Name: En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a realizar un screen genético forward en Drosophila melanogaster para identificar genes neuroprotectores. Este método utiliza ensayos de escalada e histología para estudiar neurodegeneración.

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Estamos particularmente agradecidos al Dr. Barry Ganetzky, en quién es el laboratorio de la pantalla genética que se realizó, permitiendo la identificación y caracterización del mocoso como un gen neuroprotector. Agradecemos al Dr. Steven Robinow por proporcionar amablemente la colección de moscas mutadas en uEN utilizadas en la pantalla genética presentada en este artículo. Agradecemos a los miembros del laboratorio Ganetzky, los doctores Grace Boekhoff-Falk y David Wassarman por sus útiles debates a lo largo de la duración de este proyecto, Ling Ling Ho y Bob Kreber por asistencia técnica, el Dr. Aki Ikeda para el uso de su instalación de microtome en el Universidad de Wisconsin y el Dr. Kim Lackey y el Centro de Análisis Óptico de la Universidad de Alabama.

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Los autores no declaran conflictos de intereses.

Las pantallas genéticas delanteras en Drosophila han sido un enfoque eficaz para identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos, incluyendo la neuroprotección dependiente de la edad5,23,24, 25. Usando esta estrategia, logramos identificar al mocoso como un gen neuroprotector novedoso17.
Un paso crítico en este...

Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU) son particularmente útiles debido a las mutaciones de puntos aleatorios que inducen, lo que resulta en un enfoque inherentemente imparcial que ha arrojado luz sobre numerosas funciones genéticas en los organismos modelo eucariotas3,4,5 (en contraste, la mutagénesis de rayos X crea roturas de ADN y puede dar lugar a reorganización en lugar de mutaciones puntuales6).
La mosca fruta común Drosophila melanogaster es un tema ideal para estas pantallas debido a su alta calidad, secuencia de genoma bien anotada, su larga historia como organismo modelo con herramientas genéticas altamente desarrolladas, y lo más significativo, su compartido historia evolutiva con los seres humanos7,8. Un factor limitante en la aplicabilidad de este protocolo es la letalidad temprana causada por los genes mutados, lo que impediría las pruebas a la edad de9años. Sin embargo, para las mutaciones no letales, un ensayo de escalada, que aprovecha la geotaxis negativa, es un método simple, aunque extenso, para cuantificar el funcionamiento motor deteriorado10. Para exhibir suficiente reactividad locomotora, las moscas dependen de las funciones neuronales para determinar la dirección, detectar su posición y coordinar el movimiento. Por lo tanto, la incapacidad de las moscas para subir lo suficiente en respuesta a los estímulos puede indicar defectos neurológicos11. Una vez que se identifica un fenotipo de escalada defectuoso en particular, se pueden utilizar más pruebas utilizando una pantalla secundaria como el análisis histológico del tejido cerebral para identificar la neurodegeneración en moscas que escalan. La cartografía genética posterior se puede utilizar para revelar la región genómica en el cromosoma que lleva el gen neuroprotector defectuoso de interés. Para reducir la región cromosómica de interés, se puede realizar un mapeo meiotico utilizando líneas volantes mutantes que transportan genes marcadores dominantes con ubicaciones conocidas en el cromosoma. Los genes marcadores sirven como punto de referencia para la mutación, ya que la frecuencia de recombinación entre dos loci proporciona una distancia medible que se puede utilizar para mapear la ubicación aproximada de un gen. Por último, el cruce de las líneas mutantes con líneas que llevan deficiencias equilibradas en la región cromosómica meiotamente mapeada de interés crea una prueba de complementación en la que se puede verificar el gen de interés si se expresa su fenotipo conocido5. Las secuencias de nucleótidos polimórficos en el gen identificado, lo que puede resultar en secuencias de aminoácidos alteradas, se pueden evaluar secuenciando el gen y comparándolo con la secuencia del genoma de Drosophila. La caracterización posterior del gen de interés puede incluir pruebas de alelos mutantes adicionales, experimentos de rescate de mutaciones y examen de fenotipos adicionales.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Equipo principal</fuerte></td>Campana extractora para histología Microscopio óptico Nikon Eclipe E100 El objetivo preferido para la obtención de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>imágenes es 20x</td></tr><tr><td>Software de imagen</td> Cámara de microscopio <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td> Termociclador <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Eppendorf <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly empujando y trepando assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Frasco de Drosophila, estrecho</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Cinta de etiquetado de laboratorio de uso general</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Alfombrilla</td><td></td><td></td><td></td>de ratón estándar</tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Motic</td><td></td><td>Modelo SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 estación de anestesia (Pistola de soplado, válvula de pie, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td>Doesn' Tanque de CO2</td></tr><tr><td>Cepillos de punta fina</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubadora</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Gene mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila línea utilizada para el mapeo de recombinación</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotipo: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Línea de equilibrador de Drosophila utilizada para el mapeo de recombinación</td></tr><tr><td>Kit de deficiencia para el cromosoma 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Histology analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Tubos de microcentrífuga de primera calidad: 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Agente de limpieza Histochoice 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Richard-Allan Scientific&trade; Medio de montaje</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Unifrost Poly-L-Lysine, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Cubreobjetos: Rectángulos</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Dimensiones: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Temporizador trazable</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>n.º de modelo 26025</td></tr><tr><td>Bandeja de portaobjetos y estanterías</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Estantería para 20 portaobjetos</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; pinza extralarga de uso general</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark&comercio; Profesional&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores puritanos de 6 pulgadas</td><td>Hardwood Products Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Cuchillas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tuppers o recipientes de vidrio para líquidos de</td><td></td><td></td> histología <td>16 + 1 para agua corriente</td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo recubiertas de alto perfil</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Cubitera redonda con tapa, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td>u otro recipiente para agua helada y casetes</td></tr><tr><td>Baño de tejidos</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molecular analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel y sistema de limpieza PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>ex Taq ADN polimerasa</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Invitrogen&comercio; &nbsp; SYBR&comercio; Caja fuerte&comercio; Tinción de gel de ADN&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen&comercio;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&comercio; Agarosa</td><td>&nbsp; Invitrogen&comercio;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus Escalera de ADN</td><td>&nbsp; Invitrogen&comercio;</td><td></td><td></td></tr><tr>Software <td></td><td></td><td>editor de plásmidos ApE-A</td><td>Disponible para descarga gratuita</td></tr><tr><td>Statistical analysis</td>R paquete <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>de software</tr><tr><td>Further analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo forward genetic screen para identificar nuevos genes neuroprotectores en drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Hay mucho que entender sobre la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo los genes subyacentes responsables. El cribado genético hacia adelante utilizando mutágenos químicos es una estrategia útil para mapear fenotipos mutantes a genes entre Drosophila y otros organismos modelo que comparten vías celulares conservadas con los seres humanos. Si el gen mutado de interés no es letal en las primeras etapas de desarrollo de las moscas, se puede llevar a cabo un ensayo de escalada para detectar indicadores fenotípicos de disminución del funcionamiento cerebral, como bajas tasas de escalada. Posteriormente, el análisis histológico secundario del tejido cerebral se puede realizar con el fin de verificar la función neuroprotectora del gen mediante la puntuación de fenotipos de neurodegeneración. Las estrategias de mapeo genético incluyen mapeo meiótico y deficiencia que se basan en estos mismos ensayos pueden ser seguidos por la secuenciación del ADN para identificar posibles cambios de nucleótidos en el gen de interés.

En esta ertícula, presentamos los pasos utilizados para identificar el tumor cerebral del gen (mocoso) como un papel en el mantenimiento de la integridad neuronal (por ejemplo, neuroprotección) en moscas adultas17; una metodología que puede utilizarse para identificar genes implicados en la neuroprotección. Utilizamos un enfoque genético hacia adelante (la estrategia se describe en la Figura 1A)para examinar a través ...

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

El objetivo principal de este protocolo es utilizar el poder de la genética hacia adelante para identificar genes que cuando se desregulan conducen a la neurodegeneración. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque imparcial y directo para la identificación de genes neuroprotectores que podrían ser más difíciles de realizar en modelos de mamíferos. Esta técnica se puede utilizar para identificar genes nuevos implicados en el proceso de neurodegeneración que se asocia con muchas condiciones de la enfermedad como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.Además de identificar genes neuroprotectores, el enfoque genético hacia adelante se puede utilizar para descubrir genes implicados en otros procesos biológicos como la función neuronal y la transmisión. Para empezar, recoge moscas homocigotas de líneas pertenecientes a la colección mutagenizada ENU de mutantes Drosophila asignados al segundo cromosoma. Voltear las moscas de 10 a 12 días de edad en una cámara de prueba sin anestesia una línea a la vez y permitirles recuperarse durante cinco minutos.Con la línea de cinco centímetros de lado hacia abajo, toque por la fuerza la cámara tres veces en u

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Este video describe un método simple para cuantificar la locomoción de la mosca y muestra el ensayo de escalada realizado. El ensayo de escalada con mosca es una prueba general de la función motora que se basa en una respuesta geotaxis negativa.

Ensayo de escalada con mosca: un método para probar la locomoción general en Drosophila melanogaster

A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA)...

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Aquí, presentamos un protocolo usando Drosophila neurona sensorial - modelo de lesión de neurona arborización dendrítica (da), que combina en vivo en vivo la proyección de imagen, dos fotones láser axotomía/dendriotomy y potentes herramientas genéticas mosca, como una plataforma para la detección de potenciales promotores e inhibidores de Neurorregeneración.

Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Este artículo proporciona protocolos detallados para infligir lesión cerebral traumática penetrante (PTBI) a Drosophila adulta y examinar la neurogénesis resultante.

Estimulación y análisis de la neurogénesis adulta en el cerebro central de Drosophila

El protocolo presenta un método rentable y de alto rendimiento para evaluar la neurotoxicidad en la mosca de la fruta a través de la cuantificación de la disfunción locomotora como alternativa a los modelos tradicionales de mamíferos. Su objetivo es evaluar los efectos neurotóxicos de compuestos farmacéuticos, agentes ambientales o modificaciones genéticas utilizando un modelo sensible, reproducible y éticamente favorable.

Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Aprende a realizar un screen genético forward en Drosophila melanogaster para identificar genes neuroprotectores. Este método utiliza ensayos de escalada e histología para estudiar neurodegeneración.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

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