Name: Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda el trasplante de bazo vascularizado en ratón para estudiar dinámica de células esplénicas e inmunidad. Este modelo permite rastrear el destino y la función de las células del bazo en enfermedades inflamatorias.

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Los autores agradecen el centro integral de trasplantes de Northwestern University y el programa de núcleos de investigación de Medicina Feinberg para apoyo de recursos y financiamiento. Concretamente, la citometría de flujo y los servicios de histología fueron proporcionados por el centro de citometría de flujo de la Universidad Northwestern y el laboratorio de histología y fenotipos de ratones, respectivamente, ambos apoyados por el NCI P30-CA060553 otorgado al Robert H Centro de cáncer integral de Lurie. Agradecemos al Sr. Nate Esparza la revisión de este manuscrito.

Todos los procedimientos y el uso de animales en este estudio se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité interno de cuidado y uso de animales de la Universidad del noroeste (IACUC). En este estudio, de 8 a 10 semanas de edad, CD 45.2 y CD 45.1 ratones (tanto en el fondo BALB/c, del laboratorio Jackson) se utilizaron como donantes de bazo y receptores, respectivamente, para crear modelos de trasplante de bazo singénico. Todos los animales fueron alojados en el ambiente estéril en las instalaciones de animales de la Universidad de Northwestern. El lubricante ocular se aplicó a todos los ratones después de la anestesia para prevenir la sequedad.
1. preparación quirúrgica, anestesiación, y régimen de analgesia
<ol><li>Coloque un paño desechable estéril (45,7 cm x 66 cm) en la plataforma quirúrgica. Agarrar suavemente el ratón, inyectar ketamina (50 mg/kg) y xylazina (10 mg/kg) intraperitonealmente (i. p) para la anestesia, e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia.</li>
	<li>Asegure la profundidad de la anestesia con un pellizco, afeite el cabello en toda la zona del abdomen con una cuchilla y coloque el ratón sobre la plataforma quirúrgica estéril bajo el microscopio de operación a una magnificación de 6-10X.</li>
</ol>2. cosecha del bazo del donante
<ol><li>Esterilizar el abdomen con una almohadilla de preparación de alcohol, asegurar las extremidades con cinta quirúrgica, y hacer una incisión de la piel vertical de 3-4 cm de línea media desde el pubis al proceso Apéndice xifoides con tijeras.</li>
	<li>Retracción de la pared abdominal con retractores estériles hechos de clips de papel. Mueva los intestinos hacia el flanco derecho del abdomen (izquierda del cirujano) con un bastoncillo de algodón estéril para exponer el bazo. Cauterizar la vena gástrica corta unida al bazo con un cauterio estéril de baja temperatura (figura 1A). Coloque un pedazo de gasa estéril empapada con una solución salina de 37 ° c sobre el bazo para mantenerla húmeda (figura 1B).</li>
	<li>Separar y movilizar la vena porta del tejido pancreático (figura 1C) ligando las ramas de la vena porta (vena pancreática superior y vena gástrica derecha); colocar una sutura alrededor de la vena porta distal de la vena esplénica (Figura 1D).</li>
	<li>Voltear el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta y el tronco celiaco con la arteria esplénica (Figura 1E). Diseccionar y movilizar arteria aórtica-celiaca-esplénica ligando la arteria hepática y la arteria gástrica; colocar una sutura alrededor de la aorta proximal a la Arteria celíaca (Figura 1F-G).</li>
	<li>Inyectar 100 unidades internacionales (UI) de heparina en la vena cava inferior (IVC) para heparinizar todo el cuerpo y esperar 3 min para asegurar que la heparina tenga efectos. Ligate la aorta proximal a la arteria celiaca, transecciona la vena porta, y luego perfuca todo el cuerpo usando 10 mL de solución salina heparinizada (4 ° c) (10 mL/20 s) desde la aorta abdominal distal hasta el tronco celiaco (figura 1H).</li>
	<li>Recoger el injerto de bazo en bloque con el segmento aórtico-celiaco-esplénica asociado y la vena porta junto con un segmento de vena esplénica y una pequeña porción de tejido pancreático. Conservar el injerto en 5 mL de solución salina a 4 ° c antes del trasplante. Eutanasia al ratón por dislocación cervical.</li>
</ol>3. implantación de la esplenectomía del receptor y del injerto del bazo
<ol><li>Coloque una almohadilla térmica en la plataforma quirúrgica y ajuste la temperatura a 37 ° c. Coloque un paño estéril (45,7 cm x 66 cm) en la parte superior de la almohadilla térmica para crear una plataforma quirúrgica estéril. Repita los pasos 2,1 y 2,2 para la preparación quirúrgica y la anestesia. Haga una incisión de la línea media de 3-4 cm y retracto la pared abdominal como se describe en el paso 2,1 y el paso 2,2.</li>
	<li>Mueva con cuidado el intestino al lado derecho del ratón con un bastoncillo de algodón estéril para exponer el bazo del receptor. Ligate la vena esplénica y la arteria y retira el bazo.</li>
	<li>Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del ratón y cubra los intestinos con gasa húmeda (empapado con solución salina estéril de 37 ° c). Diseccionar y ligar las ramas lumbares de la aorta infrarrenal y la IVC; abrazadera cruzada de la aorta infrarrenal y de la IVC mediante el uso de dos abrazaderas microvasculares de 4 mm.</li>
	<li>Colocar una sutura de nylon 11-0 a través de la aorta infrarrenal (un espesor completo) y retraer para crear una aortotomía elíptica por un solo corte con microtijeras (la longitud debe coincidir con el diámetro de la aorta donante, figura 2A). Perforar la IVC usando una aguja de 30 G para crear una venotomía elíptica y extender la abertura a la longitud de la vena del portal del donante usando microtijeras (figura 2A).</li>
	<li>Eliminar la sangre intraluminal o el coágulo sanguíneo (en la aorta y la IVC) con 500 μL de solución salina heparinizada (10 unidades/mL).</li>
	<li>Coloque el injerto de bazo en el flanco derecho del abdomen del receptor del ratón; Identifique cuidadosamente el manguito aórtico del donante y la vena porta del donante. Después de asegurarse de que los recipientes no están retorcidos, cubra el injerto de bazo con gasa empapada con suero salino frío (4 ° c).</li>
	<li>Conecte el manguito aórtico del donante al ápice proximal y distal de la aortatomía del receptor con dos suturas de estancia (11-0 sutura de nylon, igual que la siguiente) (figura 2B, C). Haga una anastomosis con 2-3 picaduras de suturas continuas de nylon 11-0 entre el manguito aórtico del donante y la aortatomía del receptor (pared anterior) (Figura 2D). Gire el injerto de bazo hacia el lado izquierdo del receptor; hacer la anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la aortotomía del receptor (pared posterior) (Figura 2E).</li>
	<li>Realizar una anastomosis para conectar la vena porta del donante a la pared posterior de la IVC del receptor, utilizando de 4 a 5 picaduras de suturas continuas en el interior de la IVC y luego cerrar la sutura en el exterior de la IVC (figura 2F, G).</li>
	<li>Suelte las abrazaderas del recipiente y use un hisopo de algodón estéril para tapar el sangrado hasta que se recupere el color del bazo (figura 2H).</li>
	<li>Cerrar el abdomen con una sutura de vicryl sintética absorable 5-0 en un patrón continuo. Cierre la capa de piel con una sutura de nylon 5-0 en un patrón interrumpido. Nota: Para los pasos 4.7-4.8, alternativamente, haga una anastomosis entre la vena porta del donante y la IVC del receptor primero (paso 4,8); luego hacer una anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía del receptor, usando de 2 a 3 suturas continuas en el interior de la aorta y cerrar la sutura en la parte exterior de la aorta.</li>
</ol>4. recuperación de animales
<ol><li>Inyectar 1 mL de solución salina tibia por vía subcutánea a través de 4 lugares separados (0,25 mL/ubicación) después de cerrar el abdomen.</li>
	<li>Mantenga el ratón en una incubadora de temperatura controlada (30 ° c) durante las primeras horas posteriores a la operación, supervise el ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente y, a continuación, transfiera el ratón a una nueva jaula limpia con alimentos y agua regulares, con una almohadilla térmica (30 ° c ) debajo de la jaula. Mantenga el ratón después de la cirugía en una jaula separada.</li>
</ol>5. manejo del dolor post-quirúrgico
<ol><li>Inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina subcutáneamente 24 h y 48 h después de la cirugía para mantener el régimen de analgesia.</li>
</ol>

<ol><li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the spleen.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
<li>Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laparoscopic+splenectomy%3A+Current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastrointestinal+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Laparoscopic splenectomy: Current concepts.</a> World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).</li>
<li>Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+risks+after+splenectomy+among+8%2C149+cancer-free+American+veterans%3A+a+cohort+study+with+up+to+27+years+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up.</a> Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).</li>
<li>Thai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+complications+of+splenectomy+in+adult+immune+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia.</a> Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098(2016).</li>
<li>Sinwar, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overwhelming+post+splenectomy+infection+syndrome+-+review+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study.</a> International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).</li>
<li>Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+cardiovascular+events+and+pulmonary+hypertension+following+splenectomy+-+a+Danish+population-based+cohort+study+from+1996-2012%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012.</a> Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).</li>
<li>Crary, S. E., Buchanan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+complications+after+splenectomy+for+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders.</a> Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).</li>
<li>Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+spleen+autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Innovation%22%5BJournal%5D)">A new technique for spleen autotransplantation.</a> Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).</li>
<li>Holdsworth, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+spleen+and+splenic+autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation.</a> British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).</li>
<li>Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+splenic+tissue+reimplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Royal+College+of+Surgeons+of+England%22%5BJournal%5D)">Complications of splenic tissue reimplantation.</a> Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).</li>
<li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+spleen%3A+effect+of+splenic+allograft+in+human+multivisceral+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation.</a> Annals of Surgery. 246 (3), discussion 445-436 436-444 (2007).</li>
<li>Aronovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+hemophilia+as+a+proof+of+concept+for+treatment+of+monogenic+diseases+by+fetal+spleen+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).</li>
<li>Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenosis%3B+review+and+report+of+subcutaneous+splenic+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+surgery%22%5BJournal%5D)">Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant.</a> Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).</li>
<li>Coburn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Spleen transplantation in the rat.</a> Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).</li>
<li>Lee, S., Orloff, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+splenic+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for splenic transplantation in the rat.</a> Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325 (5940), 612-616 (2009).</li>
<li>Hsiao, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen-derived+classical+monocytes+mediate+lung+ischemia-reperfusion+injury+through+IL-1beta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).</li>
<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
<li>Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+spleen-derived+monocytes%2Fmacrophages+in+acute+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).</li>
<li>Bronte, V., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spleen+in+local+and+systemic+regulation+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The spleen in local and systemic regulation of immunity.</a> Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).</li>
<li>Wang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+macrophages+from+the+spleen+contributes+to+myocardial+fibrosis+and+hypertension+induced+by+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Renin-Angiotensin-Aldosterone+System%22%5BJournal%5D)">Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II.</a> Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653(2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spleen+contributes+importantly+to+myocardial+infarct+exacerbation+during+post-ischemic+reperfusion+in+mice+via+signaling+between+cardiac+HMGB1+and+splenic+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62(2016).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+Check+Your+Mice-A+Point+Mutation+in+the+Ncr1+Locus+Identified+in+CD45.1+Congenic+Mice+with+Consequences+in+Mouse+Susceptibility+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection.</a> Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una evidencia convincente sugiere que los monocitos derivados del bazo desempeñan un papel importante en los procesos inflamatorios estériles como la aterosclerosis19, el cerebro isquémico agudo20 o la lesión pulmonar18, así como la lesión I/R miocárdica y Remodelación21,22,23. Estos informes destacan el papel de subreconocimiento del bazo en muchas enfermed...

El bazo es el órgano linfoide secundario más grande del cuerpo y es crítico en los sistemas inmunológico y hematopoyético. Sus funciones se llevan a cabo principalmente por dos compartimentos morfológicamente distintos, la pulpa roja y la pulpa blanca1. La pulpa roja es una malla tridimensional de senos venosos y cuerdas esplénica que consisten en fibras reticulares, células reticulares y macrófagos asociados. Esta estructura única permite que la pulpa roja actúe como un filtro sanguíneo eficaz que elimina los materiales extraños y los eritrocitos viejos o dañados. La pulpa blanca incluye folículos, zona marginal y vainas linfoides periarteriolares (PALS) y es un sitio importante para la captura y procesamiento de antígeno, el homing de linfocitos, la transformación, la proliferación y la maduración2. Sin embargo, el bazo se ha considerado comúnmente como un órgano prescindible porque otros órganos linfáticos, como los ganglios linfáticos, también pueden llevar a cabo algunas de sus funciones y la pérdida del bazo no suele conducir a la muerte. Por lo tanto, la esplenectomía se ha realizado ampliamente como un método terapéutico para pacientes con lesión esplénica o enfermedades hematológicas benignas3. Sin embargo, los pacientes con esplenectomía enfrentan una serie de complicaciones a largo plazo. Las infecciones bacterianas son las complicaciones mejor reconocidas de la esplenectomía4,5. Recientemente, la abrumadora sepsis post-esplenectomía ha sido reconocida como una complicación intensiva de la esplenectomía asociada a una alta mortalidad6. Por otra parte, estudios epidemiológicos recientes indican que la esplenectomía puede estar asociada a la ocurrencia de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que aún quedan por explorar las funciones fisiológicas del bazo7,8.
En la clínica se han utilizado tanto autotrasplante de bazo como alotrasplante de bazo. Actualmente, el autotrasplante de bazo mediante la implantación de secciones de tejido esplámico en bolsas creadas en el epiplón mayor se considera como la única posibilidad para preservar la función esplénica después de la esplenectomía traumática9,10. Sin embargo, la eficacia de esta cirugía es discutible como complicaciones post-cirugía como necrosis aséptica del tejido esplémico y la obstrucción del intestino delgado debido a adherencias postoperatorias podrían ocurrir11. La alotrasplante de bazo está implicada en el trasplante multivisceral12. La evidencia clínica del trasplante multivisceral sugiere que el alotrasplante de bazo puede desempeñar un papel protector en el rechazo de los aloinjertos intestinales pequeños sin causar enfermedad de injerto contra huésped (EICH)12. Sin embargo, la literatura sobre el efecto beneficioso del alotrasplante de bazo como componente del trasplante multivisceral sigue siendo limitada y los mecanismos subyacentes permanecen por definir. En 2006, Yair Reisner y otros informaron que el trasplante de tejido de bazo embrionario de cerdo que no tiene células T a los ratones podría curar la hemofilia a, una enfermedad genética sin causar la EICH13, apoyando que el transplante de bazo tiene una promesa terapéutica en ciertas enfermedades. Por lo tanto, es necesario seguir investigando sobre el potencial terapéutico del trasplante de bazo.
Los modelos animales de trasplante de bazo son valiosos para explorar la función no apreciada de las células inmunes derivadas del bazo en la progresión de la enfermedad, así como para probar el posible efecto terapéutico del trasplante de bazo. Se han documentado modelos experimentales de trasplantes de bazo enteros desde principios de 1900, según lo revisado por Cohen14. En 1969, Coburn Richard J. y Lee et al. detalló la técnica del trasplante de bazo en ratas15,16. Más recientemente, SWIRSKI FK y otros describieron un modelo de ratón de trasplante de bazo17. En comparación con los modelos de ratas, los modelos de ratones de trasplante de bazo son más atractivos debido a sus diversas ventajas inherentes. Por ejemplo, al utilizar un modelo de ratón, podemos acceder a una amplia variedad de reactivos no disponibles para los modelos de ratas. Por otra parte, mediante el uso de ratones Congénicos (por ejemplo, ratones con CD 45.1/CD 45.2 fondo), un trasplante singénico de bazo hace posible rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos18. Basado en el trabajo de SWIRSKI FK et al.17, también establecimos este protocolo simplificado y mejorado de trasplante de bazo en ratones. El protocolo descrito a continuación combina la confiabilidad y la viabilidad de una manera estandarizada y se puede utilizar como una herramienta para estudiar la biología del bazo y la inmunidad al trasplante.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Wyeth</td><td>206205-01</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Solución de heparina</td><td>Abraxis Productos farmacéuticos</td><td>504031</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina normal de grado de inyección</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Pharmco Products Inc.</td><td></td><td></td>111000140</tr><tr><td>ThermoCare Sistema de UCI para animales pequeños</td><td>Thermocare, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson</td><td>Roboz Instrumentos Quirúrgicos</td><td>RS-5230</td><td></td></tr><tr><td>Derf Portaagujas Roboz</td><td>Instrumentos Quirúrgicos</td><td>RS-7822</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de Micro Disección Extrafinas</td><td>Roboz Instrumentos Quirúrgicos</td><td>RS-5881</td><td></td></tr><tr><td>Micro-clip</td><td>Roboz Instrumentos Quirúrgicos</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>7-0 seda</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 103</td><td></td></tr><tr><td>11-0 nylon en aguja de 4 mm (3/8)</td><td>Sharpoint DR4</td><td>AK-2119</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD45.2 anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>553772</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD45.1 anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>553776</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD11b anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Ms B220 anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>553089</td><td></td></tr><tr><td>Ms Ly6C anticuerpo</td><td>eBioscience</td><td>48-5932-80</td><td></td></tr><tr><td>Ms Ly6G anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>561236</td><td></td></tr><tr><td>Ms F4/80</td><td>anticuerpo BD Bioscience</td><td>565614</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD11c anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>558079</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD3</td><td>anticuerpo eBioscience</td><td>48-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Ms anticuerpo CD4</td><td>BD Bioscience</td><td>552051</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD8 anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD&trade; Kit de manchas de células muertas violeta fijable</td><td>Thermo Fisher</td><td>L34955</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity

El bazo es un órgano linfoide único que desempeña un papel crítico en la la homeostasis de los sistemas inmunológico y hematopoyético. Los pacientes que se han sometido a una esplenectomía, independientemente de las causas desencadenantes, son propensos a desarrollar una infección de post-esplenectomía abrumadora y experimentan un mayor riesgo de trombosis venosa profunda y neoplasias malignas. Recientemente, los estudios epidemiológicos indicaron que la esplenectomía podría estar asociada a la aparición de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que las funciones fisiológicas del bazo aún no se han reconocido plenamente. Aquí, presentamos un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, que no sólo se puede utilizar para estudiar la función y la actividad conductual de los subconjuntos de células inmunitarias esplénica en diferentes procesos biológicos, sino que también puede ser una herramienta poderosa para probar el potencial terapéutico del trasplante de bazo en ciertas enfermedades. Los principales pasos quirúrgicos de este modelo incluyen la cosecha del bazo del donante, la extirpación del bazo nativo receptor y la revascularización del injerto del bazo. Utilizando cepas de ratón Congénicos (p. ej., ratones con fondos de CD 45.1/CD 45.2), observamos que después del trasplante singénico, los linfocitos esplénicos derivados de donantes y las células mieloide migraron del injerto tan pronto como el día 1 postoperatorio, concomitantemente con la afluencia de múltiples tipos de células destinatarias, generando así una quimera única.  A pesar de las técnicas relativamente desafiantes, este procedimiento se puede realizar con > 90% tasa de éxito. Este modelo permite rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos durante el estado estacionario y en un entorno de enfermedad después de un trasplante de bazo, ofreciendo así una gran oportunidad para descubrir el papel distintivo de las células inmunes derivadas del bazo en diferentes procesos de la enfermedad.

Todo el procedimiento de trasplante de bazo de ratón se puede completar dentro de 90 min por microcirujanos experimentados. Nuestro laboratorio ha realizado más de 100 trasplantes de bazo en ratones. La tasa de éxito es más de 90%, como se define por la supervivencia del ratón receptor y el injerto de bazo para el día postoperatorio (POD) 1 o POD 7 (nuestro punto final del estudio). La supervivencia del injerto del bazo fue confirmada por la apariencia macroscópica y el análisis de citome...

Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, un modelo técnicamente desafiante que puede servir como una herramienta poderosa en el estudio del destino y la longevidad de las células del bazo, los mecanismos de distinto bazo las poblaciones celulares en progresión de la enfermedad e inmunidad al trasplante.

Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone ...

El modelo de ratón de trasplante de bazo ofrece una gran oportunidad para descubrir el papel de las células del bazo en la regulación de las respuestas inmunitarias locales y sistémicas en la enfermedad inflamatoria. La principal ventaja de este protocolo es que mediante el uso de ratones congénicos, el trasplante de bazo permite comprobar el destino, la longevidad y la función de las células del bazo. Antes de comenzar el procedimiento, coloque una cortina desechable estéril sobre la plataforma quirúrgica y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del producto en el ratón donante anestesiado.Afeitar el cabello de toda la zona abdominal y colocar el ratón en una plataforma quirúrgica estéril bajo un microscopio operativo a un aumento de 6 a 10X. Esterilice la piel expuesta con una almohadilla de preparación de alcohol y asegure las extremidades con cinta quirúrgica. Introduzca el abdomen a través de una incisión vertical de la piel de tres a cuatro centímetros desde el pubis hasta el proceso de xyfoide.Cauterizar los vasos de la piel y extender la incisión al abdomen lateral en ambos lados para lograr una mejor exposición. Usando un hisopo de algodón estéril, mueva los intestinos hacia el flanco derecho del abdomen para exponer el bazo y use un cautelemiento estéril a baja temperatura para cauterizar la vena gástrica corta unida al bazo. Coloque un trozo de gasa estéril empapada con solución salina de 37 grados Celsius sobre el bazo para mantenerla húmeda y separada y movilizar la vena porta del tejido pancreático.Ligar las ramas de la vena porta como se demuestra. Coloque una sutura alrededor de la vena distal porta de la vena esplénica y gire el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta y la arteria esplénica en el tronco celíaco. Diseccionar y movilizar las arterias esplénicas celíacos aórticas y colocar una sutura alrededor de la aorta proximal a la arteria celíaca.Inyectar 100 unidades internacionales de heparina en la vena cava inferior o IVC para heparinizar todo el cuerpo. Después de tres minutos, ligar las arterias hepáticas y gástricas de la aorta proximal a la arteria celíaca. Transecta la vena porta y perfunde todo el cuerpo con 10 mililitros de solución salina heparinizada de cuatro grados Celsius desde la aorta abdominal distal hasta el tronco celíaco.Recoger el injerto de bazo y bloquear con el segmento celíaco aórtico asociado en la vena porta junto con el segmento de la vena esplénica y una pequeña porción de tejido pancreático. A continuación, conservar el injerto en cinco mililitros de cuatro grados Celsius salina. Ingrese el abdomen receptor a través de la incisión de la línea media después de que el área quirúrgica se prepara como para el donante y retire el bazo nativo receptor mediante la ligación de la vena esplénica y la arteria.Cubra los tejidos intestinales con una gasa empapada de 37 grados Celsius y mueva cuidadosamente el intestino hacia el lado izquierdo. Diseccionar y ligar las ramas lumbares de la aorta infrarroja en el CIV y sujetar la aorta infrarroja en el CIV con dos abrazaderas microvasculares de cuatro mililitros. Colocar una sutura de nylon 11-0 a través de la aorta infrarroja y retraer el recipiente para permitir la creación de una aortotomía elíptica con microscisores.Utilice una aguja de calibre 30 para perforar el CIV y crear una venotomía elíptica y extender la abertura hasta la longitud de la vena porta del donante. Enjuague la aorta y el CIV con 500 microlitros de solución salina heparinizada para eliminar la sangre intraluminal o los coágulos de sangre de los vasos y colocar el injerto de bazo del donante en el flanco derecho del abdomen receptor. Identifique cuidadosamente el manguito aórtico del donante y la vena porta.Después de confirmar que los vasos no están torcidos, cubra el injerto de bazo con gasa empapada de solución salina de cuatro grados Celsius. Usando dos suturas de 11-0 permanecer, conecte el manguito aórtico del donante al ápice proximal y distal de la aortotomía receptora y haga una anastomosis con dos o tres mordeduras de suturas continuas de nylon 11-0 entre el manguito aórtico del donante y la pared anterior de la aotomía receptora. Gire el injerto de bazo hacia el lado izquierdo del receptor y haga la anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía receptora.Realizar la anastomosis venosa entre la vena porta del donante y el CIV receptor con de cuatro a cinco bocados de suturas continuas en cada lado. Suture la pared posterior dentro del lumen del vaso primero y luego cierre la pared anterior usando la misma sutura. Completar la anastomosis con un nudo colocado en la esquina inferior fuera de la CIV.Ahora suelte las abrazaderas del recipiente y use un hisopo de algodón estéril para taponar el sangrado hasta que se recupere el color del bazo. Cierre el abdomen con una sutura Vicryl sintética absorbible de 5-0 en un patrón continuo y cierre la capa de la piel con una sutura de nylon 5-0 en un patrón interrumpido. A continuación, inyecte 250 microlitros de solución salina caliente por vía subcutánea en cuatro lugares separados y caliente el ratón en una incubadora controlada por temperatura de 30 grados Celsius durante las primeras horas después de la operación con monitoreo hasta que el animal haya recuperado la conciencia suficiente para su transferencia a la jaula doméstica.La hematoxilina y la eosina de los isinjertos del bazo días uno y siete después del trasplante revelan que la arquitectura de los isinjertos del bazo permanece intacta durante la primera semana postoperatoria. El análisis citométrico de flujo para investigar la migración de células del bazo de los donantes después del trasplante demuestra que aproximadamente el 50% de las células del bazo son donantes derivados en un día después del trasplante y aproximadamente el 46% son madres del receptor. Siete días después del trasplante, los leucocitos derivados del donante representan aproximadamente el 32% del total de células del bazo, mientras que las células derivadas del receptor aumentaron hasta aproximadamente el 53%Los leucocitos esplénicos de donantes también migraron a los ganglios linfáticos, la sangre y la médula ósea tan pronto como el primer día y se mantienen al menos hasta el séptimo día generando una quimera única para la investigación del tráfico de esplenocitos.El uso de ratones con imitación modificados genéticamente como donantes de bazo permitirá la investigación de las funciones de los mediadores derivados de células del bazo o de las vías clave de señalización en los procesos de la enfermedad. Este modelo podría ser una herramienta poderosa para explorar los mecanismos de las poblaciones de células del bazo en respuesta a patógenos, lesiones, inflamación o rechazo de trasplantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

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El ratón heterotópico modelo de trasplante de corazón ha sido probado por muchos investigadores como un método importante para el estudio de los mecanismos de rechazo y de la respuesta inmune. Sin embargo, las técnicas empleadas siguen siendo un reto. Mediante la modificación de las técnicas convencionales que han tenido éxito con más de 1.000 trasplantes.

El trasplante cardíaco heterotópico en ratones

El video muestra un método quirúrgico para generar un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado. La cavidad abdominal de un ratón donante anestesiado se abre quirúrgicamente para extirpar el bazo. Se identifican la vena cava inferior y la aorta infrarrenal, se ligan sus ramas lumbares y se hacen aberturas para el trasplante heterotópico de un bazo de un ratón donante congénito. Una vez completada la anastomosis vascular y restableciendo el flujo sanguíneo al bazo...

Un modelo murino de trasplante de bazo heterotópico vascularizado

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón humanizado dual con un sistema inmunológico humano y células hepáticas. Consiste en el trasplante de células hepáticas humanas y células madre y progenitoras hematopoyéticas en un ratón transgénico inmunodeficiente mediante inyección intraesplénica, lo que conduce al injerto de células hepáticas y al desarrollo de células inmunitarias humanas.

Desarrollo de un modelo de ratón humanizado con células hepáticas humanas y células inmunitarias

Un modelo preclínico, murino de metástasis hepáticas realiza a través de una técnica de inyección hemispleen.

A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

Describimos un protocolo para el injerto de interposición aórtica en ratones. El objetivo del protocolo es proporcionar un modelo con el que estudiar los procesos patológicos y las estrategias terapéuticas relevantes para las reacciones aloinmunes en las arterias y los cambios arteriales resultantes que contribuyen al fracaso del trasplante de órganos.

Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

Para estudiar el alotrasplante combinado de órganos sólidos y compuesto vascularizado, describimos un nuevo modelo heterotópico de trasplante de pared torácica, timo y corazón heterotópico en bloque en ratones utilizando una técnica de manguito cervical sin sutura.

Un microquirúrgica Modelo Novela de heterotópico, en bloque, pared torácica, el timo y el trasplante cardiaco en ratones

Este modelo novedoso para posterior trasplante ortotópico extremidad en el ratón, la aplicación de una técnica de manguito no de sutura para la anastomosis super-microvascular, proporciona una herramienta poderosa para la investigación inmunológica in vivo mecanicista relacionada con alotrasplante compuesto vascularizado (VCA).

Ortotópico de la extremidad posterior de trasplante en el ratón

Los modelos de trasplante cardíaco de ratón representan valiosas herramientas de investigación para estudiar la inmunología del trasplante. El presente protocolo detalla el trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón que implica la colocación de manguitos en la arteria carótida común del receptor y el tronco de la arteria pulmonar del donante para permitir el flujo sanguíneo laminar.

Trasplante cardíaco cervical heterotópico de ratón utilizando manguitos vasculares

Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.

Agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal para investigar la formación de tejido del bazo murino

Presentamos un modelo reproducible de ratón de alotrasplante compuesto vascularizado de extremidades posteriores a cuello heterotópico. Este protocolo supermicroquirúrgico, que implica anastomosis de vasos de 0,3-0,5 mm, integra guía con filamento de nailon y esposas venosas. Proporciona una plataforma fiable para estudios traslacionales sobre tolerancia, lesiones por isquemia-reperfusión y mecanismos inmunológicos en alotrasplantes compuestos vascularizados.

Trasplante heterotópico de extremidad posterior a cuello en ratón: un modelo supermicroquirúrgico de alotrasplante compuesto vascularizado

Este protocolo presenta una técnica simplificada de anastosis de sutura extremo a lado para el trasplante de corazón cervical murino, proporcionando un modelo robusto y reproducible para estudiar la inmunología de trasplantes.

Trasplante cardíaco heterotópico de ratón cervical utilizando la técnica de anastomosis de extremo a lado para estudiar la inmunología del trasplante

Aprenda el trasplante de bazo vascularizado en ratón para estudiar dinámica de células esplénicas e inmunidad. Este modelo permite rastrear el destino y la función de las células del bazo en enfermedades inflamatorias.

Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante (Video) | JoVE Journal

Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

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