Name: Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende a detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de ratón y leucemia mediante citometría de flujo multiparamétrica. Este método evalúa manipulaciones genéticas y proporciona información sobre el estado redox celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la Junta Directiva del Centro Oncológico Fox Chase (DDM), el American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) y el Department of Defense (Premio: W81XWH-18-1-0472).

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en Fox Chase Cancer Center.
NOTA: El flujo de trabajo del protocolo se divide en 4 partes como se presenta en la Figura 1 y los reactivos necesarios se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Aislamiento de médula ósea (BM)
NOTA: Se generaron ratones de leucemia MLL-AF9 como se describió anteriormente11.
<ol><li>Recuperar células de médula ósea mononuclear, como se describió anteriormente12,13,14,15, de ratones salvajes tipo C57.Bl6 (que expresan el marcador congénico CD45.2) así como de C57. Ratones Bl6-SJL (que expresan el marcador congénico CD45.1) que han sido trasplantados con células de leucemia mLL-AF9 que expresan (CD45.2+). NOTA: BM se puede recuperar de ratones ya sea triturando12,13 o mediante el lavado de huesos14,15. Para los experimentos presentados aquí, BM se recuperó de ratones sanos y de leucemia a través del lavado.</li>
</ol>2. Estaño de tinte fluorogénico ROS mitocondrial
<ol><li>Una vez que las células de médula ósea mononuclear es recuperadas de ratones sanos y/o leucemia, manchan una alícuota de células con Trypan Blue y cuentan usando un hemocitómetro para determinar el número inicial de células BM totales.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en F-PBS (PBS complementado con 2% de suero bovino fetal y un cóctel de penicilina/estreptomicina al 1%) a una concentración de 2 x 106 células/ml.</li>
	<li>Aliquot 200 l de suspensión celular por tubo en 9 tubos de control monocolor etiquetados de la siguiente manera: Sin manchas, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (solo para HSCCP sanos), CD45.2-APC (solo para células de leucemia), CD34-FITC, tinte ROS mitocondrial y mancha de células vivas/muertas. NOTA: (Opcional) Se puede preparar un control positivo para la inducción de ROS mitocondrial mediante el tratamiento de 2 x 105 células en 200 ol con 20 m de bisulfito de sodio de menadiona (MSB) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%. Se puede preparar un segundo control para revertir la inducción mediada por MSB de ROS mitocondrial mediante el tratamiento de 2 x 105 células en 200 oL con 20 m de MSB más 100 m de N-acetil-L-cisteína (NAC) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.</li>
	<li>Alícuota las células restantes en un tubo (tubo experimental) y centrífuga a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspenda las células en F-PBS con una mancha de células vivas/muertas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. Asegúrese de añadir una mancha viva/muerta al tubo de control de un solo color.</li>
	<li>Añadir 1,0 ml de temperatura ambiente (RT) F-PBS a tubos de un solo color y experimentales teñidos con el tinte vivo/muerto. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.</li>
	<li>Resuspenda 50 g del tinte ROS mitocondrial en 13 sulfóxido de dimetil (DMSO) para obtener una solución de stock de 5 mM.</li>
	<li>Diluir el tinte ROS mitocondrial a una concentración final de 5 m en RT F-PBS con o sin Verapamil (50 oM).</li>
	<li>Aspirar el lavado de la mancha de células vivas/muertas. Añadir 200 l de mancha de tinte ROS mitocondrial que contiene Verapamil a cada tubo experimental, así como el tubo de control mitocondrial ROS de un solo color.</li>
	<li>Vórtice para mezclar e incubar durante 10 min a 37oC en la oscuridad.</li>
	<li>Añadir 1,0 ml de RT F-PBS al control mitocondrial de un solo color teñido de ROS y tubos experimentales. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y lavar las células con 1,0 ml adicionales de RT F-PBS. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.</li>
</ol>3. Lineage Anticuerpo Staining
<ol><li>Preparar los cócteles de anticuerpos enumerados en la Tabla 1. NOTA: Estos cócteles antianticuerpos han sido optimizados anteriormente14,15,16.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante del lavado final de tinte ROS mitocondrial de los tubos experimentales que contienen BM saludable y añadir 200 l de cóctel de anticuerpos #1 a cada tubo. Vórtice para mezclar. También prepare los tubos de control de un solo color. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante del lavado final de tinte ROS mitocondrial de los tubos experimentales que contienen leucemia BM y añadir 200 l del cóctel de anticuerpos #2 a cada tubo. Vórtice para mezclar. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar con 1,0 ml de F-PBS frío y centrífuga 5 min a 300 x g a RT.</li>
	<li>Resuspenda las células en 500 ml de F-PBS frío y filtre las células en un tubo de citómetro de flujo utilizando un filtro de 40 m para excluir agregados.</li>
</ol>4. Adquisición y Análisis de Citometría de Flujo
NOTA: Varios subconjuntos hematopoyéticos del tallo y del progenitor son raros, como las células madre hematopoyéticas a largo plazo. Por lo tanto, idealmente se deben recolectar 3-5 millones de eventos para cada tubo experimental durante la adquisición de citometría de flujo para un análisis suficiente de ROS mitocondrial en los diversos subconjuntos de HSPC.
<ol><li>Utilice el tubo de control sin manchas para establecer las gráficas de dispersión hacia adelante (FSC-A) y lateral (SSC-A) en función del tamaño y la complejidad de la población celular analizada.</li>
	<li>Utilice los tubos de control sin manchas y de un solo color para compensar el citómetro de flujo.</li>
	<li>Salida de escombros extraños de la gráfica de dispersión hacia adelante y lateral(Figura 2A,B,primer panel desde la izquierda).</li>
	<li>Salida de dobletes utilizando un doble discriminador como el discriminador hacia adelante(Figura 2A,B, segundo panel de la izquierda).</li>
	<li>Siga la estrategia de gating propuesta en la Figura 2A,B para seleccionar células vivas, linaje de células bajas y los diversos subconjuntos de HSPC y leucemia.</li>
	<li>Para cada población de interés, analice la intensidad media de fluorescencia (IMF) del canal TRPE (eje X) en una gráfica de histograma para evaluar las diferencias en la señal ROS mitocondrial(Figura 3A-C,paneles izquierdos). Los niveles de ROS mitocondrial se pueden evaluar a nivel de una sola célula comparando la tinción de ROS mitocondrial frente a marcadores de linaje específicos en una gráfica de dispersión.</li>
</ol>

<ol><li>Dröse, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li>
<li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li>
<li>Höhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happily+%28n%29ever+after%3A+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress%2C+proteostasis+loss+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li>
<li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+inflammation%2C+and+cancer%3A+how+are+they+linked%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li>
<li>Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+cell+state+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of cell state and fate.</a> Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).</li>
<li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li>
<li>Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+reactive+oxygen+species+play+a+role+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias.</a> Blood. 117, 5816-5826 (2011).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Di Marcantonio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+Epsilon+Is+a+Key+Regulator+of+Mitochondrial+Redox+Homeostasis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).</li>
<li>Glasauer, A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+antioxidants+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Targeting antioxidants for cancer therapy.</a> Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).</li>
<li>Kalaitzidis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+complex+1+plays+critical+roles+in+hematopoiesis+and+Pten-loss-evoked+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT%2FFOXO+signaling+enforces+reversible+differentiation+blockade+in+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias.</a> Cell. 146 (5), 697-708 (2011).</li>
<li>Kalaitzidis, D., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+phosphoprotein+analysis+reveals+agonist+and+temporal+differences+in+responses+of+murine+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 3 (11), 3776(2008).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+flt3+within+the+mouse+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment.</a> International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functional+distinct+sub-populations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-side-population+hematopoietic+stem+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow.</a> Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Somervaille, T. C., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
<li>Hao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+Reveals+a+Unique+Preference+of+Symmetric+Cell+Division+and+Homing+of+Leukemia-Initiating+Cells+in+an+Endosteal+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los colorantes fluorogénicos que se han desarrollado para la detección de ROS se evalúan con frecuencia en células fijas mediante microscopía o en células vivas mediante citometría de flujo22. La evaluación citométrica de flujo de ROS mitocondrial en células BM utilizando colorantes fluorogénicos MItocondrial es ROS tiene dos ventajas principales: 1) Es una técnica rápida y sencilla que es adecuada para el análisis de células vivas y 2) permite distinguir y analizar raras poblaciones a nivel de un...

Las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) son moléculas altamente reactivas derivadas del oxígeno molecular. La ubicación celular más bien definida de la producción de ROS es las mitocondrias, donde los electrones que pasan a través de la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la fosforilación oxidativa (OXPHOS) son absorbidos por el oxígeno molecular que conduce a la formación de un específico tipo de ROS llamado superóxidos1. A través de las acciones de una serie de enzimas, llamadas dismutas de superóxido o SOD, los superóxidos se convierten en peróxidos de hidrógeno, que posteriormente son neutralizados en agua por enzimas como la catalasa o glutatión peroxidasas (GPX). Las perturbaciones en los mecanismos reguladores de ROS pueden conducir al exceso de producción de ROS, a menudo conocido como estrés oxidativo, que tienen consecuencias celulares dañinas y potencialmente letales como daño a macromoléculas (es decir, ADN, proteínas, lípidos). Además, el estrés oxidativo está relacionado con varias patologías, como diabetes, enfermedades inflamatorias, envejecimiento y tumores2,3,4. Para mantener la homeostasis redox y prevenir el estrés oxidativo, las células poseen una variedad de mecanismos reguladores de ROS5.
Los niveles fisiológicos de ciertos ROS son necesarios para la hematopoyesis embrionica y adulta adecuada6. Sin embargo, el exceso de ROS se asocia con daño al ADN, diferenciación celular y agotamiento del tallo hematopoyético y la piscina de progenitoras. También hay evidencia de que las alteraciones en la biología redox pueden diferir entre la leucemia y las células sanas. Por ejemplo, los niveles de ROS tienden a ser más altos en las células de leucemia mieloide aguda (LMA) en relación con sus contrapartes sanas y otros estudios han sugerido que las células madre de la leucemia mantienen un bajo nivel de estado estacionario de ROS para la supervivencia7,8. Es importante destacar que las estrategias para capitalizar terapéuticamente estas diferencias redox han demostrado ser prometedoras en varios entornos de cáncer humano9,10. Por lo tanto, los ensayos que permiten la evaluación de los niveles de ROS en los modelos de ratón pueden mejorar nuestra comprensión de cómo estas especies contribuyen a la fisiología celular y la patogénesis de la enfermedad, así como potencialmente proporcionar una plataforma para evaluar la eficacia de nuevas terapias contra el cáncer dirigidas al redox.

<table><tbody><tr><td>Inactivado por calor FBS</td><td>VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Medios Penicilina Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>Medios</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico</td><td>BD falcon</td><td>352096</td><td>Suministros de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>50 mL tubo cónico</td><td>BD falcon 352098</td><td></td><td>Tissue Suministros de Cultura</td></tr><tr><td>40 &mu; Filtros de células M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547 Suministros de</td><td>cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tampón de lisis RBC</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-9751 Suministros de</td><td>cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Menadiona bisulfito de sodio</td><td>Sigma aldrich</td><td>M5750</td><td>Prooxidante</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma aldrich</td><td>A7250</td><td>Antioxidante</td></tr><tr><td>CD3 clon PE-Cy5 145-2c11</td><td>Biolegend</td><td>100310</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>CD4 clon de PE-Cy5 RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD8 clon de PE-Cy5 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD19 clon de PE-Cy5 6D5</td><td>Biolegend</td><td>115510</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>B220 PE-Cy5 clon RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Gr1 PE-Cy5 RB6-8C5</td><td>Anticuerpo</td> <td>Biolegend</td><td>108410</td></tr><tr><td>Ter119 clon de PE-Cy5 Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD48 clon de PE-Cy5 HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD117&nbsp; clon APC-Cy7 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105825</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Sca1 Peacific Clon azul D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD150 Clon de APC TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD34 FITC clon RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>CD45.2 APC 104</td><td>Biolegend</td><td>1098313</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>MitoSOX Tinte rojo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Tinte verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Tinte</td></tr><tr><td>amarillo vivo/muerto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34967</td><td>Tinte</td></tr></tbody></table>

análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por mll-af9

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Presentamos un enfoque citométrico de flujo para analizar la ROS mitocondrial en varias poblaciones de células madre y progenitoras derivadas de médula ósea viva (BM) de ratones sanos, así como ratones con LMA impulsados por MLL-AF9. Específicamente, describimos un proceso de tinción celular de dos pasos, por el que las células BM sanas o leucemias se tiñen primero con un tinte fluorogénico que detecta superóxidos mitocondriales, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales vinculados al fluorocromo que se utilizan para distinguir varias poblaciones de progenitores hematopoyéticos sanos y malignos. También proporcionamos una estrategia para adquirir y analizar las muestras por citometría de flujo. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en un período de tiempo tan corto como 3-4 h. También destacamos las variables clave a tener en cuenta, así como las ventajas y limitaciones de la monitorización de la producción de ROS en el compartimiento mitocondrial de las subpoblaciones de tallo y progenitores hematopoyéticos vivos y de leucemia utilizando colorantes fluorogénicos por citometría de flujo . Además, presentamos datos de que la abundancia de ROS mitocondrial varía entre subpoblaciones de HSPC sanas distintas y progenitores de leucemia y analizamos las posibles aplicaciones de esta técnica en la investigación hematológica.

Presentado es un método para analizar la ROS en las mitocondrias de múltiples poblaciones de progenitores de leucemia sanas y mLL-AF9. La Figura 1 muestra una vista esquemática del flujo de trabajo del protocolo, que consta de 4 pasos principales: 1) aislamiento BM de ratones; 2) Manchación de células BM con un tinte fluorogénico que reconoce ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) Tinción de anticuerpos de marcador de superficie para delinear varias poblaciones hematopoyéticas san...

Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Especies reactivas de oxígeno o ROS, son especies de oxígeno altamente reactivas que son producidas por las células, e influye en su comportamiento. Aunque el exceso de ROS también puede causar estragos celulares generalizados, y en casos graves, la muerte celular. Por lo tanto, el mantenimiento de la homeostasis ROS es de importancia fundamental para la función celular y la supervivencia.El protocolo presentado aquí, se centra en la medición de un tipo específico de ROS, que es generado por las mitocondrias, principalmente como un subproducto metabólico en poblaciones de tallos y células promatopoyéticas vivos, normales o saludables, así como en células de leucemia del modelo de ratón de cáncer sanguíneo, leucemia mieloide aguda o LMA. Este protocolo también se puede utilizar para evaluar cómo la manipulación genética, como la deleción de genes o la sobreexpresión, afecta la ROS mitocondrial en varias poblaciones hematopoyéticas sanas y malignas. Y como resultado, potencialmente proporcionar información perspicaz sobre el estado de redux y posiblemente el metabolismo de las células.Esta técnica autoriza el análisis métrico de asentamiento de flujo de una sonda protogénica para monitorear la producción de ROS mitocondrial en subpopoyéticas y tallos hematopoyéticos vivos sanos y malignos y subpoblaciones progenitoras. Este protocolo es sencillo y se puede completar en unas horas. Además, es adecuado para el análisis de células vivas y permite distinguir y analizar ROS mitocondrial en la población de células madre en la médula ósea, utilizando la marca superficial de tinción.Después de recoger células mononucleares de médula ósea de ratones estrechos salvajes y ratones leucémicos MLL-AF9, según el manuscrito, aliquot 200 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los nueve tubos de control de color único. Aliquot las células restantes en otros tubos experimentales, 200 microlitros cada uno. Luego coloque en una centrífuga dos tubos experimentales que contienen células de médula ósea y células leucémicas respectivamente, y un tubo de control.Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos. A continuación, decantar el sobrenadante, y volver a suspender las células a temperatura ambiente F-PBS con una mancha de célula viva / muerta, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar sobre hielo durante 30 minutos.Después, agregue 1 mililitro de temperatura ambiente F-PBS a los tres tubos manchados vivos/muertos, y un solo tubo de control de color para la tinción de tinte ROS mitocondrial. Coloque los tubos en la centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, obtenga una solución de material de colorante ROS mitocondrial de 5 milimolar mediante la suspensión de 50 microgramos de colorante ROS mitocondrial en 13 microlitros de DMSO.A continuación, añada 13 mililitros de F-PBS a temperatura ambiente al tinte ROS mitocondrial de 13 microlitros para diluir a una concentración final de cinco micromolares. Si es necesario, agregue 13 microlitros de 50 verapamilos mililares a la solución para inhibir las bombas de eflujo mitocondrial. Obtener los tubos de la centrífuga y aspirar el lavado de la mancha de células vivas / muertas.Agregue 200 microlitros de F-PBS en el control de tinción vivo/muerto y manténgalo en hielo hasta que esté listo para iniciar el análisis. Añadir 200 microlitros de la mancha de tinte ROS mitocondrial que contiene Verapamil, a cada tubo experimental, así como el tubo de control de tinción ROS mitocondrial. Vórtice para mezclar e incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad.A continuación, agregue 1 mililitro de temperatura ambiente F-PBS al control y tubos experimentales. Centrifugar cinco minutos a 300 veces G a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con un mililitro adicional de temperatura ambiente F-PBS.Centrifugar de nuevo durante cinco minutos a 300 veces G, a temperatura ambiente. En primer lugar, preparar dos cócteles de anticuerpos para las células de médula ósea sanas y de leucemia. Aspirar el sobrenadante del tubo experimental que contiene células sanas de la médula ósea, y añadir 200 microlitros del cóctel de anticuerpos número uno al tubo.Vórtice para mezclar. También prepare los tubos de control de color único añadiendo 200 microlitros de F-PBS y un microlitro del anticuerpo correspondiente. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.Aspirar el sobrenadante del tubo experimental que contiene la médula ósea de la leucemia, y añadir 200 microlitros del cóctel de anticuerpos número dos, al tubo. Vórtice para mezclar. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.Después de eso, lave todos los tubos con 1 mililitro de F-PBS frío y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces G a temperatura ambiente. Re-suspenda las células en 500 microlitros de F-PBS frío. Transfiera la suspensión celular a cada tubo de citometro de flujo con un filtro de 40 micrómetros para excluir agregados.En primer lugar, inserte un tubo de control de manchas en la máquina de citometría de flujo e inicie la adquisición para compensar la máquina de citometría de flujo. Repita el procedimiento para otros tubos de control. Después, lea los tubos experimentales para instalar las puertas.Para analizar el tamaño y la complejidad de la población celular, primero para HSPC sano, establezca el área de dispersión hacia adelante y las poblaciones de área de dispersión lateral. Pulse el botón Puerta cuadrada para alejar los escombros extraños de la gráfica de dispersión hacia adelante y lateral. A continuación, en un área de dispersión hacia delante y una gráfica de altura, utilice un doble discriminador para eliminar dobles.Seleccione celdas vivas, células bajas de linaje y los diversos HSPC sanos. Para cada población de interés, analice la intensidad media de fluorescencia del canal TRPE en una gráfica de histagrama, para evaluar las diferencias en la señal ROS mitocondrial. Repita el mismo procedimiento de análisis de tamaño, medición e histograma de trazado para poblaciones de leucemia.Las células de médula ósea aisladas de ratones sanos se tiñeban con un tinte vivo/muerto y un tinte ROS mitocondrial, y posteriormente se tiñeban con anticuerpos que reconociendo los marcadores de linaje: además de CD48, C-kit, Sca-1, CD34 y CD150. Además, las células de médula ósea de ratones con leucemia también fueron teñidas con CD45.2 para discriminar entre las células de leucemia MLL-AF9 de células de médula ósea receptoras sanas teñidas con CD45.1. Una comparación de la tinción de ROS mitocondrial, entre el LSK negativo CD48 saludable y los progenitores mieloides, muestra que los progenitores mieloides muestran niveles significativamente más altos de tinción DE ROS mitocondrial.Además, los progenitores de alta leucemia de c-Kit muestran niveles significativamente más altos de tinción DE ROS mitocondrial, en comparación con las células intermedias de leucemia baja c-Kit, LSK negativo CD48 saludable y progenitores mieloides. Células intermedias de leucemia baja de C-Kit, también mostraron un valor significativamente mayor en comparación con las células LSK negativas CD48, pero no a los progenitores mieloides. Los tintes ROS mitocondriales son altamente reactivos y se necesitan pasos de lavado adecuados para asegurarse de que se ha eliminado cualquier exceso del tinte antes de comenzar los siguientes pasos.Hay varios tintes fluorogénicos ROS químicamente distintos que se pueden utilizar en este protocolo, para lograr un poco de conocimiento del estado de redux en células hematopoyéticas vivas. Esta técnica se ha utilizado ampliamente en la literatura, y puede proporcionar información útil sobre las vías metabólicas y de señalización que se regulan diferencialmente en las células de leucemia, si se compara con sus homólogos normales.

flow-cytometric-analysis-mitochondrial-reactive-oxygen-species-murine

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Este manuscrito proporciona un procedimiento técnico que puede ser utilizado para caracterizar los cultivos de células C1498 in vitro y la leucemia aguda inducida en ratones después de su inyección. Los análisis fenotípicos y funcionales se realizan mediante citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, y la tinción citoquímica de May-Grünwald Giemsa.

Un protocolo detallado para la caracterización de la línea celular murina C1498 y su modelo asociado de leucemia de ratón

Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.

Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo

Aquí describimos un método confiable para medir la masa mitocondrial y el potencial de membrana en células madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo y células T.

Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

Aprende a detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de ratón y leucemia mediante citometría de flujo multiparamétrica. Este método evalúa manipulaciones genéticas y proporciona información sobre el estado redox celular.

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9 (Video) | JoVE Journal

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

Explorar más videos