Name: En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a realizar un screen genético forward en Drosophila melanogaster para identificar genes neuroprotectores. Este método utiliza ensayos de escalada e histología para estudiar neurodegeneración.

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Estamos particularmente agradecidos al Dr. Barry Ganetzky, en quién es el laboratorio de la pantalla genética que se realizó, permitiendo la identificación y caracterización del mocoso como un gen neuroprotector. Agradecemos al Dr. Steven Robinow por proporcionar amablemente la colección de moscas mutadas en uEN utilizadas en la pantalla genética presentada en este artículo. Agradecemos a los miembros del laboratorio Ganetzky, los doctores Grace Boekhoff-Falk y David Wassarman por sus útiles debates a lo largo de la duración de este proyecto, Ling Ling Ho y Bob Kreber por asistencia técnica, el Dr. Aki Ikeda para el uso de su instalación de microtome en el Universidad de Wisconsin y el Dr. Kim Lackey y el Centro de Análisis Óptico de la Universidad de Alabama.

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Los autores no declaran conflictos de intereses.

Las pantallas genéticas delanteras en Drosophila han sido un enfoque eficaz para identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos, incluyendo la neuroprotección dependiente de la edad5,23,24, 25. Usando esta estrategia, logramos identificar al mocoso como un gen neuroprotector novedoso17.
Un paso crítico en este...

Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU) son particularmente útiles debido a las mutaciones de puntos aleatorios que inducen, lo que resulta en un enfoque inherentemente imparcial que ha arrojado luz sobre numerosas funciones genéticas en los organismos modelo eucariotas3,4,5 (en contraste, la mutagénesis de rayos X crea roturas de ADN y puede dar lugar a reorganización en lugar de mutaciones puntuales6).
La mosca fruta común Drosophila melanogaster es un tema ideal para estas pantallas debido a su alta calidad, secuencia de genoma bien anotada, su larga historia como organismo modelo con herramientas genéticas altamente desarrolladas, y lo más significativo, su compartido historia evolutiva con los seres humanos7,8. Un factor limitante en la aplicabilidad de este protocolo es la letalidad temprana causada por los genes mutados, lo que impediría las pruebas a la edad de9años. Sin embargo, para las mutaciones no letales, un ensayo de escalada, que aprovecha la geotaxis negativa, es un método simple, aunque extenso, para cuantificar el funcionamiento motor deteriorado10. Para exhibir suficiente reactividad locomotora, las moscas dependen de las funciones neuronales para determinar la dirección, detectar su posición y coordinar el movimiento. Por lo tanto, la incapacidad de las moscas para subir lo suficiente en respuesta a los estímulos puede indicar defectos neurológicos11. Una vez que se identifica un fenotipo de escalada defectuoso en particular, se pueden utilizar más pruebas utilizando una pantalla secundaria como el análisis histológico del tejido cerebral para identificar la neurodegeneración en moscas que escalan. La cartografía genética posterior se puede utilizar para revelar la región genómica en el cromosoma que lleva el gen neuroprotector defectuoso de interés. Para reducir la región cromosómica de interés, se puede realizar un mapeo meiotico utilizando líneas volantes mutantes que transportan genes marcadores dominantes con ubicaciones conocidas en el cromosoma. Los genes marcadores sirven como punto de referencia para la mutación, ya que la frecuencia de recombinación entre dos loci proporciona una distancia medible que se puede utilizar para mapear la ubicación aproximada de un gen. Por último, el cruce de las líneas mutantes con líneas que llevan deficiencias equilibradas en la región cromosómica meiotamente mapeada de interés crea una prueba de complementación en la que se puede verificar el gen de interés si se expresa su fenotipo conocido5. Las secuencias de nucleótidos polimórficos en el gen identificado, lo que puede resultar en secuencias de aminoácidos alteradas, se pueden evaluar secuenciando el gen y comparándolo con la secuencia del genoma de Drosophila. La caracterización posterior del gen de interés puede incluir pruebas de alelos mutantes adicionales, experimentos de rescate de mutaciones y examen de fenotipos adicionales.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Equipo principal</fuerte></td>Campana extractora para histología Microscopio óptico Nikon Eclipe E100 El objetivo preferido para la obtención de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>imágenes es 20x</td></tr><tr><td>Software de imagen</td> Cámara de microscopio <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td> Termociclador <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Eppendorf <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly empujando y trepando assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Frasco de Drosophila, estrecho</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Cinta de etiquetado de laboratorio de uso general</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Alfombrilla</td><td></td><td></td><td></td>de ratón estándar</tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Motic</td><td></td><td>Modelo SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 estación de anestesia (Pistola de soplado, válvula de pie, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td>Doesn' Tanque de CO2</td></tr><tr><td>Cepillos de punta fina</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubadora</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Gene mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila línea utilizada para el mapeo de recombinación</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotipo: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Línea de equilibrador de Drosophila utilizada para el mapeo de recombinación</td></tr><tr><td>Kit de deficiencia para el cromosoma 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Histology analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Tubos de microcentrífuga de primera calidad: 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Agente de limpieza Histochoice 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Richard-Allan Scientific&trade; Medio de montaje</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Unifrost Poly-L-Lysine, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Cubreobjetos: Rectángulos</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Dimensiones: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Temporizador trazable</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>n.º de modelo 26025</td></tr><tr><td>Bandeja de portaobjetos y estanterías</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Estantería para 20 portaobjetos</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; pinza extralarga de uso general</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark&comercio; Profesional&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores puritanos de 6 pulgadas</td><td>Hardwood Products Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Cuchillas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tuppers o recipientes de vidrio para líquidos de</td><td></td><td></td> histología <td>16 + 1 para agua corriente</td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo recubiertas de alto perfil</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Cubitera redonda con tapa, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td>u otro recipiente para agua helada y casetes</td></tr><tr><td>Baño de tejidos</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molecular analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel y sistema de limpieza PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>ex Taq ADN polimerasa</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Invitrogen&comercio; &nbsp; SYBR&comercio; Caja fuerte&comercio; Tinción de gel de ADN&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen&comercio;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&comercio; Agarosa</td><td>&nbsp; Invitrogen&comercio;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus Escalera de ADN</td><td>&nbsp; Invitrogen&comercio;</td><td></td><td></td></tr><tr>Software <td></td><td></td><td>editor de plásmidos ApE-A</td><td>Disponible para descarga gratuita</td></tr><tr><td>Statistical analysis</td>R paquete <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>de software</tr><tr><td>Further analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo forward genetic screen para identificar nuevos genes neuroprotectores en drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Hay mucho que entender sobre la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo los genes subyacentes responsables. El cribado genético hacia adelante utilizando mutágenos químicos es una estrategia útil para mapear fenotipos mutantes a genes entre Drosophila y otros organismos modelo que comparten vías celulares conservadas con los seres humanos. Si el gen mutado de interés no es letal en las primeras etapas de desarrollo de las moscas, se puede llevar a cabo un ensayo de escalada para detectar indicadores fenotípicos de disminución del funcionamiento cerebral, como bajas tasas de escalada. Posteriormente, el análisis histológico secundario del tejido cerebral se puede realizar con el fin de verificar la función neuroprotectora del gen mediante la puntuación de fenotipos de neurodegeneración. Las estrategias de mapeo genético incluyen mapeo meiótico y deficiencia que se basan en estos mismos ensayos pueden ser seguidos por la secuenciación del ADN para identificar posibles cambios de nucleótidos en el gen de interés.

En esta ertícula, presentamos los pasos utilizados para identificar el tumor cerebral del gen (mocoso) como un papel en el mantenimiento de la integridad neuronal (por ejemplo, neuroprotección) en moscas adultas17; una metodología que puede utilizarse para identificar genes implicados en la neuroprotección. Utilizamos un enfoque genético hacia adelante (la estrategia se describe en la Figura 1A)para examinar a través ...

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

El objetivo principal de este protocolo es utilizar el poder de la genética hacia adelante para identificar genes que cuando se desregulan conducen a la neurodegeneración. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque imparcial y directo para la identificación de genes neuroprotectores que podrían ser más difíciles de realizar en modelos de mamíferos. Esta técnica se puede utilizar para identificar genes nuevos implicados en el proceso de neurodegeneración que se asocia con muchas condiciones de la enfermedad como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.Además de identificar genes neuroprotectores, el enfoque genético hacia adelante se puede utilizar para descubrir genes implicados en otros procesos biológicos como la función neuronal y la transmisión. Para empezar, recoge moscas homocigotas de líneas pertenecientes a la colección mutagenizada ENU de mutantes Drosophila asignados al segundo cromosoma. Voltear las moscas de 10 a 12 días de edad en una cámara de prueba sin anestesia una línea a la vez y permitirles recuperarse durante cinco minutos.Con la línea de cinco centímetros de lado hacia abajo, toque por la fuerza la cámara tres veces en una almohadilla de ratón colocada en una superficie sólida para que todas las moscas comiencen el ensayo en la parte inferior. Observe la locomoción de la mosca durante un período de 10 segundos. Registre el número de moscas que alcanzan o pasan la línea de cinco centímetros dentro de este tiempo, así como el número total de moscas probadas.Espere un minuto antes de comenzar un segundo juicio. Repita un mínimo de tres réplicas de prueba por línea. Después de anestesiar las moscas en una almohadilla de dióxido de carbono, corta cabezas de mosca con una cuchilla quirúrgica y usa un pincel para colocarlas suavemente en un mililitro del fijador de Carnoy en un tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitros.A continuación, guarde el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, asegúrese de que las cabezas estén hundidas en la solución fijativa. Bajo una campana de humo, utilice una pipeta P1000 para reemplazar la solución fijadora por un mililitro de 70% de etanol y mantenga las muestras a cuatro grados Celsius para análisis futuros.Con una pipeta Pasteur, transfiera las cabezas fijas a casetes de microbiopsía y cierre los cassettes. Envíe los casetes a una instalación de histología para su procesamiento o colóquelos en una máquina de procesamiento de tejidos automatizada si está disponible en el sitio. Ejecutar el programa para deshidratar, limpiar e infiltrarse en las cabezas con parafina.A continuación, transfiera los cassettes a una estación de incrustación de parafina con parafina calentada a 60 grados Centígrados y coloque moldes base metálicos que ajusten los cassettes en la estación calentada. Utilice fórceps finos para orientar las cabezas de manera que se dirijan a la parte superior del molde base. La orientación adecuada de la cabeza es fundamental para el análisis de histología.Después del endurecimiento, recorte cada bloque de parafina para minimizar la superficie que se se se le cortará. Corte cinco secciones de micrómetros de cada bloque en el microtoma. A continuación, coloque las cintas de parafina seccionadas en un baño de agua caliente a 35 grados centígrados durante un máximo de cinco minutos.Sumerja un tobogán recubierto de poli lisina en el baño de agua caliente y utilice un aplicador de madera para colocar las cintas seccionadas en el tobogán. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, usa un calentador de diapositivas para calentar los portaobjetos durante 15 minutos a 63 grados centígrados.Debajo de una campana de humo, coloque los portaobjetos en un estante de tinción deslizante y coloque el estante en HistoChoice durante cinco minutos dos veces seguido de varios tratamientos de baño de etanol y agua destilada según el manuscrito. Transfiera el estante a un recipiente lleno de Harris Hematoxilin durante dos a cinco minutos para manchar. A continuación, saque el bastidor de la solución de Hematoxilina y colóquelo bajo el agua corriente del grifo durante 10 minutos antes de los siguientes pasos de tinción.Después de la tinción, utilizando fórceps, saque las diapositivas de la solución HistoChoice o Xileno. Gotee una fina capa de medio de montaje permanente en la muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior. Evitar la formación de burbujas.Después de endurecer el medio de montaje, coloque la diapositiva bajo un microscopio de luz para obtener imágenes de secciones cerebrales representativas aproximadamente en el cerebro medio. En primer lugar, preparar un alimento que contenga vial para generar moscas hembra heterocigotas. Después de la anestesia de dióxido de carbono, usa un pincel para transferir a cinco machos de la línea mutante y 10 hembras vírgenes del lóbulo atascado esternopleural y pin sobre la línea Curly O en el vial para hacer una cruz.Coloque el vial a 25 grados centígrados. Después de 10 a 12 días, recoger al menos 15 progenie virgen que lleva el cromosoma mutado y el cromosoma marcador. Cruzarlos a cinco machos de una línea equilibrada que lleva otro marcador dominante visible Curly O sobre scutoid o equivalente.Después de 10 a 12 días, recoger el progenie macho heterocigoto que lleva ya sea scutoid o Curly O y el cromosoma potencialmente recombinado de la cruz. Aparé individualmente con hembras vírgenes de la población que lleva el cromosoma mutado. De diez a 12 días después, recoger la progenie de la última cruz en nuevos alimentos que contienen viales y envejecer las moscas a 29 grados celsius a 10 a 14 días.Realizar histología sobre cabezas volantes y repetir para la progenie de cada cruz individual. Con esta información, realice mapeo de deficiencias en la región estrecha del cromosoma para refinar la ubicación de la mutación recesiva. Cada línea de deficiencia tiene una eliminación de diferentes regiones de los cromosomas que les permite ser utilizados para pruebas de complementación.A continuación, cruce las líneas del kit de deficiencia de Drosophila para el segundo cromosoma y busque la no complementación del fenotipo del interés. Para obtener referencia para el análisis de secuencia de ADN, descargue un archivo de formato FASTA que contenga la secuencia de consenso genómica del gen BRAT de FlyBase o utilice un archivo que contenga resultados para la secuencia BRAT de un control de fondo genético, por ejemplo, la línea Drosophila mutagenizada originalmente. Abra los archivos de secuenciación en el Editor de plásmidos.Vaya a Editar y haga clic en Alinear secuencias. Con el ratón del ordenador, seleccione todas las secuencias que desee comparar. En el menú desplegable, indique la secuencia de referencia para esta alineación.Inspeccione la región secuenciada en busca de cambios de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Si lo desea, guarde la alineación en un equipo en formato RTF haciendo clic en Texto y luego en Guardar. Realice el experimento de rescate recogiendo la progenie F1 de cada cruz.Seleccione cuidadosamente los equilibradores marcados. Envejecer las moscas en Drosophila medio de alimentos en 29 grados Celsius y realizar análisis histología en el cerebro para buscar la neurodegeneración como antes. Para realizar análisis dependientes de la edad de la neurodegeneración en 867 mutantes, envejecer las moscas a cinco, 15 y 25 días y realizar análisis histológicos posteriores.Este protocolo presenta un enfoque genético hacia adelante para la desparasitación a través de una colección de moscas mutadas químicamente utilizando un ensayo de escalada. Entre 235 líneas homocigotas, alrededor del 37% de las líneas probadas mostraron una tasa de paso de escalada por debajo del 50% cuando se probaron a la edad de 10 a 12 días. La posterior pantalla histológica en 51 de las líneas que presentaban la tasa de paso de escalada más baja reveló que 29 de estas líneas mostraban la apariencia visible de agujeros en la neuropípa cerebral que van desde indicativos leves a graves de neurodegeneración.El fenotipo de neurodegeneración en 867 moscas es recesivo porque los cerebros de las moscas heterocigotas 867 que han sido tachadas a una cepa de tipo salvaje eran comparables a los de los controles. La línea de deficiencia Df24116 no complementa el fenotipo mutante 867 basado en el ensayo de escalada. La verificación histológica muestra que la línea de deficiencia Df24116 no complementa el fenotipo de neurodegeneración 867, mientras que Df9296 sí.El examen del fenotipo cerebral de 867 mutantes cruzados a líneas de deficiencia adicionales confirmó que la mutación está contenida en la región del genoma que incluye el gen BRAT. Es importante recordar durante este procedimiento trabajar de la forma más rigurosa y precisa posible, ya que este protocolo combina varios pasos que si se ejecutan incorrectamente pueden afectar a la identificación de mutantes con neurodegeneración en genes candidatos. Dependiendo de los genes identificados, el análisis posterior puede incluir la prueba de óvulos adicionales del gen del interés o interacciones con genes que juegan un papel en vías conocidas de neurodegeneración.Durante el procedimiento de histología, recuerde manejar la solución fijadora de Carnoy con precaución ya que contiene cloroformo. Use guantes y use con una ventilación adecuada idealmente debajo de la campana de humos. Del mismo modo, realizar toda la tinción histológica bajo la campana de humos.

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Investigación

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Genetics

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