Diseño automatizado, de alto rendimiento, experimentos de crecimiento de células continuas utilizando eVOLVER

eVOLVER ofrece a los investigadores libertad experimental, la capacidad de definir sus propios experimentos de crecimiento cultural con retroalimentación automatizada sobre múltiples parámetros y escalarla a cualquier tamaño que necesiten. eVOLVER es más flexible que otros dispositivos. Los usuarios pueden personalizar fácilmente el software en Python, así como el hardware, modificando las mangas inteligentes que contienen sensores para cada cultivo.

El sistema puede parecer complicado a primera vista con múltiples componentes y conexiones. Una guía visual proporciona a los usuarios por primera vez más confianza en la ejecución de experimentos por su cuenta. La configuración adecuada es fundamental.

Asegúrese de entender lo que hace cada componente. Así que puedes confirmar que están trabajando. Asegúrese de que todo esté enrutado correctamente y conectado firmemente.

Mientras que diseñado para el cultivo aeróbico de bacterias y levaduras en diferentes condiciones, eVOLVER también podría ser modificado para la fermentación anaeróbica o para mantener las células de los mamíferos en suspensión. Este vídeo demostrará cómo configurar, inicializar y ejecutar un experimento de referencia cultural continua de alto rendimiento mediante la plataforma eVOLVER. El día antes del experimento, prepare medios, viales e inóculo según el manuscrito.

En tres vasos grandes, prepara dos vasos de 10% de lejía y un vaso de 70% de etanol. Con los interruptores del dispositivo eVOLVER, encienda la fuente de alimentación de cinco voltios en el eVOLVER, espere cinco segundos y, a continuación, encienda la fuente de alimentación de 12 voltios. Si ejecuta varios viales desde la misma botella de medios, conecte varias líneas de entrada de medios con divisores de tubos.

Los divisores de tubos personalizados se pueden construir con componentes inferiores. Sumerja las líneas de entrada de medios en el primer vaso de lejía y las líneas de eflux de medios en el segundo vaso de lejía. Conecte el extremo descendente de las líneas de entrada de medios al segundo vaso de precipitados con las líneas de eflux.

Coloque las líneas de desecho en un carboy de desecho. Agregue de uno a dos litros de lejía al carboy de desechos para esterilizar los residuos generados durante el experimento. Usando la pantalla táctil en el eVOLVER, navegue a la sección de configuración y ejecute todas las bombas durante 20 segundos para llenar las líneas de fluido con 10% de lejía.

Deje que la lejía se siente en las líneas durante al menos 30 minutos para esterilizar. Vuelva a ejecutar las bombas con la pantalla táctil hasta que las líneas ya no estén sumergidas, empujando el aire a través de las líneas para obtener la mayor cantidad posible de lejía. Coloque las líneas de entrada de medios en el vaso de etanol, llene las líneas con etanol, enjuácelas con aire.

A continuación, conecte las líneas de entrada de medios a las botellas de medios con los conectores inferiores y ejecute las bombas hasta que el soporte corra completamente a través de las líneas eliminando cualquier etanol residual. Inserte parcialmente viales esterilizados en los manguitos inteligentes eVOLVER y conecte las líneas de entrada a la paja de entrada corta y las líneas de desecho al strawq de elux largo de acuerdo con la codificación de color. Ajuste la pantalla táctil eVOLVER para ejecutar todas las bombas en incrementos de 10 segundos para llenar los viales con medios.

Asegúrese de que, mediante inspección visual, las bombas de eflux están eliminando eficientemente los medios a través de las pajitas de eflux para evitar desbordamientos. A continuación, empuje los viales hacia abajo hasta que estén completamente encerrados por la manga inteligente. En la página de configuración interactiva de la pantalla táctil eVOLVER, arrastre un dedo por la pantalla táctil o pulse el botón Seleccionar todo para seleccionar todos los viales y establecer las condiciones iniciales de temperatura a 30 grados centígrados y el revuelo en 10.

En un equipo, especifique el dispositivo eVOLVER en el que se ejecutará el experimento. Asegúrese de que se han seleccionado los ajustes de calibración deseados. Abra el panel de eVOLVER y vaya a la página Administrador de experimentos.

Seleccione el experimento Base en el panel Navegador de experimentos o en un experimento existente como punto de partida y haga clic en Clonar. Vaya a la página Editor de experimentos. Utilice los paneles Selector de viales y Definición de parámetros para ajustar la temperatura a 30 grados centígrados y establecer un umbral superior e inferior de OD para cada vial de acuerdo con el diseño experimental.

Guarde el experimento haciendo clic en Guardar. A continuación, haga clic en la flecha para volver a la página Administrador de experimentos y haga clic en el botón Reproducir para ejecutar. Una vez que el experimento está en curso, vaya al panel Datos en tiempo real en el panel interactivo.

Para cada vial, compruebe que los valores de OD se mantienen en cero. Navegue a través de los gráficos de temperatura para comprobar que las temperaturas están en o progresando hacia 30 grados Celsius. Para preparar el inóculo, primero mida el OD de los cultivos nocturnos y calcule la dilución completa deseada para cultivos nocturnos asumiendo un volumen de vial de 25 mililitros y un OD inicial deseado de aproximadamente 0,05.

A través del puerto de muestreo, pipetear el volumen calculado de inóculo o mezcla de inóculas. Compruebe los gráficos en el panel para ver que el OD está aumentando a 0.05. El crecimiento celular y las condiciones del vial se pueden controlar en tiempo real a medida que el experimento está en curso, lo que permite al investigador intervenir si se produce algún problema.

eVOLVER es una plataforma de cultivo continua automatizada que permite el control multiparámetro de las condiciones de cultivo. Se mostraron diferencias cualitativas entre los grupos de tipo silvestre, sensibles a la temperatura y sensibles a la sal cuando las relaciones de registro se trazaron con comparación con generaciones interpoladas a partir de datos de la tasa de crecimiento de eVOLVER. El color indica la temperatura de selección, mientras que los guiones distinguen las concentraciones de sal.

Un ajuste de pendiente a través de la parte lineal de cada parcela utilizando un mínimo de tres puntos, produce un valor de aptitud cuantitativo que describe cómo la cepa variante compite contra la cepa de referencia. Los valores de aptitud negativos indican que la cepa variante está fuera de competencia por la tensión de referencia. Compruebe siempre que todas las bombas funcionen de manera eficiente y que las líneas de fluidos estén libres de obstrucciones.

Un desbordamiento puede arruinar un experimento y potencialmente dañar las mangas inteligentes. Las muestras tomadas de eVOLVER se pueden secuenciar posteriormente para comprobar si hay alteraciones genómicas como resultado del experimento. Esta información se puede utilizar para diseñar nuevas cepas o sistemas.

Para los investigadores que utilizan la evolución del laboratorio o la selección de bibliotecas, es fácil aplicar presiones de selección únicas en cada experimento de eVOLVER. El control de retroalimentación y los entornos dinámicos ahora también son muy accesibles. El carboy de desechos contendrá pequeñas cantidades de lejía y etanol después de un experimento.

Consulte a su coordinador de seguridad de laboratorio para la eliminación adecuada de residuos.