Generación de fibrillas alfa-Synucleinas preformadas de monómeros y uso in vivo

El modelo de fibriedad preformada Alpha-Synuclein está siendo utilizado por laboratorios de todo el mundo para estudiar sinucleinopatías. Aunque el modelo ha sido utilizado con éxito por muchos laboratorios, algunos grupos han experimentado incoherencias que generan fibrillas y producen una patología consistente de alfa-sinucleína. Esperamos que este protocolo, que detalla la generación de fibrillas a partir de monómeros de alfa-sinucleína y el uso de fibrillas preformadas in vivo, pueda responder a las preguntas que los investigadores tienen sobre el uso del modelo.

El modelo de alfa-sinoucleina preformada fibríal recapitula características clave de la enfermedad de Parkinson, como la patología de la alfa-sinucleína y la neurodegeneración. Y se ha demostrado que conduce a deficiencias motoras modestas en algunos modelos animales. La formación de inclusiones que contienen alfa-sinucleína fosforilada y curso de tiempo prolongado hacia la neurodegeneración ofrece a los investigadores diferentes etapas a lo largo de la progresión de la sinucleinopatía, para estudiar y apuntar a posibles intervenciones terapéuticas.

Demostrando la preparación de agujas de vidrio personalizadas. Para comenzar este procedimiento, descongele los monómeros de alfa-sinucleina sobre hielo. Re-des-rebanó los monómeros descongelados moviendo suavemente en el tubo.

Y centrifugar a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de micro centrífuga limpio de 1,5 ml y registre la cantidad transferida. Diluir los monómeros con 1 dPBS a una concentración final de 5 mg por ml.

Brevemente vórtice para mezclar, y centrifugar brevemente para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo. A continuación, utilice una película adhesiva para fijar la tapa del tubo de micro centrífuga cerrada. Coloque el tubo en un mezclador térmico orbital con una tapa durante siete días a 37 grados Celsius mientras agita a 1.000 rpm.

Al final de siete días, el contenido del tubo debe aparecer turbio. En primer lugar, no haga todo el equipo de protección personal necesario, incluidos guantes, una bata de laboratorio y un protector facial. A continuación, en una campana de cultivo celular, conecte una sonda de 3,2 mm de diámetro al convertidor.

Ajuste la amplitud de los sonicadores a 30% y pulse a un segundo y un segundo de apagado y el tiempo a un minuto. Descongelar las fibrillas a temperatura ambiente, y mientras todavía está en la campana de cultivo, diluir las fibrillas con dPBS estériles. A continuación, humedezca un tejido de laboratorio con 70% de etanol y utilícelo para limpiar la sonda del sonicador para limpiarlo.

Sumerja la punta de la sonda en agua de doble destilación y pulse 10 veces para limpiar aún más la sonda. Después de esto, limpie la sonda con un pañuelo de laboratorio. Coloque la punta de la sonda limpia en el tubo de fibrillas diluidas y coloque la punta en la parte inferior del tubo.

Sonicar las fibrillas diluidas utilizando los parámetros previamente establecidos mientras mueve la sonda hacia arriba y hacia abajo durante cada pulso para asegurarse de que todas las fibrillas en el líquido son sonicadas. Después de la sonicación, centrifugar brevemente durante un segundo a 2.000 g para recoger todo el líquido de los lados del tubo. Sumerja la punta de la sonda en 1%SDS y pulse 10 veces para limpiar la sonda.

A continuación, retire la punta de la SDS y sumerjala en agua destilada doble y pulse 10 veces. Limpie la sonda con un tejido de laboratorio humedecido con 70%etanol y límpiela con un tejido de laboratorio seco. Separe la sonda del convertidor y guárdela.

Después de esto, limpie todas las superficies en la campana con 1%SDS seguido de 70%etanol. Para comenzar, coloque un tubo capilar de vidrio siliconizado en un tirador de aguja de vidrio. Encienda el elemento calefactor y deje que los pesos adjuntos estiren el tubo capilar de vidrio calentado.

A continuación, utilice tijeras para cortar el tubo capilar de vidrio tirado en el punto más delgado en el medio y retire la aguja de vidrio del tirador de aguja de vidrio. A continuación, utilice tijeras para cortar una longitud de tubo de envoltura retráctil a aproximadamente 40 mm. Deslice la envoltura retráctil sobre la aguja metálica de una jeringa biselada de 10 microlitrotro.

Utilice una llama abierta para calentar y adherir la envoltura retráctil a la aguja, mientras se asegura de girar la aguja para aplicar el calor uniformemente. Deslice el extremo más grande de la aguja de vidrio tirado cuidadosamente sobre la aguja metálica de la jeringa. Después de esto, corte una longitud de tubo de envoltura retráctil a aproximadamente 40 mm y deslícela cuidadosamente sobre la aguja de vidrio para superponer la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica de la jeringa.

Utilice una llama abierta para calentar la envoltura retráctil para fijar la aguja de vidrio a la aguja de metal. Para asegurar aún más la aguja y evitar posibles fugas, corte una longitud adicional de tubo de envoltura retráctil a aproximadamente 40 mm, y deslícela cuidadosamente sobre la aguja de vidrio para superponer la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica de la jeringa. Utilice una llama abierta para calentar la envoltura retráctil para fijar la aguja de vidrio a la aguja de metal.

A continuación, utilice tijeras para recortar la aguja de vidrio de modo que la punta tenga aproximadamente 8 mm de largo. Para probar la aguja, llene una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 26 con agua destilada. Retire el émbolo metálico de la jeringa de aguja de vidrio personalizada e inserte la aguja de la jeringa llena de agua en la base de la jeringa personalizada.

Inspeccione la interfaz de la aguja de vidrio y la aguja metálica en busca de fugas y confirme un flujo constante de agua. A continuación, llene un tubo de micro centrífuga con agua destilada. Utilice la jeringa de aguja de vidrio personalizada para extraer el agua destilada.

Inspeccione la aguja para confirmar que se está tomando líquido en la jeringa y que no hay burbujas. Si hay burbujas, o si el agua no se está acumulando en la aguja, recortar la aguja puede ayudar a aliviar la presión. Después de esto, guarde cuidadosamente la jeringa con las agujas de vidrio adjuntas, en las cajas de jeringa hasta que sea necesario para las cirugías.

El examen con microscopía electrónica de transmisión confirma la presencia de fibrillas largas. En comparación, los monómeros alfa-sinucleína son visibles para la cebada y no tienen forma discernible. La confirmación analoides de las fibrillas se confirma mediante un ensayo de Tioflavina T.

Un ensayo representativo muestra que los monómeros dPBS y ratón producen una señal más baja en unidades de harina relativas en comparación con el fórfeno de ratón PFF. El monómero de alfa-sinucleína humana produce una señal similar al monómero de ratón. Mientras que los PFF humanos también producen una señal más alta que los monómeros.

Para asece la presencia de fibrillas pelitibles, se realiza un ensayo de sedimentación. Tanto en las muestras de ratón como en las muestras humanas de PFF, la infracción supernate debe tener más proteína en el pellet que el sobrenadante. Por el contrario, la mayoría de la proteína del ratón y los monómeros humanos está presente en el sobrenadante con poco presente en el pellet.

Tanto el ratón como los PFF humanos son sonicados para producir PFF de longitudes apropiadas para sembrar inclusiones de sinucleínas alfa. Un examen exhaustivo de aproximadamente 500 fibrillas revela que la longitud media de las fibrillas de ratón es de aproximadamente 44 nanómetros. Con el 86,6% de los FF de 60 nanómetros o menos.

Los PFF humanos, sin embargo, tienen una longitud media de aproximadamente 55,9 nanómetros con el 69,6% de los FF que miden 60 nanómetros o menos. El examen in vivo de la eficacia de PFF se confirma mediante inmunohistoquímica. Las inclusiones formadas en la sustancia nigra, comparten propiedades similares a los cuerpos de Lewy en que contienen fosforilada alfa sinucleína, contienen estructuras aminloyed, y manchan con tioflavina S, y son resistentes a la digestión de Proteinase K.

La sonicación puede exponer la sonicación individual a fibrillas preformadas aerosolizadas. Como tal, se debe usar un atuendo de seguridad adecuado y realizar la sonicación en una capucha para minimizar el riesgo de exposición.