identifique el tubo con el nombre de los compuestos, la fecha mezclada y la fecha de caducidad.</li>
			<li>Conservar en la oscuridad a 4oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparación de la solución antisedante
		<ol>
<li>Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 1 ml de atipamezol (5 mg/kg de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguelo a un tubo de halcón de 15 ml.</li>
			<li>Añadir 9 ml de solución salina estéril (0,9% NaCl), para obtener 10 ml de solución de reversión.</li>
			<li>Identifique el tubo con el nombre de los compuestos, la fecha mezclada y la fecha de caducidad.</li>
			<li>Conservar en la oscuridad a 4oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparación de la solución de analgesia postoperatoria
		<ol>
<li>Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 0,5 ml de buprenorfina (100 l/15-30 g de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguela a un tubo de halcón de 15 ml.</li>
			<li>Añadir 9,5 ml de solución salina estéril (0,9% NaCl), para obtener 10 ml de solución de analgesia.</li>
			<li>Identifique el tubo con el nombre de los compuestos, la fecha mezclada y la fecha de caducidad.</li>
			<li>Conservar en la oscuridad a 4oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción quirúrgica de isquemia de la extremidad posterior
	<ol>
<li>Herramientas quirúrgicas necesarias para esta intervención: fórceps puntiagudos, tijeras de resorte, soporte de aguja oftálmica, tijeras quirúrgicas y un soporte de aguja. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas en un autoclave antes de su uso. Use hisopos de algodón para la disección de grasa subcutánea.</li>
		<li>Cargue la jeringa con la solución de anestesia antes de sujetar el ratón.</li>
		<li>Sujete al animal aplicando fuerza detrás de sus orejas contra la rejilla de la jaula, sosteniendo tanta piel como sea posible para mantener el ratón inmóvil.</li>
		<li>Mantenga al animal inclinado con la cabeza baja y realice una inyección intraperitoneal de la solución de anestesia, manteniendo la jeringa en un ángulo de 45o con el cuerpo del ratón.</li>
		<li>Compruebe la ausencia de reflejos de abstinencia del pedal, para evaluar la profundidad de la anestesia.</li>
		<li>Retire el cabello de la extremidad posterior derecha con una afeitadora eléctrica. Use un exfoliante de jabón desinfectante de clorhexidina para la preparación de la piel. Use una toalla de papel limpia para quitar los suds. Aplique un exfoliante quirúrgico de clorhexidina y proteja el área de la piel con una cortina estéril antes de transportar los ratones a la suite quirúrgica estéril.</li>
		<li>Colocar el animal en decúmito dorsal y sujetarlo con las cuatro extremidades separadas y aseguradas con cinta adhesiva. ADVERTENCIA: Realice el procedimiento en una almohadilla calentada para mantener estable la temperatura corporal del animal; el procedimiento quirúrgico se realiza utilizando un microscopio de disección con un aumento de 10x o 20x.</li>
		<li>Aplicar una solución antiséptica de clorhexidina con gasa estéril para finalizar la preparación de la piel. Usando una cuchilla de bisturí quirúrgico número 11 realizar una incisión cutánea de 1 cm sobre el muslo de la extremidad posterior derecha.</li>
		<li>Diseccione grasa subcutánea con exposición del haz neurovascular. Usando los fórceps puntiagudos, las tijeras de resorte y el soporte de la aguja oftálmica, abren la vaina ilio-femoral membranosa para exponer los vasos anilánicos y femorales externos distales.</li>
		<li>Diseccionar y separar los vasos (arteria y vena) del nervio. Usando una sutura de polipropileno no absorbible 7.0 ligar la arteria ilíaca externa distal y la vena y la arteria femoral distal y la vena.</li>
		<li>Transectele el segmento de la arteria ilio-femoral y las venas entre los nudos distales y proximales con las tijeras de resorte.</li>
		<li>Cierre la incisión con una sutura absorbible (por ejemplo, sutura 5.0 Vicryl).</li>
		<li>Cargue la jeringa con la solución antisedante y utilice el mismo método detallado en 1.2.3 y 1.2.4 para realizar una inyección intraperitoneal de la solución antisedante.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitoreo postoperatorio NOTA: Los animales son observados cuidadosamente cada 15-20 minutos para asegurarse de que todos los animales se recuperen bien del antisedante; animales anestesiados nunca se quedan desatendidos.<ol>
<li>Evaluar la recuperación de la anestesia: 1) monitorear la velocidad y profundidad de la respiración; 2) evaluar los reflejos animales (pedal y posición ocular)</li>
		<li>Realizar una inyección subcutánea de la analgesia postoperatoria cada 8-12 h.</li>
		<li>Monitorear a los animales diariamente después de la cirugía registrando una breve descripción del estado de salud del animal y la apariencia del sitio de la cirugía, asegúrese de que todas las suturas estén cerradas.</li>
		<li>Vuelva a suturar la incisión, si se produce dehiscencia. Si no tiene éxito, aplique una película de barrera cutánea en la incisión para protegerla de la orina, las excreciones fecales, la fricción y la cizalladura de la piel y para ayudar al proceso de curación.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Evaluación del efecto angiogénico
NOTA: Después de la inducción de la isquemia, aplicar el agente terapéutico en el estudio y lograr los siguientes procedimientos. Las medidas emprendidas en otros momentos se detallan en la sección correspondiente.
<ol><li>Imágenes por perfusión Láser Doppler
	<ol>
<li>Retire el cabello de ambas extremidades posteriores un día antes del análisis utilizando una afeitadora eléctrica seguida de crema depilatoria.</li>
		<li>Anestetizar a los ratones utilizando la solución anestésica.</li>
		<li>Colocar el animal sobre una almohadilla calefactora de 37 oC durante 5 minutos para asegurarse de que la temperatura no cambiará durante el procedimiento</li>
		<li>Coloque al animal en posición supina con las piernas fijadas en una posición extendida. Mida la distancia entre las patas y los pies derecho e izquierdo para cada animal, ya que el posicionamiento del animal debe ser similar siempre que el procedimiento deba repetirse para seguir los cambios en la perfusión de las extremidades posteriores a lo largo del tiempo.</li>
		<li>Comience a adquirir datos mediante un imager de perfusión Doppler láser.</li>
		<li>Una vez completada la adquisición, revierta la anestesia con la solución antisedantes.</li>
		<li>Abra el software de análisis de imágenes y dibuje la región de interés (ROI) alrededor de la extremidad posterior isquémica y un ROI comparable alrededor de la extremidad posterior no isquémica.</li>
		<li>Observar los valores de flujo y determinar la perfusión como una relación de la perfusión en la extremidad isquémica a la de la extremidad no isquémica. Los cambios en la relación de perfusión se miden con el tiempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunohistoquímica y análisis de densidad capilar
	<ol>
<li>Después de anestesiar, sacrificar a los ratones por luxación cervical.</li>
		<li>Para cosechar los músculos gastrocnemius de ambas piernas, primero, eliminar la piel de ambas extremidades posteriores.</li>
		<li>Identifique el tendón de Aquiles y separe el tendón del hueso con un bisturí de 11 hojas.</li>
		<li>Sostenga el tendón de Aquiles y separe el músculo de la tibia y el peroné hasta la articulación de la rodilla con tijeras de primavera.</li>
		<li>Separe el bíceps femoris del músculo gastrocnemius.</li>
		<li>Utilice tijeras de resorte para cortar las inserciones de los músculos gastrocnemius a nivel de la articulación de la rodilla.</li>
		<li>Coloque los músculos gastrocnemius cosechados en una orientación transversal en un pequeño disco de corcho con la ayuda de 10% de tragacanth.</li>
		<li>Congele las muestras en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno y guárdelas a -80 oC hasta el ensección.</li>
		<li>Cortar 7 m secciones de las muestras musculares en un criostato y montar en diapositivas de vidrio. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
		<li>Fijar los portaobjetos de vidrio en una botella que contiene acetona pura enfriada (aproximadamente 50 ml) durante 10 min, a -20 oC.</li>
		<li>Añadir el hidrógeno peroxidasa 0,3% diluido en metanol (50 ml) durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar dos veces en solución salina con fosfato (PBS) (50 ml) durante un total de 10 min.</li>
		<li>Utilice una pluma hidrófoba alrededor de las secciones. NOTA: El uso de una pluma hidrófoba permite reducir la cantidad de soluciones gastadas durante el protocolo. Para todas las incubaciones utilice 100 ml de todas las soluciones, por sección.</li>
		<li>Aplicar una solución de bloqueo de 5% de suero de conejo en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar los especímenes durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal anti-CD31 diluido a 1:500 en 1 % de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS.</li>
		<li>Lavar tres veces en PBS durante un total de 30 min.</li>
		<li>Añadir un anticuerpo secundario antirrata IgG de conejo biotinilado a 1:200 en 1% de BSA en PBS y un 5% de suero de conejo durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar en PBS como antes y añadir complejo de peroxidasa conjugada con avidina durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Enjuague 3 veces en PBS durante 5 min y agregue el kit de sustrato de peroxidasa de diaminobenzidina (DAB) durante otros 5 min.</li>
		<li>Contratratar las secciones con hematoxilina durante 10 s antes del montaje.</li>
		<li>Mida las densidades capilares utilizando un microscopio de campo brillante vertical (es decir, número de capilares por número de miocitos) en 2 secciones diferentes de 4 áreas anatómicas distintas en cada espécimen.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusión de agentes de contraste
	<ol>
<li>Anestetizar a los ratones utilizando la solución anestésica.</li>
		<li>Realice una laparotomía mediana con una cuchilla de bisturí número 15.</li>
		<li>Exponer la aorta abdominal y la vena cava caudal, después de retraer senos lateralmente el intestino delgado y usar tijeras de primavera.</li>
		<li>Inserte un catéter de calibre 26 cranealmente en la aorta abdominal y otro en la vena cava caudal en la misma dirección.</li>
		<li>Fije los catéteres en su lugar con una sutura de seda 5/0 para realizar una sutura de estancia.</li>
		<li>Lavar el sistema vascular con una solución salina de 37 oC que contenga heparina (500 unidades/100 ml) empujada en la aorta abdominal con una jeringa de 10 ml. Continúe la perfusión suave hasta que se pueda ver una solución transparente que sale del catéter colocado dentro de la vena cava caudal. NOTA: Por lo general, se requieren de 30 a 40 ml de una solución salina heparinizada para enjuagar el sistema vascular de una rata adulta.</li>
		<li>Administrar una mezcla de adenosina (1 mg/L) y papaverina (4 mg/L) durante 2 min.</li>
		<li>Inyectar en el catéter aórtico 10 ml de una mezcla de 50% sulfato de bario y 5% gelatina. NOTA: La solución debe mantenerse a 60 oC para evitar el engrosamiento.</li>
		<li>Dejar los ratones a - 4 oC durante al menos 4 h, con el fin de permitir que la fundición vascular se solidifique.</li>
		<li>Retire la piel de la parte inferior del cuerpo de cada ratón.</li>
	</ol></li>
	<li>Diofonización - Técnica Spalteholz
	<ol>
<li>Fijar los ratones por inmersión en una solución de formaldehído al 10% durante al menos 72 h.</li>
		<li>Blanquear a los ratones por inmersión en una solución de peróxido de hidrógeno al 30% durante 24 horas.</li>
		<li>Deshidratar a los ratones utilizando la técnica de sustitución de congelación. Esta metodología consiste en someter a los ratones a pasajes sucesivos (en promedio cuatro) de acetona pura a - 20 oC para 24 h cada uno.</li>
		<li>Aclarar los ratones sumergiéndolo en una solución que contiene una mezcla de 100% benzoato de bencilo y 100% salicilato de metilo en una proporción 3:5 (esta mezcla también se conoce como solución Spalteholz) 13.</li>
		<li>Deje a los ratones sumergidos en la solución de Spalteholz en el interior en una cámara de vacío hasta que se vuelva diáfano, lo que suele tardar de 5 a 7 días.</li>
		<li>Reemplace la solución, si se oscurece antes de que la muestra se aclare.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación de buques colaterales
	<ol>
<li>Observe los ratones suspendidos en la solución de Spalteholz bajo transiluminación utilizando un microscopio estereono. Use fórceps de microcirugía para agarrarlo y moverlo suavemente.</li>
		<li>Fotografíe todas las extremidades utilizando una cámara digital conectada al microscopio.</li>
		<li>Obtenga fotografías de extremidades completas utilizando el software adecuado.</li>
		<li>Realice una segmentación manual de los recipientes colaterales resaltándolos utilizando el software adecuado. NOTA: Los vasos colaterales se definen de acuerdo con la definición de Longland, un tallo definido, una zona media y un re-participante, con un diámetro entre 20 y 300 m, excluyendo las arterias femorales, safenosas y popliteales y todas las estructuras venosas.</li>
		<li>Definir los IRU en cada ratón en la misma región anatómica en el aductor, circundante y por debajo de la oclusión quirúrgica.</li>
		<li>Cuantifique la densidad de los buques colaterales (CVD) en ROI equivalentes correspondientes al 20% del área total de las extremidades. La ECV se calcula como la relación entre el área vascular y las áreas de los IRO. Todas las mediciones de densidad se realizan utilizando el software ImageJ. NOTA: Se supone que el valor de ECV de la extremidad no isquémica para cada ratón corresponde al 100% para excluir las variaciones en los procedimientos de anatomía, perfusión o diofonización. Por lo tanto, el porcentaje de ECV en la extremidad isquémica se calculó en relación con el porcentaje no isquémico.</li>
		<li>Determinar el porcentaje de aumento de ECV como la diferencia entre el porcentaje de ECV entre las extremidades isquémicas y no isquémicas.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdisección de captura láser de capilares
	<ol>
<li>Después de anestesiar, sacrificar a los ratones por luxación cervical.</li>
		<li>Para cosechar los músculos gastrocnemius de ambas piernas, retire la piel de los ratones ambas extremidades posteriores.</li>
		<li>Identifique el tendón de Aquiles y separe el tendón del hueso con un bisturí de 11 hojas.</li>
		<li>Sostenga el tendón de Aquiles y separe el músculo de la tibia y el peroné hasta la articulación de la rodilla con tijeras de primavera.</li>
		<li>Separe el bíceps femoris del músculo gastrocnemius.</li>
		<li>Utilice tijeras de resorte para cortar las inserciones de los músculos gastrocnemius a nivel de la articulación de la rodilla.</li>
		<li>Coloque los músculos gastrocnemius cosechados en una orientación transversal en un pequeño disco de corcho con la ayuda de un 10 % de tragacanth.</li>
		<li>Congele las muestras en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno y guárdelas a -80 oC hasta el ensección.</li>
		<li>Cortar en un criostato de 12 m secciones de las muestras musculares y montar en diapositivas de vidrio. NOTA: Para la protección del ARN, tome un portaobjetos preenfriado y toque la parte posterior de la diapositiva con el dedo (guantes) para calentar solo la región para colocar la sección. Transfiera la sección del cuchillo criostato tocando con la zona calentada y seque a -20 oC en el criostato durante 2-3 min. El protocolo se puede pausar aquí.<ol>
<li>Fijar los portaobjetos de vidrio en una botella que contiene acetona pura enfriada (aproximadamente 50 ml) durante 5 minutos a -20 oC y secarlos al aire.</li>
			<li>Utilice una pluma hidrófoba alrededor de las secciones. NOTA: El uso de la pluma hidrófoba ayuda a reducir la cantidad de soluciones gastadas durante el protocolo. Para todas las incubaciones utilice 100 ml de todas las soluciones, por sección.</li>
			<li>Rehidratar con 2 M NaCl/PBS a 4oC e incubar los especímenes durante la noche a 4oC con anticuerpo monoclonal de rata anti-CD31 a 1:500 en 2M NaCl/PBS.</li>
			<li>Lavar dos veces en 2M NaCl/PBS para un total de 6 min.</li>
			<li>Añadir un anticuerpo secundario antirrata igG de conejo biotinilado a 1:200 en 2M NaCl/PBS y un 5% de suero de conejo durante 30 min a 4oC.</li>
			<li>Lavar en 2 M NaCl/PBS como antes y añadir complejo de peroxidasa conjugada con avidina durante 30 min a 4 oC.</li>
			<li>Enjuague y agregue el kit de sustrato de peroxidasa DAB durante 5 min.</li>
			<li>Deshidratar las secciones en etanol 90 % helado seguido de etanol al 100 % y dejarlas secar.</li>
			<li>Diseccionar 10 000 capilares por ratones utilizando un sistema de microdisección láser equipado con un láser pulsado de estado sólido de 355 nm y catapultar los capilares diseccionados a una tapa adhesiva de tubo de microfusión.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de ARN, síntesis de ADNc, preamplificación y RT-PCR
	<ol>
<li>Aislar el ARN total de los capilares microdiseccionados utilizando un kit adecuado, el ARN total obtenido está entre 1,5-3 ng/L.</li>
		<li>Utilice un kit de síntesis de ADNc para la síntesis y dos rondas de preamplificación, utilizando las imprimaciones descritas en la Tabla1.</li>
		<li>Realice el RT-PCR para los mismos destinos descritos en el paso anterior. Utilice un programa que consista en un paso inicial de desnaturalización a 95 oC durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95 oC durante 15 s y a 60 oC durante 1 min.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los modelos murinos de CLI han consistido principalmente en la ligadura de la arteria femoral sólo distal al origen de la profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Esto ha demostrado dejar intacta la mayor parte de la circulación colateral, que restaura el flujo sanguíneo a la extremidad dentro de los 7 días 9. La...

La enfermedad arterial periférica (PAD) afecta predominantemente a las extremidades inferiores. La PAD es causada por la aterosclerosis, una obstrucción arterial que puede causar una restricción grave al flujo sanguíneo en las extremidades inferiores1. La claudicación intermitente es la primera manifestación de la PAD y se refiere al dolor muscular al caminar. La CLI es la etapa más grave de la PAD, siendo diagnosticada enpacientes que muestran dolor isquémico de reposo, úlceras o gangrena 2. Los pacientes con CLI tienen un alto riesgo de amputación, especialmente si no se tratan3. La revascularización de las extremidades inferiores (ya sea mediante cirugía abierta o un procedimiento endovascular) es actualmente la única manera de lograr el salvamento de las extremidades. Sin embargo, alrededor del 30% de los pacientes con CLI no son adecuados para estos procedimientos, porrazones que incluyen la ubicación de las lesiones, el patrón de oclusión arterial y la amplia comorbilidad 4,5. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias para estos pacientes de otro modo intratables, siendo la promoción de la angiogénesis la estrategia bajo una investigación más intensa.
Antes de las pruebas en humanos, la eficacia y seguridad de las nuevas terapias in vivo debe tenerse en cuenta en modelos animales. Se han desarrollado varios modelos para el estudio de la CLI, principalmente induciendo isquemia de la extremidad posterior (HLI) en ratones6,7,8,9,10. Sin embargo, estos modelos difieren en varios aspectos, incluyendo la naturaleza de las arterias que están ligadas y/o extirpadas y si las venas y los nervios que rodean también se diseccionan6,7,8, 9,10. En conjunto, estos aspectos afectarán la gravedad de la lesión por isquemia-reperfusión en cada animal, lo que dificultará la comparación de los resultados. Por lo tanto, es fundamental desarrollar un protocolo eficaz en el que se estampar el procedimiento para inducir la isquemia y la evaluación de diferentes objetivos para evaluar si una terapia angiogénica determinada será eficaz. Un protocolo experimental diseñado para abarcar todos estos aspectos proporcionaría una comprensión completa de los mecanismos por los cuales las terapias angiogénicas ejercen sus efectos y una medida de su eficacia en cada uno de sus resultados. Dos obras distintas publicadas recientemente por nuestro equipo son un buen ejemplo11,12, en el que se evaluaron diferentes enfoques para inducir la angiogénesis terapéutica utilizando el mismo protocolo que se describirá con más detalle en este Protocolo.
El objetivo general de este protocolo es describir un modelo experimental reproducible que pueda imitar los efectos de la CLI y sentar las bases experimentales para una evaluación integral de los efectos funcionales, histológicos y moleculares de la angiogena putativa Agentes.

<table><tbody><tr><td>7500 Instrumento de biosistemas</td><td></td><td></td><td>aplicados</td> a PCR rápida en tiempo real</tr><tr><td>Reactivo de acetona</td><td>Mer</td><td>1000141000</td> k<td>; Precaución - altamente inflamable</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Valdepharm</td><td></td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>OrionReactivo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de bario (Micropaque)</td><td>Guebert</td><td>8671404 (ref. Infarmed)</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>RichterReactivo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss Opmi-1 FC Microscopio quirúrgico</td><td>Carl Zeiss Microscopía, Alemania</td><td></td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>ADNc RT2 PreAMP Kit de síntesis de ADNc</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>7335730 Criostato Leica CM</td><td>Leica Microsystems</td><td>3050S</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>DAB kit de sustrato de peroxidasa</td><td>DAKO; Vector Laboratories</td><td>K3468</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>peroxidasa de hidrógeno</td><td>Merk</td><td>1072090250</td><td>reactivo; Precaución</td></tr>: <tr><td>bolígrafo hidrofóbico</td> nocif <td>Dako</td><td>411121</td><td>Reactivo; Precaución - tóxico</td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>Richterpharma</td><td>CN:580393,7 630/01/12 Dfvf</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Láser Doppler generador de imágenes de perfusión moorLDI2-HIR</td><td>MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Reino Unido</td><td>5710</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Leica DM2500 microscopio de campo claro</td><td>vertical Leica Microsystems</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Medetor</td><td>Virbac</td><td>037/01/07RFVPT</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>metanol</td><td>VWR</td><td>UN1230</td><td>Reactivo; Precaución: reactivo de</td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Labesfal</td><td></td><td></td></tr> tóxico y altamente inflamable <tr><td>Pentano Isso</td><td>Merk</td><td>1060561000</td><td>reactivo; Precaución - altamente inflamable</td></tr><tr><td>Power SYBR&reg; Green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>anti-ratón CD31 Reactivo</td> de <td></td><td>550274 Pharmingen</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro kit Qiagen</td><td></td><td>74004</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Surgic-Pro 6.0</td><td>Medtronic (Coviden)</td><td>VP733X</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidasa, IgG de rata)</td><td>Kit Vectastain ABC; Vector Laboratories</td><td>PK-4004</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td><td>Medtronic (Covidien)</td><td>UL202/ UL101</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>Zeiss PALM Sistema de microdisección láser MicroBeam</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Alemania</td><td>1023290916</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Microscopio estereotámico</td><td>Carl Zeiss Microscopía, Alemania</td><td></td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Linux</td><td></td><td>instrumento</td></tr></tbody></table>

evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

La isquemia crítica de las extremidades (CLI) es una afección grave que implica un alto riesgo de amputación de las extremidades inferiores. A pesar de que la revascularización es la terapia estándar de oro, un número considerable de pacientes con CLI no son adecuados para la revascularización quirúrgica o endovascular. Las terapias angiogénicas están emergiendo como una opción para estos pacientes, pero actualmente todavía están bajo investigación. Antes de su aplicación en humanos, estas terapias deben probarse en modelos animales y sus mecanismos deben entenderse claramente. Un modelo animal de isquemia de la extremidad posterior (HLI) se ha desarrollado por la ligadura y la escisión de las arterias y venas externas lílicas y femorales en ratones. Se reunió un panel completo de pruebas para evaluar los efectos de la isquemia y las terapias angiogénicas putativas a nivel funcional, histológico y molecular. Laser Doppler se utilizó para la medición de flujo y la evaluación funcional de la perfusión. La respuesta del tejido se evaluó mediante el análisis de la densidad capilar después de la tinción con el anticuerpo anti-CD31 en secciones histológicas del músculo gastrocnemius y mediante la medición de la densidad colateral del vaso después de la diofonización. La expresión de genes angiogénicos se cuantificó mediante RT-PCR dirigido a factores angiogénicos seleccionados exclusivamente en células endoteliales (CE) después de la microdisección de captura láser de los músculos gastrocnemius ratones. Estos métodos fueron sensibles a la hora de identificar las diferencias entre las extremidades isquémicas y no isquémicas y entre las extremidades tratadas y no tratadas. Este protocolo proporciona un modelo reproducible de CLI y un marco para probar terapias angiogénicas.

Utilizando el protocolo descrito, las células madre mesenquimales del cordón umbilical y la radiación ionizante de dosis baja (LDIR) se probaron como terapias angiogénicas putativas 11,12. Las lecturas de perfusión doppler láser se obtuvieron antes de la inducción de la isquemia y en los plazos especificados previamente que van desde inmediatamente después de la inducción de la isquemia hasta 45 días después de la isquemia. Las lecturas de perfusión de tejido por...

Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

El objetivo general de este experimento, nuestro modelo de isquemia de la extremidad posterior es iluminar el experimento una base para una evaluación integral de los efectos funcionales, histológicos y moleculares de los agentes angiogénicos putativos. Este protocolo tiene un estándar para el ensayo de posibles terapias angiogénicas en un modelo animal pequeño con potencial para futuras aplicaciones en el contexto clínico. Como la revascularización no es adecuada en el veinte al treinta por ciento de los pacientes críticos de isquemia, la angiogénesis terapéutica ha surgido como una nueva estrategia para mejorar la profusión de sangre en el sitio isquémico.Este protocolo experimental podría proporcionar una comprensión integral de los mecanismos por los cuales las terapias angiogénicas ejercen sus efectos en la medida de su eficacia en cada uno de sus resultados. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un C57 negro de 22 semanas de edad, afeitar el cabello de la extremidad posterior derecha y asegurar el animal en la posición dorsal a cubito en una almohadilla calentada. Coloque al animal bajo un microscopio de disección.Y usa una hoja de bisturí quirúrgico númer

assessing-therapeutic-angiogenesis-murine-model-hindlimb

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Comience con una rata sometida a la oclusión de la arteria cerebral media, un procedimiento quirúrgico que bloquea temporalmente el flujo sanguíneo al tejido cerebral.Esto induce un accidente cerebrovascular isquémico, lo que provoca daño en el tejido cerebral.A continuación, elimine la obstrucción para restaurar el flujo sanguíneo.Seleccione ratas que exhiban déficits neurológicos para garantizar la relevancia del estudio.Luego, administre el medicamento de prueba al grupo experimental...

Evaluación de los efectos angiogénicos de un fármaco de prueba en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

Demostramos un nuevo modelo ligadura arterial en el músculo spinotrapezius murino, incluyendo un procedimiento paso a paso y la descripción de la instrumentación requerida. Se describe la cirugía y las medidas de resultado relevantes relacionados con la remodelación de la red vascular y vasodilatación funcional utilizando microscopía intravital y confocal.

Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

Osmótica Drug Delivery de miembros posteriores isquémicos y la perfusión de la vasculatura con Microfil para Micro-tomografía computarizada

Se describe el método de las células madre de programación para sobreexpresar factores terapéuticos para la angiogénesis usando nanopartículas poliméricas biodegradables. Procesos descritos incluyen la síntesis de polímeros, la transfección de células madre derivadas de tejido adiposo in vitro, y la validación de la eficacia de las células madre programado para promover la angiogénesis en un modelo de isquemia de las extremidades posteriores murino.

Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

La inducción quirúrgica de la isquemia de las extremidades posteriores en el ratón es útil para examinar la angiogénesis, sin embargo, esto se ve comprometido en ciertas cepas endogámicas de ratón que muestran una marcada necrosis tisular inducida por la isquemia. Se describen métodos para inducir isquemia subaguda de las extremidades utilizando constrictores ameroides, para eludir este problema mediante la inducción de una oclusión arterial gradual.

Los métodos para aguda y subaguda murino de isquemia del miembro posterior

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Describimos un procedimiento quirúrgico utilizado para inducir isquemia periférica en conejos con hiperlipidemia y diabetes. Esta cirugía actúa como un modelo preclínico para afecciones experimentadas en la enfermedad arterial periférica en pacientes. La angiografía también se describe como un medio para medir la magnitud de la isquemia introducida y la recuperación de la perfusión.

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.

Imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie en un modelo de gangrena de extremidades posteriores murinas

Aprenda a evaluar la angiogénesis terapéutica en un modelo de isquemia de extremidades posteriores en ratones. Este protocolo permite analizar efectos funcionales, histológicos y moleculares de agentes angiogénicos con potencial aplicación clínica.

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

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