Name: Generación de fibrillas alfa-Synucleinas preformadas de monómeros y uso in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende a generar fibrillas preformadas de alfa-sinucleína a partir de monómeros y su uso in vivo en modelos de Parkinson. Este protocolo estandarizado incluye control de calidad y técnicas de inyección neuroquirúrgica para asegurar patología reproducible.

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Esta investigación fue apoyada por becas de la Fundación Michael J. Fox, el Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidentes cerebrovasculares (NS099416) y el Instituto Weston Brain.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
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<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
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<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
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<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
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<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
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<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk y Caryl Sortwell están actualmente involucrados en acuerdos contractuales con la Fundación Michael J. Fox para el material de control de calidad α-SYN generado por Proteos, Inc. la coautora Nicole Polinski, es una empleada del Michael J. Fox Foundation, que ha contratado a Proteos, Inc. para producir monómero α-SYN. Los coautores Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley y Nicholas Kanaan no tienen nada que revelar.

La producción de PFFs α-SYN capaces de sembrar neuronas y dar lugar a inclusiones como el cuerpo de Lewy depende de múltiples factores y pasos. Un factor crítico es que los monómeros utilizados para generar fibrillas necesitan ser formulados específicamente para la fibrlización4,9,14,15. Si los monómeros no están formulados para la fibrlización, es posible que las fibrillas no se formen o que las fibrillas que forman la forma no produzcan patología α-SYN. Del mismo modo, el buffer en el que se encuentran los monómeros influye también en la fibrlización. Como tal, para obtener los mejores resultados, la concentración de sal debe ser de aproximadamente 100 mM NaCl y pH entre 7,0 y 7,3. Un paso inicial que introduce la variabilidad es el método por el cual se determina el contenido inicial de proteínas, con una medición en A280 que probablemente produzca resultados más precisos y por lo tanto es el método preferido. La discrepancia en la concentración de proteínas puede disminuir la eficacia del proceso de fibrlización, así como alterar la concentración de PFF asumida utilizada en los experimentos. Ambos podrían conducir a una disminución en la eficiencia de siembra y la variación de lotes entre los experimentos.
Los pasos de control de calidad iniciales confirmarán las características críticas de las PFFs, específicamente que tienen una conformación fibrilar (microscopía electrónica), contienen estructuras amiloides (ensayo tioflavina T) y son peleticos (ensayo de sedimentación). Es importante tener en cuenta que los resultados del ensayo de tioflavina T fluctuarán con el tiempo y no son una medida directa de la cantidad de estructuras amiloides presentes, más bien, el ensayo de tioflavina T debe utilizarse sólo como un indicador de la presencia de estructuras amiloides dentro la muestra. Tioflavina T se utiliza típicamente en ensayos in vitro, como el mencionado ensayo para mostrar que las fibrillas contienen estructuras amiloides. Alternativamente, tioflavina S se utiliza en el tejido para detectar estructuras amiloides, como se muestra en la figura 7. En lo que respecta al ensayo de sedimentación, los resultados sólo muestran que las PFFs se encuentran predominantemente en la fracción pelletable. A medida que las muestras se ejecutan en condiciones de desnaturalización, una sola banda prominente de aproximadamente 14 kDa, el tamaño de los monómeros α-SYN, está presente en los geles. Esto es diferente a las múltiples bandas presentes en pesos moleculares más altos que se esperarían con PFFs si se utilizaba un gel nativo o sin desnaturallamiento. Por último, el paso exitoso de todos estos pasos de control de calidad inicial no garantiza la actividad de siembra de inclusión α-SYN. Por esta razón, los experimentos de cultivo celular o una pequeña cohorte de animales inyectados quirúrgicamente deben utilizarse para probar la eficacia de las PFFs antes de su uso en experimentos más grandes.
La sonicación es un paso crucial en el proceso y los parámetros diferirán dependiendo del modelo de sonicador utilizado. Los parámetros de sonicación deben ser aplicados y verificados para mostrar que se han producido fragmentos cortos de PFF. El tamaño de fibrl tiene relación con la siembra, con la siembra de fibrillas más cortas de manera más eficiente. Aunque la semilla de fibrillas más cortas es más eficiente, este efecto mesetas y la longitud óptima del PFF es aproximadamente 50 nm4,18. También es importante no Sonicar excesivamente las muestras y exponer las PFFs a calor excesivo, ya que esto puede disminuir la eficiencia de siembra. Estos PFFs sonicados deben ser probados para la eficacia en cultivo de células pequeñas o experimentos in vivo antes de su uso en experimentos a mayor escala. Como diferentes sesiones de sonicación tienen el potencial de introducir la variabilidad, los grupos de tratamiento experimental deben planificarse en consecuencia.
Cuando se entregan PFFS in vivo, la localización de los sitios de inyección y la cantidad total de PFFS utilizados puede afectar el número de neuronas que desarrollarán inclusiones, así como la extensión de la neurodegeneración7,14. Las coordenadas en el protocolo proporcionan un lugar para comenzar, pero deben probarse dentro del laboratorio para garantizar que la región objetivo deseada desarrolle patología α-SYN antes de su uso en experimentos a gran escala. Si lo desea, puede utilizar un tinte de rastreo o perlas fluorescentes como una forma de probar la segmentación regional antes de usar PFFs. La cantidad de PFFS utilizadas en vivo varía entre grupos, con la mayoría de los grupos que utilizan un total de entre 5 a 20 μg de PFFS en uno o dividido entre dos sitios de inyección1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14. como el número de sitios de inyección, ubicación de los sitios de inyección, y la cantidad de PFFS inyectados pueden efectos resultados y la progresión de la sinnucleinopatía, los resultados descendentes de los parámetros utilizados deben caracterizarse antes de utilizar el modelo para probar posibles intervenciones o examinar las características temporales del modelo.
Al seleccionar un modelo a utilizar para la prueba de la terapéutica o el estudio de la progresión de la enfermedad, el modelo utilizado debe ser seleccionado para responder mejor a la pregunta. No todos los modelos poseerán ciertas características de la enfermedad de PD, u ofrecerán el plazo necesario para probar posibles intervenciones. El modelo PFF recapitula características clave de la PD, como la patología α-SYN y la neurodegeneración, y puede conducir a deficiencias motoras modestas. El modelo ofrece un curso de tiempo predecible y prolongado, donde las inclusiones forman meses antes de la neurodegeneración. Esto permite a los investigadores examinar y explotar las diferentes fases a lo largo de la progresión prolongada de la sinnucleinopatía. Se espera que el uso actual y futuro del modelo en general sea beneficioso en el estudio de la progresión de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias.

La enfermedad de Parkinson (PD) se caracteriza principalmente postmortem por dos principales características patológicas: la generalizada y progresiva alfa-sinuctosis (α-SYN) patología, y la degeneración nigroestriatal. Después de la inyección en ratones o ratas silvestres, las fibrillas α-SYN preformadas (PFFs) inducen la acumulación progresiva de α-SYN patológico, lo que puede resultar en una degeneración prolongada de las neuronas de la dopamina del del substantia nigra compacta (SNpc) en el transcurso de muchos meses, así como déficits sensoriósticos1,2,3,4,5,6. Las neuronas se exponen a las fibrillas α-SYN, ya sea a través de inyección directa intracerebral o añadidas a los medios de las neuronas cultivadas. Cuando las PFFS se toman en las neuronas, las PFFS actúan para "sembrar" la formación de inclusiones a través de plantillas, y la acumulación de α-SYN endógena en inclusiones fosforiladas1,7,8, 9. Las inclusiones comparten propiedades similares a los cuerpos de Lewy: conteniendo α-SYN fosforilado en serina 129 (pSyn), ubiquitin, y P62; poseer estructuras cuaternarias amiloides como se muestra con tinción de tioflavina positiva; y son resistentes a la digestión proteinasa K1,3,5,7,8,9,10,11, 12. La exposición a la PFF conduce a la formación de la inclusión α-SYN en la primaria y algunas neuronas inmortalizadas en la cultura, así como ratones, ratas y primates no humanos in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Es importante tener en cuenta que las PFFs no llevarán a la formación de la inclusión α-SYN en todos los modelos de cultivo celular y algunas neuronas cultivadas se semilla mejor que otras.
Otra característica importante del modelo in vivo α-SYN PFF son las distintas fases patológicas secuenciales que surgen durante varios meses. En roedores, después de la inyección intrastriatal, la formación de inclusión α-SYN generalmente alcanza picos dentro de la SNpc y muchas regiones corticales dentro de 1-2 meses. Este pico de agregación es seguido por la degeneración nigroestriatal ≈ 2-4 meses después1,3,5. Estas distintas etapas patológicas proporcionan a los investigadores la plataforma con la que estudiar y desarrollar estrategias que 1) disminuyen la agregación α-SYN, 2) las inclusiones α-SYN ya formadas y/o 3) previenen la neurodegeneración subsiguiente. El modelo PFF ofrece claras ventajas y desventajas en comparación con los modelos de sobreexpresión de vector α-SYN mediado por vectores virales y neurotóxicos, como se ha revisado anteriormente6. La elección de qué modelo o enfoque tomar debe determinarse por qué modelo se ajusta mejor a la pregunta que los investigadores están pidiendo.
Aunque el modelo PFF ha sido utilizado con éxito por muchos laboratorios, todavía hay grupos que han experimentado inconsistencias con la generación de fibrillas y la producción de patología α-SYN consistente14. Ejemplos de inconsistencias van desde las PFFs que producen poca o ninguna patología α-SYN, la eficiencia de siembra de lote a lote, e incluso el fracaso de las fibrillas para formar. Por lo tanto, la estandarización de la generación α-SYN PFF y la aplicación in vivo es fundamental para permitir interpretaciones precisas sobre el impacto de las nuevas intervenciones terapéuticas. El siguiente protocolo describe los pasos requeridos para la generación de PFFs a partir de monómeros α-SYN, el control de calidad in vitro de los PFFs una vez formados, la sonicación y medición de PFFs antes de su uso, y sugerencias para facilitar la inyección exitosa in vivo de PFFs en ratas o ratones.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato Thermo</td><td>Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-alfa-sinucleína (fosforilada en serina 129)</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-alfa-sinucleína</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bicinchónico</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>Tubo retráctil médico transparente (diámetro interior de 0,036 pulgadas)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Tubo retráctil médico transparente (diámetro interior de 0,044")</td> <td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop tapa calefactada</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Recubierto de carbono Rejillas de microscopía electrónica</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio (0,53 mm de diámetro exterior; 0,09 mm de diámetro interior; 54 mm de longitud)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de agujas de vidrio</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 80000</td><td></td></tr><tr><td>Monómero de alfa-sinucleína humana para generar fibrillas</td> <td>preformadasProteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Monómero de alfa-sinucleína de ratón para generar fibrillas preformadas</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>Tubo retráctil médico naranja (diámetro interior de 0,021")</td> <td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica punta</td> <td>de 3,2 mmQsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Sónico Qsonica Q125</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Cromogénico LAL Endotoxina Kit de ensayo Genscript</td><td></td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de fibrillas alfa-synucleinas preformadas de monómeros y uso in vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

El uso del modelo in vivo de fibrina preformada (α-SYN PFF) de la sinnucleinopatía está ganando popularidad entre los investigadores con el objetivo de modelar la sinnucleinopatía y la degeneración nigroestriatal de la enfermedad de Parkinson. La estandarización de la generación α-SYN PFF y la aplicación in vivo es fundamental para garantizar una patología α-SYN consistente y robusta. Aquí presentamos un protocolo detallado para la generación de fibrillas a partir de los pasos de control de calidad monomérico α-SYN, post-fibrilización, y los parámetros sugeridos para la inyección neuroquirúrgica exitosa de PFFs α-SYN en ratas o ratones. Comenzando con α-SYN monomérica, la fibrlización se produce durante un período de incubación de 7 días mientras se agita en condiciones óptimas de amortiguación, concentración y temperatura. El control de calidad posterior a la fibrlización se evalúa mediante la presencia de fibrillas pelletables mediante un ensayo de sedimentación, la formación de conformación amiloide en las fibrillas con un ensayo de tioflavina T y la visualización microscópica electrónica de las fibrillas. Mientras que la validación exitosa utilizando estos ensayos es necesaria para el éxito, no son suficientes para garantizar que las PFFs sembrarán inclusiones α-SYN en las neuronas, ya que dicha actividad de agregación de cada lote PFF debe probarse en el cultivo celular o en cohortes de animales piloto. Antes de su uso, las PFFs deben ser sonicadas bajo condiciones estandarizadas con precisión, seguidas de un examen con microscopía electrónica o dispersión de luz dinámica para confirmar que las longitudes de fibrl están dentro del rango de tamaño óptimo, con una longitud media de 50 nm. Las PFFs pueden añadirse a los medios de cultivo celular o utilizarse en animales. La patología detectable por inmunostinamiento para la fosforilada α-SYN (psyn; serina 129) es aparente días o semanas más tarde en el cultivo celular y los modelos de roedores, respectivamente.

La generación de fibrillas a partir de monómeros α-SYN comienza con la determinación de la concentración de los monómeros. Tanto el ensayo de BCA como la medición de la absorbancia a 280 nm (A280) pueden utilizarse para medir el contenido de proteínas; los resultados del ensayo BCA, sin embargo, sugirieron una concentración más alta que el método A280. Las PFFs derivadas del monómero α-SYN del ratón tenían un valor BCA de 14,05 ± 0,22 y un A280 de 8,05 ± 0,03 μg/μL (figura 1). Asimismo, las PFFs derivadas del monómero α-SYN humano también parecían estar en una concentración más alta, con un valor de BCA de 12,95 ± 0,38 y un A280 de 7,83 ± 0,05 μg/μL (figura 1). Las mediciones de A280 son específicas de α-SYN en función de la inclusión de los coeficientes de extinción y estos resultados se utilizaron para diluir los monómeros antes de la incubación de 7 días.
Antes de la incubación, el líquido que contenía los monómeros α-SYN era claro, pero debería aparecer turbia después de la formación de fibrl. El examen con microscopía electrónica de transmisión confirmó la presencia de fibrillas largas, midiendo 10-20 Nm de ancho (figura 4). En comparación, los monómeros α-SYN apenas eran visibles sin una forma discernible aparente (figura 4). Con la confirmación visual de las estructuras fibrilares, la conformación amiloide de las fibrillas es la siguiente característica de las PFFs que deben confirmarse usando un ensayo de tioflavina T. Thioflavin T exhibe fluorescencia mejorada cuando se enlaza a amiloide; por lo tanto, el aumento de la señal fluorescente de las muestras indica presencia de amiloide. Como ejemplo, tioflavina en dPBS produjo una señal de 3.287 ± 580 unidades fluorescentes relativas (RFU), el monómero de ratón α-SYN produjo una señal de 4.174 ± 158 RFU, y los PFFs del ratón produjeron una señal de 59.754 ± 6.224 RFU (figura 5). En comparación, el monómero α-SYN humano produjo una señal similar de 4.158 ± 105 RFU al monómero del ratón, y las PFFs humanas produjeron una señal más alta de 1.235.967 ± 113.747 RFU en comparación con las PFFs del ratón (figura 5). Para evaluar la presencia de fibrillas pelletables, se realizó un ensayo de sedimentación. Las fibrillas se precipitarán con centrifugación. Tanto en el ratón como en las muestras humanas de PFF, la fracción sobrenadante debe tener más proteínas en el pellet que el sobrenadante (figura 6). En contraste, la mayor parte de la proteína del ratón y de los monómeros humanos estaba presente en el sobrenadante, con poco presente en el pellet (figura 6). Con las PFFs visiblemente presentes por la microscopía electrónica, las estructuras amiloides presentes y las fibrillas granuladas, las PFFs pasaron todos los pasos de control de calidad in vitro.
Tanto el ratón como las PFFS humanas se sonicaron para producir PFFS de longitudes apropiadas para la siembra de inclusiones α-SYN4,18. Las PFFs se diluyeron a la concentración deseada de 4 μg/μL y se sonicaron. Inmediatamente antes de la cirugía, se fotografiaron 25 fibrillas representativas mediante microscopía electrónica y se midieron para comprobar el tamaño de la fibrl. Los PFFs de ratón sonicados miden 48,8 ± 3,1 nm, mientras que los PFFs humanos miden 52,1 ± 4,4 Nm de longitud; Las PFFs de ambas especies fueron por lo tanto la longitud apropiada (50 nm o menos) para inducir la actividad de siembra. Un examen más exhaustivo de aproximadamente 500 fibrillas reveló la distribución promedio de longitud y longitud de las fibrillas de ratón sonicadas. La longitud media fue de 44,4 ± 0,6 Nm, con un 86,6% de las PFFs que miden 60 nm o menos (figura 4). En comparación, los PFFs humanos promediaron 55,9 ± 1,1 nm con el 69,6% de las PFFs que miden 60 nm o menos (figura 4).
Después de la inyección intrastriatal de PFFS de ratón sonicados en ratas como se describió anteriormente3,5, una serie de secciones de tejido fueron procesados en 2 meses después de la cirugía, cuando el número de inclusión que contiene neuronas se sabe que pico en el SNpc, para la confirmación de las inclusiones α-SYN fosforiladas5. La inclusión de las neuronas de rodamiento, según lo indicado por la tinción inmunohistoquímica para pSyn (anticuerpo en la tabla de materiales), está presente en el SNpc (figura 7), así como en otras regiones del cerebro que inervan el estriado (anterior núcleo olfativo, motor, cingulato, piriforme, prelimbic, somatosensorial, entorhinal, y cortices insulares, amígdala, striatum)1,3,4,5,19. Estas inclusiones comparten propiedades similares con los cuerpos de Lewy, como la tioflavina de Unión y la resistencia del α-SYN total a la proteinasa K (figura 7), como se muestra en la tinción inmunohistoquímica (anticuerpo y proteinasa k en la tabla de materiales) . La confirmación de la siembra en el cerebro indica que se ha aprobado el control de calidad in vivo, y las alícuas de PFFs previamente congeladas y guardadas del mismo lote pueden ser sonicadas bajo parámetros idénticos, con longitudes validadas, en experimentos más grandes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figura 1 . Métodos para la generación de fibrillas α-SYN. Contorno de los pasos requeridos para producir fibrillas a partir de monómeros α-SYN. Los monómeros se centrifugados durante 10 min (15.000 x g, a 4 ° c). El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y la concentración de proteína se determina por la absorbancia a 280 nm, o un ensayo BCA. El gráfico muestra las concentraciones de los monómeros α-SYN humanos y del ratón. Las columnas indican los medios del grupo, las barras de error representan el error estándar ± 1 de la media. Después de determinar la concentración de proteínas, los monómeros α-SYN se diluyen, se vortexan brevemente y se incube durante 37 ° c durante 7 días, mientras se agita en un mezclador orbital fijado a 1.000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Figura 2 . Métodos de tinción para microscopía electrónica de transmisión. Diagrama de tinción negativa para microscopía electrónica. A) imágenes que representan rejillas de muestras de microscopía electrónica. La rejilla tiene un lado opaco o ligero y un lado brillante u oscuro. El lado brillante/oscuro está recubierto con una película de soporte de Formvar/carbono. B) ilustración del procedimiento de tinción. La rejilla está flotando lado brillante/oscuro hacia abajo en la primera gota de ddH2O durante 1 min y el exceso es malvado con papel de filtro. El proceso se repite con la segunda gota de ddH2o, las PFFS diluidas o los monómeros, dos gotas de acetato de uranil, y dos gotas adicionales de DDH2o. las rejillas se pueden almacenar en una caja de rejilla hasta que se haya creado una imagen. Barra de escala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figura 3 . Montaje de jeringas de aguja de vidrio personalizadas. Diagrama de los pasos necesarios para ensamblar jeringas de aguja de vidrio adjuntas. Tubos capilares de vidrio siliconado se extraen y se cortan en el medio para producir agujas de vidrio. El tubo de envoltura retráctil se utiliza para preparar la aguja metálica y formar un sello interior cuando la aguja de vidrio se desliza sobre la aguja metálica. Dos capas adicionales de tubo de envoltura retráctil que se superponen con la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica se añaden consecutivamente y se aplica calor para asegurar la aguja de vidrio y formar un sello hermético al agua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figura 4 . Visualización de monómeros α-SYN y fibrillas α-SYN mediante microscopía electrónica de transmisión. Micrografías representativas de monómeros y fibrillas α-SYN. Paneles superiores: ratón y monómero α-SYN humano. Paneles medios: ratón de longitud completa y PFFs humanos α-SYN. paneles inferiores: ratón y PFFs humanos α-SYN después de la sonicación. Gráfico inferior: distribución del ratón sonicado y longitudes de PFF α-SYN humanas. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figura 5 . Confirmación de estructuras amiloides por ensayo de tioflavina T. Medición de la señal fluorescente del ratón y del monómero α-SYN humano y de las muestras de PFF. Izquierda: resultados de los monómeros α-SYN del ratón y de las PFFs α-SYN. Derecha: resultados de monómeros α-SYN humanos y PFFs α-SYN. En cada gráfico se muestra un control negativo de dPBS. Todas las mediciones se expresan como unidades fluorescentes relativas (RFU). Las columnas indican los medios del grupo, las barras de error representan el error estándar ± 1 de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figura 6 . Ensayo de sedimentación para granulable α-SYN. images de Coomassie teñidos. Las bandas mostradas son aproximadamente 14 kDa basadas en la escalera de proteína. Izquierda: monómero de ratón y PFFs. Derecha: monómeros humanos y PFFs. Para todas las muestras de monómero y PFF, se muestra el pellet resuspendido (P) y el sobrenadante (S). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figura 7 . Características de las inclusiones en el modelo de rata confirmando la patología α-SYN. Micrografías representativas de la del substantia nigra pars compacta a los 2 meses después de la inyección. Izquierda: neuronas que contienen pSyn y contra teñida con violeta cresilo. Medio: thioflavin S neuronas positivas. Derecha: inclusiones que contienen α-SYN resistentes a la proteinasa K. barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El objetivo de este artículo es delinear los pasos requeridos para la generación de fibrillas a partir de alfa-synuclein monomérica, control de calidad subsiguiente y uso de las fibrillas preformadas in vivo.

Generación de fibrillas alfa-Synucleinas preformadas de monómeros y uso in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

El modelo de fibriedad preformada Alpha-Synuclein está siendo utilizado por laboratorios de todo el mundo para estudiar sinucleinopatías. Aunque el modelo ha sido utilizado con éxito por muchos laboratorios, algunos grupos han experimentado incoherencias que generan fibrillas y producen una patología consistente de alfa-sinucleína. Esperamos que este protocolo, que detalla la generación de fibrillas a partir de monómeros de alfa-sinucleína y el uso de fibrillas preformadas in vivo, pueda responder a las preguntas que los investigadores tienen sobre el uso del modelo.El modelo de alfa-sinoucleina preformada fibríal recapitula características clave de la enfermedad de Parkinson, como la patología de la alfa-sinucleína y la neurodegeneración. Y se ha demostrado que conduce a deficiencias motoras modestas en algunos modelos animales. La formación de inclusiones que contienen alfa-sinucleína fosforilada y curso de tiempo prolongado hacia la neurodegeneración ofrece a los investigadores diferentes etapas a lo largo de la progresión de la sinucleinopatía, para estudiar y apuntar a posibles intervenciones terapéuticas.Demostrando la preparación de agujas de vidrio personalizadas. Para comenzar este procedimiento, descongele los monómeros de alfa-sinucleina sobre hielo. Re-des-rebanó los monómeros descongelados moviendo suavemente en el tubo.Y centrifugar a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de micro centrífuga limpio de 1,5 ml y registre la cantidad transferida. Diluir los monómeros con 1 dPBS a una concentración final de 5 mg por ml.Brevemente vórtice para mezclar, y centrifugar brevemente para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo. A continuación, utilice una película adhesiva para fijar la tapa del tubo de micro centrífuga cerrada. Coloque el tubo en un mezclador térmico orbital con una tapa durante siete días a 37 grados Celsius mientras agita a 1.000 rpm.Al final de siete días, el contenido del tubo debe aparecer turbio. En primer lugar, no haga todo el equipo de protección personal necesario, incluidos guantes, una bata de laboratorio y un protector facial. A continuación, en una campana de cultivo celular, conecte una sonda de 3,2 mm de diámetro al convertidor.Ajuste la amplitud de los sonicadores a 30% y pulse a un segundo y un segundo de apagado y el tiempo a un minuto. Descongelar las fibrillas a temperatura ambiente, y mientras todavía está en la campana de cultivo, diluir las fibrillas con dPBS estériles. A continuación, humedezca un tejido de laboratorio con 70% de etanol y utilícelo para limpiar la sonda del sonicador para limpiarlo.Sumerja la punta de la sonda en agua de doble destilación y pulse 10 veces para limpiar aún más la sonda. Después de esto, limpie la sonda con un pañuelo de laboratorio. Coloque la punta de la sonda limpia en el tubo de fibrillas diluidas y coloque la punta en la parte inferior del tubo.Sonicar las fibrillas diluidas utilizando los parámetros previamente establecidos mientras mueve la sonda hacia arriba y hacia abajo durante cada pulso para asegurarse de que todas las fibrillas en el líquido son sonicadas. Después de la sonicación, centrifugar brevemente durante un segundo a 2.000 g para recoger todo el líquido de los lados del tubo. Sumerja la punta de la sonda en 1%SDS y pulse 10 veces para limpiar la sonda.A continuación, retire la punta de la SDS y sumerjala en agua destilada doble y pulse 10 veces. Limpie la sonda con un tejido de laboratorio humedecido con 70%etanol y límpiela con un tejido de laboratorio seco. Separe la sonda del convertidor y guárdela.Después de esto, limpie todas las superficies en la campana con 1%SDS seguido de 70%etanol. Para comenzar, coloque un tubo capilar de vidrio siliconizado en un tirador de aguja de vidrio. Encienda el elemento calefactor y deje que los pesos adjuntos estiren el tubo capilar de vidrio calentado.A continuación, utilice tijeras para cortar el tubo capilar de vidrio tirado en el punto más delgado en el medio y retire la aguja de vidrio del tirador de aguja de vidrio. A continuación, utilice tijeras para cortar una longitud de tubo de envoltura retráctil a aproximadamente 40 mm. Deslice la envoltura retráctil sobre la aguja metálica de una jeringa biselada de 10 microlitrotro.Utilice una llama abierta para calentar y adherir la envoltura retráctil a la aguja, mientras se asegura de girar la aguja para aplicar el calor uniformemente. Deslice el extremo más grande de la aguja de vidrio tirado cuidadosamente sobre la aguja metálica de la jeringa. Después de esto, corte una longitud de tubo de envoltura retráctil a aproximadamente 40 mm y deslícela cuidadosamente sobre la aguja de vidrio para superponer la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica de la jeringa.Utilice una llama abierta para calentar la envoltura retráctil para fijar la aguja de vidrio a la aguja de metal. Para asegurar aún más la aguja y evitar posibles fugas, corte una longitud adicional de tubo de envoltura retráctil a aproximadamente 40 mm, y deslícela cuidadosamente sobre la aguja de vidrio para superponer la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica de la jeringa. Utilice una llama abierta para calentar la envoltura retráctil para fijar la aguja de vidrio a la aguja de metal.A continuación, utilice tijeras para recortar la aguja de vidrio de modo que la punta tenga aproximadamente 8 mm de largo. Para probar la aguja, llene una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 26 con agua destilada. Retire el émbolo metálico de la jeringa de aguja de vidrio personalizada e inserte la aguja de la jeringa llena de agua en la base de la jeringa personalizada.Inspeccione la interfaz de la aguja de vidrio y la aguja metálica en busca de fugas y confirme un flujo constante de agua. A continuación, llene un tubo de micro centrífuga con agua destilada. Utilice la jeringa de aguja de vidrio personalizada para extraer el agua destilada.Inspeccione la aguja para confirmar que se está tomando líquido en la jeringa y que no hay burbujas. Si hay burbujas, o si el agua no se está acumulando en la aguja, recortar la aguja puede ayudar a aliviar la presión. Después de esto, guarde cuidadosamente la jeringa con las agujas de vidrio adjuntas, en las cajas de jeringa hasta que sea necesario para las cirugías.El examen con microscopía electrónica de transmisión confirma la presencia de fibrillas largas. En comparación, los monómeros alfa-sinucleína son visibles para la cebada y no tienen forma discernible. La confirmación analoides de las fibrillas se confirma mediante un ensayo de Tioflavina T.Un ensayo representativo muestra que los monómeros dPBS y ratón producen una señal más baja en unidades de harina relativas en comparación con el fórfeno de ratón PFF. El monómero de alfa-sinucleína humana produce una señal similar al monómero de ratón. Mientras que los PFF humanos también producen una señal más alta que los monómeros.Para asece la presencia de fibrillas pelitibles, se realiza un ensayo de sedimentación. Tanto en las muestras de ratón como en las muestras humanas de PFF, la infracción supernate debe tener más proteína en el pellet que el sobrenadante. Por el contrario, la mayoría de la proteína del ratón y los monómeros humanos está presente en el sobrenadante con poco presente en el pellet.Tanto el ratón como los PFF humanos son sonicados para producir PFF de longitudes apropiadas para sembrar inclusiones de sinucleínas alfa. Un examen exhaustivo de aproximadamente 500 fibrillas revela que la longitud media de las fibrillas de ratón es de aproximadamente 44 nanómetros. Con el 86,6% de los FF de 60 nanómetros o menos.Los PFF humanos, sin embargo, tienen una longitud media de aproximadamente 55,9 nanómetros con el 69,6% de los FF que miden 60 nanómetros o menos. El examen in vivo de la eficacia de PFF se confirma mediante inmunohistoquímica. Las inclusiones formadas en la sustancia nigra, comparten propiedades similares a los cuerpos de Lewy en que contienen fosforilada alfa sinucleína, contienen estructuras aminloyed, y manchan con tioflavina S, y son resistentes a la digestión de Proteinase K.La sonicación puede exponer la sonicación individual a fibrillas preformadas aerosolizadas. Como tal, se debe usar un atuendo de seguridad adecuado y realizar la sonicación en una capucha para minimizar el riesgo de exposición.

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Investigación

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Neurociencia

Este video muestra la inyección de fibrillas de alfa-sinucleína en un ratón para inducir neuroinflamación. Las fibrillas se inyectan por vía intraperitoneal en un ratón transgénico que expresa proteínas alfa-sinucleína mutadas. Al llegar al sistema nervioso central, las fibrillas entran en las neuronas e inducen la agregación de las proteínas mutadas. Los agregados se propagan a las neuronas vecinas, la microglía y los astrocitos. El reconocimiento de los agregados desencadena la microglía para...

Inducción de neuroinflamación en ratones mediante inyección de fibrillas de alfa-sinucleína

Este video demuestra el proceso de cuantificación de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas embrionarias de dopamina de ratón pretratadas con fibrillas preformadas de alfa-sinucleína. Describe los pasos para fijar, teñir y cuantificar las neuronas dopaminérgicas que contienen agregados de alfa-sinucleína mediante inmunofluorescencia.

Estudio de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Se describe una ELISA que ofrece un enfoque cuantitativo novedoso. Detecta específicamente alfa-sinucleína asociada a la enfermedad (αSD) en un modelo de ratón transgénico (M83) de sinucleinopatía utilizando varios anticuerpos contra la forma de alfa-sinucleína fosforilada en Ser129 o la parte C-terminal de la proteína.

La detección de la enfermedad asociada-α-sinucleína por ELISA mejorada en el cerebro de ratones transgénicos que sobreexpresan A53T humano mutado α-sinucleína

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez más insoluble/agregada a partir de tejido cerebral humano post-mortem. Mediante la utilización de tampones con una fuerza detergente creciente y técnicas de ultracentrifugación de alta velocidad, se pueden examinar las propiedades variables de la agregación α-syn en tejidos enfermos y no enfermos.

Extracción secuencial de soluble e insoluble alfa-sinucleína de cerebros parkinsonianos

Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo o la lengua de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que expresan alfa-sinucleína humana con la mutación A53T familiar y luciferasa de luciérnaga, puede inducir la neuropatología, incluyendo la neuroinflamación , en su sistema nervioso central.

Imágenes de bioluminiscencia de la neuroinflamación en ratones transgénicos Después periférica La inoculación de la alfa-sinucleína fibrillas

El objetivo de este protocolo es proporcionar un sistema celular que imita la formación de alfa-sinucleína agregados en vivo. Inclusiones intracelulares de alfa-sinucleína se siembran en las neuronas primarias por la internalización y propagación de exógenos administrados agregados de alfa-sinucleína microsomas asociados nativos aislados de ratones transgénicos de alfa-sinucleína enfermo.

Administración exógena de alfa-sinucleína asociada a microsomas agregados a las neuronas primarias como un modelo de celular de gran alcance de la formación de las fibrillas de

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudiar la acumulación de sinucleína neuronal en las neuronas primarias de dopamina de ratón. Los agregados de sinucleína fosforilada en las neuronas se inducen con fibrillas preformadas de sinucleína. Las imágenes automatizadas de células etiquetadas inmunofluorescentemente y análisis de imágenes imparciales hacen que este protocolo robusto sea adecuado para el cribado de rendimiento medio-alto de fármacos que inhiben la acumulación de sinucleína.

Estudio de la acumulación preformada de la dopamina fibril-sinucleina en las neuronas de dopamina de cerebro medio del ratón embrionario primario

Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.

Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado

El presente protocolo describe un método para la administración intranasal de agregados de α-sinucleína. Este método proporciona información sobre la propagación de la α-sinucleína desde la mucosa olfativa hasta el bulbo olfatorio en la enfermedad de Parkinson.

Técnica de administración intranasal de agregados de α-sinucleína

Aprende a generar fibrillas preformadas de alfa-sinucleína a partir de monómeros y su uso in vivo en modelos de Parkinson. Este protocolo estandarizado incluye control de calidad y técnicas de inyección neuroquirúrgica para asegurar patología reproducible.

Generación de fibrillas alfa-Synucleinas preformadas de monómeros y uso in vivo

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