Name: Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a editar genéticamente células CAR-T mediante CRISPR/Cas9 durante su fabricación para reducir la toxicidad y mejorar la eficacia en terapias contra el cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado a través de subvenciones de K12CA090628 (SSK), la Red Nacional Integral contra el Cáncer (SSK), el Centro Clínica Mayo para Medicina Individualizada (SSK), la Fundación Predolin (SSK), la Oficina de Traducción a la Práctica de Mayo Clinic (SSK) y el Programa de Capacitación de Científicos Médicos de Mayo Clinic Robert L. Howell Physician-Scientist (RMS).

Este protocolo sigue las pautas de la Junta de Revisión Institucional (IRB) y del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de Mayo Clinic.
1. Producción celular CART19
<ol><li>Aislamiento de células T, estimulación y cultivo ex-vivo<ol>
<li>Llevar a cabo todo el trabajo de cultivo celular en una campana de cultivo celular utilizando el equipo de protección personal adecuado. Cosechar células mononucleares de sangre periférica (PPBM) de conos de sangre de donante normales no identificados recogidos durante la aféresis, ya que se sabe que son una fuente viable de PPBCM.13.
</li>
		<li>Para aislar los PACL, añada 15 ml de un medio de gradiente de densidad a un tubo de separación de gradiente de densidad de 50 ml. Diluir la sangre del donante con un volumen igual de solución salina con fosfato (PBS) que contiene un 2% de suero bovino fetal (FBS) para evitar la captura celular.<ol>
<li>Añadir la sangre diluida del donante del cono en el tubo de separación, con cuidado de no perturbar la interfaz entre la sangre y el medio de gradiente de densidad. Centrífuga a 1.200 x g durante 10 min a RT.</li>
			<li>Decantar el sobrenadante en un nuevo cónico de 50 ml, lavar con PBS + 2% FBS trayendo hasta 40 ml, centrifugar a 300 x g durante 8 minutos a RT, sobrenadante pirata, resuspender en 40 ml de tampón y contar células.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aísle las células T de los PBMC a través de un kit de perlas magnéticas de selección negativa utilizando un separador de celdas totalmente automatizado de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Para cultivar los células T aisladas, prepare el medio de células T (TCM) que consiste en un 10% de suero AB humano (v/v), 1% penicilina-estreptomicina-glutamina (v/v) y medio celular hematopoyético sin suero. Esterilice el medio filtrando a través de un filtro de vacío estéril de 0,45 m y luego con un filtro de vacío estéril de 0,22 m.</li>
		<li>El día 0 (el día de la estimulación de los células T), lave las perlas CD3/CD28 antes de la estimulación de los glóbulos T. Para lavar, coloque el volumen requerido de perlas (utilice suficientes perlas CD3/CD28 para una proporción de 3:1 perlas: células T; tenga en cuenta que la concentración de perlas puede ser variable) en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y resuspender en 1 ml de TCM.</li>
		<li>Colocar en contacto con un imán.</li>
		<li>Después de 1 min, aspirar la MTC y resuspender en 1 mL de TCM fresco para lavar las cuentas.</li>
		<li>Repita este procedimiento para un total de tres lavados.</li>
		<li>Después del tercer lavado, resuspenda las perlas en 1 ml de TCM.</li>
		<li>Cuente las células T.</li>
		<li>Transfiera las cuentas a las células T con una proporción de 3:1 beads:cells.</li>
		<li>Diluir las células a una concentración final de 1 x 106 células/ml.</li>
		<li>Incubar a 37oC, 5% CO2 durante 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfección y transducción de células T<ol>
<li>Llevar a cabo el trabajo lentiviral utilizando las precauciones BSL-2+, incluyendo campanas de cultivo celular, equipo de protección personal y desinfección de materiales usados con lejía antes de su eliminación.</li>
		<li>Adquirir una construcción CART19 en un vector lentiviral. NOTA: La construcción CART19 utilizada aquí fue diseñada y luego sintetizada de novo utilizando un proveedor de síntesis de proteínas disponible comercialmente. La construcción de la CAR fue posteriormente clonada en un lentivirus de tercera generación bajo el control de un promotor EF-1. El fragmento de región variable de cadena única se deriva del clon FMC63 y reconoce CD19 humano. La construcción CAR19 posee un dominio coestimulante de segunda generación 4-1BB y estimulación CD3 (FMC63-41BBz). 12
</li>
		<li>Realizar la producción lentiviral como se describió anteriormente. 12<ol>
<li>En resumen, para producir lentivirus, utilizar 293T células que han alcanzado 70-90% de confluencia.</li>
			<li>Permitir la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente de los reactivos de transfección, incluyendo 15 g del plásmido lentiviral de interés, 18 g de un vector de embalaje gag/pol/tat/rev, 7 g de un vector de envolvente VSV-G, 111 éL del reactivo de pre-complejo, 129 sde la transfección, y 9,0 ml del medio de transfección antes de añadira a las células 293T. A continuación, el cultivo de las células transtrópicas a 37 oC, 5% co2.</li>
			<li>Cosecha, centrífuga (900 x g durante 10 min), filtro (filtro de nylon de 0,45 m) y sobrenadante concentrado a 24 y 48 h por ultracentrifugación a 13.028 x g para 18 h o 112.700 x g para 2 h.</li>
			<li>Congele a -80 oC para su uso futuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En el Día 1, resuspenda suavemente las células T para romper las rosetas de las células T que habían sido estimuladas a 1 x 106/ml el día 0.</li>
		<li>Bajo las precauciones apropiadas de BSL-2+ para todos los trabajos lentivirales, agregue el virus fresco o congelado cosechado a las células T estimuladas a una multiplicidad de infección (MOI) de 3.0.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansión de células CAR-T<ol>
<li>Durante la fase de expansión, continúe incubando las células Ttransducidas a 37oC, 5% CO2. Cuente las células CAR-T en los días 3 y 5, y agregue TCM fresco y precalentado al cultivo para mantener una concentración de células CAR-T de 1 x 106/mL.</li>
		<li>Retire las perlas de las células T transducidas 6 días después de la estimulación (Día 6) usando un imán. Cosecha, resuspende y coloca las células T en tubos cónicos de 50 ml en un imán durante 1 min. A continuación, recoja el sobrenadante (contiene las células CAR-T), y deseche las cuentas.</li>
		<li>Coloque las células CAR-T recogidas de nuevo en el cultivo a una concentración de 1 x 106 células/ml para reanudar la expansión.</li>
		<li>El día 6, evaluar la expresión superficial de la CAR por citometría de flujo. NOTA: Se pueden utilizar varios métodos para detectar la expresión superficial de la CAR, como la tinción con un anticuerpo secundario de alta relación antiratón de cabra (H+L) o mediante la tinción con un péptido específico CD19, conjugado con un fluorocromo. Aquí, tome una alícuota (alrededor de 100.000 células T) del cultivo y lávese con tampón de flujo preparado con salina tamponada de fosfato de Dulbecco, suero bovino fetal al 2% y 1% de azida sódica. Mancha las células con el anticuerpo anti-CAR y lávate dos veces. Manchar las células con mancha viva/muerta y anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3). Lave las células y resuspenda en el búfer de flujo. Adquirir en un catómetro para determinar la eficiencia de transducción.</li>
	</ol></li>
	<li>Criopreservación de células CAR-T<ol>
<li>Para cosechar y criopreservar las células CAR-T 8 días después de la estimulación (Día 8 de la expansión de los células T), cosechar las células del cultivo.</li>
		<li>Gire hacia abajo durante 5 min a 300 x g.</li>
		<li>Resuspender en medio de congelación a 10 millones de células por ml por vial en medio de congelación que consiste en 10% de sulfóxido de dimetil y 90% de suero bovino fetal.</li>
		<li>Congele en un recipiente de congelación para lograr una velocidad de enfriamiento de -1 oC/min en un congelador de -80 oC y luego transfiera a nitrógeno líquido después de 48 h.</li>
		<li>Antes de su uso para experimentos in vitro o in vivo, descongelar las células CAR-T en la MTC caliente.</li>
		<li>Lavar las células para diluir y eliminar el dimetil sulfóxido y resuspender a una concentración de 2 x 106 células/ml en TCM caliente. Descansar durante la noche a 37oC, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Producción GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Para interrumpir gm-CSF, utilice un ARN guía (gRNA) dirigido al exón 3 de GM-CSF humano (CSF2) seleccionado a través de gRNAs de cribado previamente reportados para tener alta eficiencia para el gen CSF2 que codifica para el cytokine humano GM-CSF. 14 NOTA: Se utilizó una construcción lentiviral Cas9 de tercera generación de grado de investigación sintetizada comercialmente que contiene este gRNA (bajo un promotor U6). La construcción contiene un gen de resistencia a la puromicina. La secuencia del ARNm es GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12
</li>
	<li>Para producir lentivirus, utilice células 293T que han alcanzado 70-90% de confluencia.</li>
	<li>Permitir 15 g del plásmido lentiviral de interés, 18 g de un vector de embalaje gag/pol/tat/rev, 7 g de un vector de envolvente VSV-G, 111 éL del reactivo precomplejo, 129 éL del reactivo de transfección y 9,0 ml del medio de transfección para incubar durante 30 minutos en la habitación mperatura.</li>
	<li>Agregue reactivos de transfección a las células 293T. A continuación, el cultivo a 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Cosecha, centrífuga (900 x g durante 10 min), filtro (filtro de nylon de 0,45 oM) y sobrenadante concentrado a 24 y 48 h por ultracentrifugación a 13.028 x g para 18 h o 112.700 x g para 2 h y congelar a -80 oC para uso futuro.</li>
	<li>El día 1, resuspenda suavemente las células T para romper las rosetas.</li>
	<li>En un laboratorio aprobado por BSL-2+, agregue el virus congelado o recién cosechado a las células T estimuladas para generar células CAR-T. Transduce las células T con el lentivirus CAR19 y el GM-CSF dirigidos al lentivirus CRISPR. Añadir LENTIvirus CAR19 a un MOI de 3. Dado que la valoración del lentivirus CRISPR no era factible, utilice partículas de virus generadas a partir de una preparación de plásmido de 15 ug para transducir células T de 10 x 10 6.</li>
	<li>Vea los pasos restantes de estimulación, expansión y criopreservación de células T como se describe en el paso 1.
</li>
	<li>Para las células T edificadas con lentiCRISPR que transportan resistencia a la puromicina, trate las células con dihidrocloruro de puromicina a una concentración de 1 g de puromicina por 1 ml el día 3 y el día 5.</li>
</ol>3. Eficiencia de interrupción gm-CSF y evaluación funcional de GM-CSF k/o CART19
<ol><li>Eficiencia de interrupción GM-CSF: seguimiento de indels por secuenciación y análisis de descomposición (TIDE)<ol>
<li>Para secuenciar el exón de interés en el gen GM-CSF, utilice las siguientes imprimaciones. Utilice una secuencia de imprimación directa para GM-CSF (CSF2) de TGACTACAGAGAGGCACAGA, y una secuencia de imprimación inversa de TCACCTCTGACCTCATTAACC.</li>
		<li>Extrae ADN de hasta 5 millones de células CAR-T con un kit de extracción genómica. Para la reacción de PCR, utilice 25 s de una mezcla maestra Taq por reacción con una concentración final de cada imprimación en la reacción de PCR de m, 0,1-0,5 g de ADN de la plantilla y un volumen total de la reacción de PCR que se trae hasta 50 l con agua libre de nucleasas.</li>
		<li>Consulte las condiciones de ciclo de PCR descritas en el Cuadro 1.</li>
		<li>Ejecuta muestras de PCR en un gel de agarosa del 1-2% a 100 V durante 30 min y extrae usando un kit de extracción de gel.</li>
		<li>Secuencia PCR amplicons. Calcule la frecuencia de modificación del alelo cargando datos sin procesar en un software TIDE adecuado. 15
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Producción de GM-CSF y evaluación funcional de GM-CSFk/o CART19<ol>
<li>Para determinar la producción de citoquinas de células CAR-T, incubar células de tipo silvestre CART19 y GM-CSFk/o CART19 con el CD19 que expresa la línea celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 en una proporción de 1:5 para 4 h a 37 oC, 5% CO2 en presencia de monensina CD49d antihumano, CD28 antihumano y CD107a antihumano.</li>
		<li>Cosecha células del cultivo para la citometría de flujo. Lave las células con tampón de citometría de flujo. Mancha las células con un kit de tinción vivo/muerto. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. Fijar las células con un medio de fijación e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
		<li>Después del lavado, tense las células intracelularmente con medio de permeabilización en combinación con anticuerpo santi-humano IFN, anticuerpo monoclonal antihumano IFN, GM-CSF antihumano, MIP-1o antihumano, IL-2 antihumano y CD3 antihumano e incubar en la oscuridad durante 30 min. Lavar y resuspender las muestras. Adquirir muestras en un citómetro de flujo y analizar para el porcentaje de expresión GM-CSF intracelular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK es un inventor de patentes en el campo de la terapia de células T CAR que tienen licencia para Novartis (bajo un acuerdo entre Mayo Clinic, Universidad de Pensilvania y Novartis). Estos estudios fueron financiados en parte por una subvención de Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS y SSK son inventores de patentes relacionadas con este trabajo. El laboratorio (SSK) recibe fondos de Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys y Actinium.

En este informe, describimos una metodología para utilizar la tecnología CRISPR/Cas9 para inducir modificaciones secundarias en células CAR-T. Específicamente, esto se demuestra utilizando la transducción lentiviral con un vector viral que contiene gRNA dirigido al gen de interés y Cas9 para generar células GM-CSFk/o CART19. Anteriormente habíamos demostrado que la neutralización GM-CSF mejora el CRS y NT en un modelo de xenoinjerto. 12 Como se ha descrito anteriormente, las células GM-...

La terapia celular del receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) exhibe una gran promesa en el tratamiento del cáncer. 1 , 2 Dos terapias de células CAR-T dirigidas a CD19 (CART19) fueron aprobadas recientemente en los Estados Unidos y en Europa para su uso en neoplasias malignas de células B después de demostrar resultados sorprendentes en ensayos clínicos multicéntricos. 3 , 4 , 5 Las barreras para un uso más generalizado de las células CAR-T son la actividad limitada en tumores sólidos y toxicidades asociadas, como el síndrome de liberación de citoquinas (SCR) y la neurotoxicidad (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Para mejorar el índice terapéutico de la terapia celular CAR-T, se emplean herramientas de ingeniería del genoma como nucleasas de dedos de zinc, TALENs y CRISPR para modificar aún más las células CAR-T en un intento de generar células CAR-T menos tóxicas o más eficaces. 10 , 11
En este artículo, describimos un método para generar celdas CAR-T editadas por CRISPR/Cas9. El objetivo específico de este método es modificar genéticamente las células CAR-T durante la fabricación de células CAR-T a través de CRISPR/Cas9 para generar células CAR-T menos tóxicas o más eficaces. La razón para desarrollar esta metodología se basa en las lecciones aprendidas de la experiencia clínica de la terapia celular CAR-T, lo que indica una necesidad urgente de estrategias novedosas para aumentar la ventana terapéutica de la terapia con células CAR-T y extender la aplicación a otros tumores y está respaldado por los recientes avances en biología sintética permitiendo múltiples modificaciones de células CAR-T que han comenzado a entrar en la clínica. Mientras que varias herramientas de ingeniería del genoma se están desarrollando y aplicando en diferentes entornos, tales como nucleasas de dedos de zinc, TALENs y CRISPR, nuestra metodología describe la modificación CRISPR/Cas9 de las células CAR-T. 10 , 11 CRISPR/Cas9 es un mecanismo de defensa bacteriana basado en ARN que está diseñado para eliminar el ADN extraño. CRISPR se basa en endonucleasas para cortar una secuencia diana identificada a través de un ARN guía (GRNA). La edición CRISPR de células CAR-T ofrece varias ventajas sobre otras herramientas de ingeniería del genoma. Estos incluyen la precisión de la secuencia de GRNA, simplicidad para diseñar un gRNA dirigido al gen de interés, alta eficiencia de edición de genes, y la capacidad de apuntar a múltiples genes ya que múltiples gRNA se pueden utilizar al mismo tiempo.
Específicamente en los métodos descritos aquí, utilizamos un ARN de guía CRISPR y Cas9 para interrumpir un gen durante la transducción CAR de las células T. Al seleccionar una técnica apropiada para editar células CAR-T, sugerimos que la técnica descrita aquí es un mecanismo eficiente para generar células CAR-T de grado de investigación, pero debido a que se desconoce el efecto a largo plazo de la integración permanente de Cas9 en el genoma, proponer esta metodología para desarrollar pruebas de concepto de células CAR-T de grado de investigación, pero no para la producción de células CAR-T de grado de buenas prácticas de fabricación.
En particular, aquí describimos la generación de células car-T de factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF) dirigidas a CD19 humano. Estas células CAR-T fueron generadas por transducción con partículas lentivirales codificando un ARN guía específico para GM-CSF (nombre genético CSF2) y Cas9. Anteriormente encontramos que la neutralización GM-CSF mejora CRS y NT en un modelo de xenoinjerto. 12 Células GM-CSFk/o CAR-T permiten la inhibición de GM-CSF durante el proceso de fabricación, reduciendo eficazmente la producción de GM-CSF al tiempo que mejoran la actividad antitumoral de las células CAR-T y la supervivencia in vivo en comparación con las células CAR-T de tipo salvaje. 12 Por lo tanto, aquí proporcionamos una metodología para generar células CAR-T editadas por CRISPR/Cas9.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD3 (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD3 (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Sistemas de Terapia Celular) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Sistema CytoFLEX B4-R2-V2</td><td>Citómetro de flujo</td> <td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td></tr><tr><td>sulfóxido de dimetilo</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (Concentrador de partículas magnéticas)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de aislamiento de células T humanas&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>perlas magnéticas de selección negativa; 17951RF incluye puntas y tampón</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón Anti-Humano CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Medio de fijación (medio A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Constructo: Nombre: CSF2 ARN guía CRISPR 1; Especie: Humano, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistencia: Ampicilina; Número de copia: Alto; Preparación de plásmidos: Entrega estándar: 4 &mu; g (Gratis de cargo)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td> pedido <td>personalizado</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>Suero AB Humano de Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; donantes masculinos; tipo AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Anticuerpo monoclonal (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas Aqua fijable, para excitación de 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Monensina, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD28 Clon CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD49d Clon 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Contenedor de congelación</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, clon G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>línea celular de leucemia linfoblástica aguda</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de filtro al vacío Olympus, 500 mL, membrana PES, 0,22 uM, estéril</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido con membrana CN 0,45 uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Suero reducido Medio (1X), Líquido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Ratón Anti-Humano IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X), Líquido</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Medio de permeabilización (Medio B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de puromicina</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Rata Anti-Humana GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Separador de células totalmente automatizado</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio, 5% (c/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Medio de células hematopoyéticas sin suero</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de crispr/cas9 para noquear gm-csf en células car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

La terapia celular del receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) es una nueva opción de tratamiento para el cáncer de vanguardia y potencialmente revolucionaria. Sin embargo, hay limitaciones significativas a su uso generalizado en el tratamiento del cáncer. Estas limitaciones incluyen el desarrollo de toxicidades únicas como el síndrome de liberación de citoquinas (SCR) y neurotoxicidad (NT) y la expansión limitada, las funciones del efector y la actividad antitumoral en tumores sólidos. Una estrategia para mejorar la eficacia CAR-T y / o controlar las toxicidades de las células CAR-T es editar el genoma de las células CAR-T sí mismos durante la fabricación de células CAR-T. Aquí, describimos el uso de la edición de genes CRISPR/Cas9 en células CAR-T a través de la transducción con una construcción lentiviral que contiene un ARN guía al factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF) y Cas9. Como ejemplo, describimos el nocaut mediado por CRISPR/Cas9 de GM-CSF. Hemos demostrado que estas células GM-CSFk/o CAR-T producen efectivamente menos GM-CSF mientras mantienen la función crítica de las células T y dan lugar a una mayor actividad antitumoral in vivo en comparación con las células CAR-T de tipo salvaje.

La Figura 1 muestra la reducción de GM-CSF en células GM-CSFk/o CART19. Para verificar que el genoma de las células T fue alterado para noquear GM-CSF, se utilizó la secuenciación TIDE en las células GM-CSFk/o CART19 (Figura1A). La tinción de la superficie de la célula CAR-T verifica que las células T expresen con éxito el receptor de superficie CAR in vitro mediante la medición en células CD3+ vivas (Figura...

Aquí, presentamos un protocolo para editar genéticamente las células CAR-T a través de un sistema CRISPR/Cas9.

Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Nuestro protocolo describe la modificación genética de las células CAR-T durante su fabricación a través de la tecnología CRISPR para generar un producto más eficaz y menos tóxico. Una ventaja de esta técnica es que la producción de células CAR-T y la manipulación genética pueden ocurrir en una célula con buena eficiencia. Demostrando el procedimiento estarán Rosalie Sterner, una estudiante de doctorado, Michelle Cox, una tecnóloga y una estudiante de posgrado, y Reona Sakemura, una estudiante de postdoctorado, de mi laboratorio.Después de aislar las células T de las células mononucleares de sangre periférica cosechadas, comience a cultivarlas primero preparando el medio de células T y luego esterilizando filtrando a través de un filtro de vacío estéril de 0,45 micrómetros y luego con un filtro de vacío estéril de 0,22 micrómetros. El día de la estimulación de la célula T o el día cero, antes de la estimulación, lave las perlas CD3/CD28 colocando el volumen requerido de perlas en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro y resuspendiendo en un mililitro de TCM. Coloque el tubo en contacto con un imán durante un minuto.A continuación, aspirar la MTC y resuspend en un mililitro de MTC fresco para lavar las cuentas de nuevo y repetir para un total de tres lavados. Y finalmente, resuspender las cuentas en un mililitro de TCM. Después de contar las células T, transfiera las cuentas a las células T en una proporción de tres a una cuentas a las células.Luego diluir las células a una concentración final de un millón de células por mililitro e incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2 durante 24 horas. Después de adquirir una construcción CART19 en un vector lentiviral, realice la producción lentiviral incubando primero plásmido lentiviral, vector de embalaje, vector de envolvente, reactivo precomplejo, reactivo de transfección y medio de transfección a temperatura ambiente durante 30 minutos. Llevar a cabo trabajos lentivirales utilizando BSL2+precauciones incluyendo campanas de cultivo celular, equipos de protección personal y desinfección de materiales usados con lejía antes de su eliminación.Después de la incubación, agregue estos reactivos de transfección a las 293 células T que han alcanzado 70 a 90%confluencia y cultivo de las células trans infectadas a 37 grados Celsius y 5%CO2. A las 24 y 48 horas después de la transfección, cosecha, centrífuga, filtro y concentrado sobrenadante que contiene virus por ultracentrifugación y congelación a menos 80 grados Centígrados para uso futuro. En el primer día, resuspend suavemente células T que han sido estimuladas en un millón de células por mililitro en el día cero con el fin de romper las rosetas de las células.Bajo las precauciones apropiadas de BSL2+, agregue el virus cosechado fresco o congelado a las células T simuladas a una multiplicidad de infección de 3.0. Continúe incubando las células T transducidas a 37 grados Celsius, 5%CO2. En los días tres y cinco, cuente las células CAR-T y agregue TCM precale calentado fresco al cultivo para mantener una concentración de células CAR-T de un millón de células por mililitro.Seis días después de la simulación, retire las cuentas de las células T transducidas cosechando primero y resuspendiendo las células. Transfiera las células en tubos cónicos de 50 mililitros y coloque los tubos en un imán durante un minuto. Después de recoger el sobrenadante que contiene células CAR-T y descartar las cuentas, vuelva a colocar las células en cultivo a una concentración de un millón de células por mililitro en un matraz de cultivo.Utilice una muestra de células para la citometría de flujo para evaluar la expresión superficial de los CAR. Incubar el resto para reanudar la expansión y luego cosechar y crio-preservar las células en el día ocho como se describe en el manuscrito. Para interrumpir el factor estimulante de la colonia de macrófagos de granulocitos, utilice un ARN guía como se describe en el manuscrito.Incubar reactivos de transfección a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, agréguelos a las 293 células T que han alcanzado entre 70 y 90%confluencia y cultivo de las células trans infectadas a 37 grados celsius, 5%CO2 para producir un lentivirus. A las 24 y 48 horas, cosecha y concentra el sobrenadante que contiene virus mediante ultracentrifugación en tubos ultracentrífugos de 50 mililitros y congela a menos 80 grados centígrados para uso futuro.Luego, el primer día, resuspender suavemente las células T para romper las rosetas. En un laboratorio aprobado por BSL2+, para generar células CAR-T, agregue el lentivirus CAR19 y el lentivirus CRISPR dirigido al GMCSF a las células T simuladas. En el día tres y cinco para las células T editadas con lentiCRISPR transducidas con éxito que transportan resistencia a la puromicina, tratar las células con dihidrocloruro de puromicina a una concentración de un microgramo de puromicina por mililitro.La secuenciación de mareas se utilizó para confirmar una reducción de GM-CSF en células GM-CSF knockout CART19 con una eficiencia de interrupción de aproximadamente 71% Parcelas de flujo de tinción de superficie de células CAR-T cerradas en células CD3 positivas en vivo muestran que tanto el tipo salvaje CART19 como GM-CSF knockout CART19 expresan con éxito el receptor de superficie CAR in vitro. Por otro lado, la tinción intracelular de GM-CSF por citometría de flujo también cerrada en células CD3-positivas en vivo demuestra una disminución de la expresión de GM-CSF en las células nocauts en comparación con las células CART19 de tipo salvaje que confirman el éxito funcional del knockout. Se debe tener especial cuidado durante las medidas de transducción de este procedimiento, ya que son las más críticas para el desarrollo de células CAR-T modificadas genéticamente.La metodología descrita puede aplicarse potencialmente a una variedad de genes para modificar las células CAR-T a través de CRISPR/CAS9 para ayudar a generar un producto menos tóxico y más eficaz. La tecnología CRISPR/CAS9 proporciona las estrategias para orientar directamente el genoma de las células CAR-T para diseñar soluciones a las deficiencias clínicas actuales.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El video describe un proceso para crear células CAR-T modificadas genéticamente a través del sistema CRISPR-Cas9. La infección de las células T con lentivirus CRISPR y CAR da lugar a modificaciones en el gen diana y a la síntesis de un receptor de antígeno quimérico o CAR, lo que en última instancia conduce a la formación de células CAR-T modificadas genéticamente.

Modificación genética de células CAR-T mediante un sistema CRISPR-Cas9

Este video muestra un ensayo para realizar la edición de genes en células T humanas utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Una mezcla de linfocitos T primarios CD4+ y CD8+ se combina con un complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9, dirigiéndose a genes específicos para su eliminación. Tras la electroporación, el sgRNA guía a Cas9 a la secuencia de ADN objetivo, creando cortes precisos. Estos cortes son reparados por el mecanismo de unión de extremos no homólogos de la célula, lo que lleva a...

Una técnica CRISPR-Cas9 para la edición de genes en células T

Genes específicos de edición usando CRISPR/Cas9 ha facilitado enormemente la comprensión de las funciones biológicas de los genes. Aquí, utilizamos la metodología CRISPR/Cas9 para mutaciones de calreticulina modelo en dependiente de citoquinas hematopoyéticas células para estudiar su actividad oncogénica.

Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Aquí, presentamos un protocolo para la edición de genes en células T humanas primarias utilizando la tecnología CRISPR Cas para modificar las células CAR-T.

Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Aquí, describimos un método para alterar selectivamente las expresiones génicas en el plexo coroideo mientras se evita cualquier impacto en otras áreas del cerebro.

Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

El artículo describe un protocolo para la aplicación de un modelo in vitro de agotamiento para completar un cribado de knockout de CRISPR en todo el genoma en células T receptoras de antígenos quiméricos de donantes sanos.

Realización de un cribado de knockout CRISPR en todo el genoma in vitro en células T receptoras de antígenos quiméricos

Desarrollamos un protocolo optimizado de cribado knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primarias. Al reducir la retención de ADNgDNA mediante la digestión enzimática y la reducción de la extracción de casetes de ARNg, este enfoque minimiza los artefactos de PCR, asegurando una detección precisa de ARNsgDNA y una identificación robusta de dianas génicas funcionales.

Mejorando las pantallas CRISPR-Cas9 en células CAR T: un método refinado para la preparación de bibliotecas

Aprende a editar genéticamente células CAR-T mediante CRISPR/Cas9 durante su fabricación para reducir la toxicidad y mejorar la eficacia en terapias contra el cáncer.

Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T

Explorar más videos