Name: En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a realizar imagen óptica transcraneal en ratones vivos para estudiar el transporte de líquido cefalorraquídeo y la función glimfática mediante macroscopía de fluorescencia. Esta técnica permite mediciones dinámicas con menor costo.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos; R01NS100366 y RF1AG057575 a MN), el Programa de Redes Transatlánticas de Excelencia De la Fundación Leducq y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la UE (concesión no 666881; SVDs-target). También nos gustaría dar las gracias a Dan Xue por la asistencia de expertos con ilustraciones gráficas.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales (UCAR, Protocolo No. 2011-023) en la Universidad de Rochester y realizados de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de la cánula cisterna magna, la placa de la cabeza y el soporte para la cabeza
<ol><li>Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y placas de cabeza antes de la cirugía. NOTA: Los trazadores fluorescentes se entregan directamente en el CSF a través de una cannulación cisterna magna. Para obtener instrucciones detalladas sobre este procedimiento, consulte Xavier et al9.</li>
	<li>Brevemente, usando un controlador de aguja, rompa la punta de una aguja de 30G x 12.7 mm (1/2 pulgada), 3/4 del camino hacia abajo, y coloque el extremo romo de la aguja en un extremo de la tubería de polietileno 10 (PE10) (alrededor de 45 cm de largo). Asegúrese de que sólo el bisel sobresale de la frontera del tubo PE10.</li>
	<li>Romper 1/4 del extremo biselado de otra aguja de 30G y colocar el extremo romo de la aguja restante en el otro extremo del tubo PE10, con el luer-bloqueo de plástico todavía unido.</li>
	<li>Llenar una jeringa de vidrio de 100 ml con LCP artificial estéril (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM de glucosa y 26 mM NaHCO3).</li>
	<li>Coloque la jeringa al final de la línea y llénela con aCSF hasta que llegue a la punta de la aguja biselada. Es importante que la jeringa esté rellena da aCSF y no con aire, ya que una columna de aire es más propensa a volúmenes de perfusión variables.</li>
	<li>Para experimentos crónicos, deje la línea llena de aCSF y omita el paso 1.7.</li>
	<li>Para experimentos agudos, coloque la jeringa en una bomba de perfusión y retire aproximadamente 5 mm de aire, lo que evitará la mezcla. Después, retire el volumen total de trazadores que se desea para el experimento (se recomienda un 20% adicional debido a pérdidas de espacio muerto). NOTA: El tubo PE10 debe ser lo suficientemente largo para que la burbuja de aire no entre en el manguito de plástico de la jeringa de vidrio al cargar el trazador. Para un experimento típico, el protocolo utiliza 10 l de albúmina sérica bovina conjugada con Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluida en aCSF al 0,5%.</li>
	<li>Confirme que la placa de la cabeza encaja en el soporte de la cabeza y que tiene el tamaño adecuado para el ratón que se está utilizando. Marcadores anatómicos para asegurarse de que esto son: el borde superior de la ventana se alinea con la línea interocular y el borde posterior cae rostral a la cresta occipital. NOTA: Las placas de cabeza de acero inoxidable se pueden esterilizar y reutilizar. La mayoría de las mezclas de cianoacrilato se pueden eliminar con una solución de acetona.</li>
</ol>2. Procedimiento quirúrgico
<ol><li>Pesar y anestesiar el ratón (por ejemplo, ketamina/xilazina; 100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilazina; i.p.).</li>
	<li>Una vez que el ratón ya no responde a un pellizco del dedo del dedo del sol, humedezca el cuello y la cabeza con agua estéril y afitúe con cortadoras. Una vez que el área esté asenada, limpie el área con un hisopo de alcohol de nuevo para eliminar cualquier vello residual. NOTA: Humedecer el pelaje antes de recortar reduce drásticamente la cantidad de cabello en la ventana de imágenes después de la incisión.</li>
	<li>Coloque el ratón en un marco estereotáctico encima de una almohadilla de temperatura controlada y aplique pomada oftálmica de petróleo a los ojos del ratón para asegurarse de que no se sequen.</li>
	<li>Limpie la piel expuesta con un hisopo de clorhexidina. Después de 2 min, retire la clorhexidina con una toallita con alcohol. Por último, aplicar una solución de yodo que se puede dejar secar.</li>
	<li>Inyectar analgesia subcutánea (0,25% Bupivacaína HCl) en la parte superior del cráneo y el cuello.</li>
	<li>Comenzando en la parte del cuello que cubre la cresta occipital, haga un corte de línea media en la piel superpuesta y continúe rostrally hacia la línea interorbital. Incise lateralmente al borde donde el músculo temporal se inserta en el cráneo. Retire toda la piel de la incisión fusiforme para exponer los huesos frontales y parietales. ADVERTENCIA: El seno retroorbital se encuentra caudal a los ojos y grandes ramas de la vena facial posterior se encuentran rostral a la pinna. Tenga cuidado al hacer la incisión para evitar estas estructuras. Si esto ocurre, deje de sangrar manteniendo la hemostasis con un hisopo de algodón estéril durante varios minutos y continúe.</li>
	<li>Irrigar el cráneo con solución salina estéril y limpiar la superficie con hisopos de algodón para que esté libre de escombros y cabello, ya que estos interferirán con la calidad de la imagen. La transparencia del cráneo se conserva mejor dejando intacto el periosteo y la fascia superpuesta. NOTA: Si estas estructuras se retiran accidentalmente, el cráneo puede volverse seco y opaco con el tiempo. Rehumedezca con aCSF o utilice una mezcla de aceite de parafina y glicerol para reducir la reflectancia del cráneo en experimentos agudos21.</li>
	<li>Proceder a la inserción de la cisterna magna cánula - para los detalles quirúrgicos de este procedimiento, consulte Xavier et al9.</li>
	<li>Después de insertar la cánula CM, aplicar una mezcla de cemento dental con pegamento de cianoacrilato en el lado ventral de la placa de la cabeza alrededor del borde y colocarlo en el cráneo para que el borde anterior de la placa de la cabeza se alinee con la punta posterior del hueso nasal y el po borde del esterilizador se alinea con el aspecto anterior del hueso interparietal, asegurándose de que la sutura sagital (línea media) esté centrada y recta en relación con la ventana (Figura1B).</li>
	<li>Fije la posición de la placa de la cabeza usando un par de gotas de acelerador de pegamento. Llene los huecos restantes con la mezcla de cemento y cúsala con el acelerador. ADVERTENCIA: Asegúrese de que el cianoacrilato no entre en contacto con los ojos del ratón ni bloquee la ventana de imágenes.</li>
	<li>Pegue la cánula CM a la placa de la cabeza para asegurarse de que no se desenrosquen durante el transporte o cuando el ratón se despierte.</li>
	<li>Para experimentos agudos, vaya al paso 2.16.</li>
	<li>Para experimentos crónicos, aplique una fina capa de pegamento de cianoacrilato de secado claro al cráneo expuesto, teniendo cuidado de no crear burbujas ya que estas interferirán con la imagen. El pegamento proporciona protección para el cráneo y no interferirá con la imagen. Asegúrese de que el pegamento cubra el cráneo expuesto hasta la piel en el borde de la incisión.</li>
	<li>Utilice una abrazadera hemostat para sujetar el tubo PE10 lleno de aCSF a 2-3 cm del CM y corte la línea con una punta de cauterión de alta temperatura. Una vez separado, aplanar el tubo PE10 derretido para sellar la cánula. ADVERTENCIA: Asegúrese de no soltar la abrazadera hasta después de que la cánula haya sido sellada y confirme que no hay fugas en el tubo para evitar una fístula del líquido de seguridad.</li>
	<li>Administrar carprofeno (5 mg/kg cada 24 h durante 3 días; es decir, es decir, s.c.) y devolver el ratón a una jaula de una sola casa con control de temperatura y permitir que se recupere durante al menos 24 horas antes de la toma de imágenes. No deje el ratón desatendido hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal. Las ventanas craneales intactas permanecen estables durante varias semanas. NOTA: El experimento crónico se puede pausar aquí. ADVERTENCIA: Algunas complicaciones postoperatorias son: cefalohematoma/hematomas subgaleales, fístula de csfólico e infección.</li>
	<li>Para experimentos agudos, coloque el ratón en el soporte de la cabeza usando la placa de la cabeza para que el cráneo esté en una posición fija. Asegúrese de revisar el nivel de anestesia y colocar una almohadilla de calentamiento debajo del ratón. El ratón ya está listo para ser llevado al macroscopio. ADVERTENCIA: Transporte cuidadosamente el ratón junto con la bomba de perfusión en un carro. Si la cannulación de CM se desaloja, causará una caída en la presión intracraneal y cualquier fuga de líquido cefalorraquídeo alterará los resultados experimentales.</li>
</ol>3. Preparación del ratón para la toma de imágenes
NOTA: El protocolo varía en función de si el experimento de imágenes se realizará en un ratón anestesiado (comienza en el paso 3.1) o se despierta (comienza en el paso 3.2).
<ol><li>Ratones anestesiados<ol>
<li>Coloque el soporte de cabeza en el escenario del macróscopo, asegurándose de que no haya torceduras en la línea desde la bomba de la jeringa hasta la cánula CM y que no esté tensa ya que esto podría afectar a la perfusión del trazador.</li>
		<li>Observar la frecuencia respiratoria y la coloración rosa de las membranas mucosas, lo que indica una buena oxigenación. Inyecte salina por vía subcutánea para asegurar el nivel de hidratación si es necesario. Compruebe que el animal esté suficientemente anestesiado y redosifique si es necesario.</li>
		<li>Encienda la cámara del macroscopio y el LED e inicie el modo LIVE.</li>
		<li>Confirmar la ampliación del campo de imágenes para que la sutura nasofrontal en la parte superior del campo y la sutura lambdoid en la parte inferior se pueda visualizar claramente, con la sutura sagital paralela y centrada en el centro de la imagen (Figura 1C). Una vez en su lugar, fije el soporte de la cabeza a la etapa del macroscopio con cinta adhesiva.</li>
		<li>Enfoque el macroscopio en el cráneo expuesto. A pesar de que los macroscopios tienen una profundidad de campo relativamente grande, la curvatura del cráneo del ratón sólo permite que un área específica esté enfocada. Los mejores resultados se obtienen cuando el plano focal se encuentra en los lados laterales de los huesos parietales posteriores a las suturas coronales. NOTA: Esta es la ubicación de las arterias cerebrales medias (MCA), donde se produce la mayor entrada de LIF (Figura1D,E)10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ratones Despiertos<ol>
<li>Antes de la sesión de diagnóstico por imágenes, deje que los animales se recuperen durante al menos 24 horas de la cirugía de la placa de cabecera. También se recomiendan períodos de recuperación más largos (5-7 días). Durante este tiempo, entrenar el ratón para ser cabeza fija en el escenario en el tubo de sujeción para 0.5-1 h por día durante el período de recuperación. NOTA: La habituación permite que el ratón se adhiera al soporte del cabezal sin anestesia y reduce el estrés y la ansiedad durante el experimento real. Si esto no es factible y la anestesia no interfiere con el experimento, se puede utilizar una dosis de inducción de un anestésico inhalado (por ejemplo, isoflurano 2% a 1-2 L/min O2 caudal) para conectar rápidamente el ratón a la etapa de la cabeza.</li>
		<li>Una vez que el ratón esté fijado al soporte del cabezal y en el tubo de sujeción, siga los pasos 3.1.1-3.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Infusión de trazadores fluorescentes de CSF
<ol><li>
Canlación aguda de CM
	<ol>
<li>Dado que el trazador ya estaba cargado en la cánula antes de ser colocado en la cisterna magna en el paso 1.6, ajuste la bomba de perfusión a la velocidad y volumen deseados. Los paradigmas de infusión que se utilizan habitualmente son de 5-10 l a 1-2 l/min, pero estos parámetros se pueden ajustar dependiendo del experimento en particular, o del tamaño y la edad del animal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Canlación crónica de CM
	<ol>
<li>Antes de comenzar la sesión de diagnóstico por imágenes, siga los pasos 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar la línea de perfusión para entregar los trazadores.</li>
		<li>Una vez preparada la línea, utilizando una abrazadera hemostat cortar el extremo sellado de la cánula CM crónica. Tome la aguja de la línea preparada en el paso 4.2.1 e insértela suavemente en la cánula. Suelte la abrazadera y, utilizando la bomba de la jeringa, avance el trazador de líquido de seguridad digital a la velocidad de perfusión deseada (p. ej., 2 l/min) para el experimento hasta que el trazador alcance la aguja implantada en el CM. ADVERTENCIA: Si la aguja atraviesa el tubo al conectar la línea, retire la aguja, corte el segmento perforado y repita este paso. Cualquier desgarro en el tubo PE10 causará una fuga y afectará los resultados del experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Configuración de la sesión de imágenes
<ol><li>Basándose en el trazador fluorescente que se está infundiendo, determine la longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición para cada canal. Elija el tiempo de exposición más corto necesario para visualizar el trazador con el fin de maximizar la resolución temporal de la imagen de lapso de tiempo. Este tiempo de exposición se utilizará para todos los experimentos posteriores con el objetivo de comparar el transporte de CSF entre diferentes animales. NOTA: Una punta es utilizar el trazador en la línea CM para ajustar el tiempo de exposición. Aunque este es un primer enfoque útil, esto debe optimizarse con el tiempo.</li>
	<li>Elija la duración del experimento y los intervalos en los que se adquirirán las imágenes. Los experimentos normalmente duran entre 30-60 min dependiendo de qué fase del transporte ginfogático es de interés. Las velocidades de fotogramas de 1 fotograma/min y más rápidas son suficientes para la mayoría de los experimentos.</li>
	<li>Establezca el nombre de archivo y el directorio de guardado.</li>
	<li>Si las imágenes se recogen además de la adquisición simultánea de otras variables (por ejemplo, electrocardiograma, presión arterial, electrofisiología), el macroscopio y la bomba se pueden programar para activarse con el software de adquisición de datos. Compruebe que la función de activación del macroscopio es correcta antes de pasar al paso siguiente.</li>
</ol>6. Experimento de imágenes ópticas transcraneales
<ol><li>Inicie la perfusión del trazador y la toma de imágenes al mismo tiempo.</li>
	<li>Revise rutinariamente la cánula CM y el tubo PE10 en busca de cualquier signo de fuga. Si hay alguna fuga de trazador en el CM, se deben excluir los resultados de este experimento. NOTA: Si el marcador comienza a acumularse en el cerebelo y no viaja por la vía ginfotica del MCA, es probable que la cánula CM se haya inyectado en el cerebelo. Estos datos no deben incluirse.</li>
	<li>Para experimentos agudos, después de completar el experimento, retire el ratón del microscopio y compruebe que todavía está adecuadamente anestesiado. Decapita rápidamente el ratón y cosecha el tejido cerebral. Fija el cerebro en 4% paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4oC.<ol>
<li>Para experimentos crónicos, una vez completada la toma de imágenes, retire la línea CM de la cánula, enjuague con aCSF estéril y vuelva a sellar la cánula CM con una punta de cauterización de alta temperatura. Retire el ratón del soporte de la cabeza y devuélvalo a su jaula. Repita este proceso hasta que no se requieran más imágenes y, a continuación, siga el paso 6.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Análisis de datos
NOTA: Los análisis basados en Matlab, como el seguimiento frontal del LIF, pueden extraer grandes cantidades de datos cuantitativos de los frentes del trazador en estos conjuntos de datos de imágenes10,22. Sin embargo, estos tipos de archivos también se pueden importar y analizar fácilmente en software de análisis de imágenes de código abierto como Fiji23.
<ol><li>Importe las pilas de imágenes a Fiji con la herramienta de importación de formatos biológicos. Esta función conservará los metadatos del archivo, que incluye la resolución de tiempo y píxeles. Guarde la pila de imágenes como un archivo .tiff.</li>
	<li>Dibuje manualmente una región de interés (ROI) alrededor del cráneo o el área de interés utilizando la herramienta de selección de polígonos. Por ejemplo, en la Figura 1G se dibujó un ROI por separado para el ipsilateral y para el hemisferio contralateral después de una lesión cerebral traumática. Asegúrese de agregar el ROI al ROI Manager (Analyze>Tools>ROI Manager) y guárdelo. NOTA: El transporte del LSF se puede cuantificar de dos maneras principales: 1) intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo o 2) área de afluencia expresada como porcentaje del ROI o área total (mm2) después de haber aplicado un umbral. Este último método (Figura1H) se describirá en los pasos siguientes.</li>
	<li>Establezca el umbral en el marco con fluorescencia máxima (Seleccionarimagen>Ajustar>Umbral...). Los métodos de umbral automatizados, como Otsu, son normalmente buenos para detectar el trazador de CSF. Aplique el umbral.</li>
	<li>Antes de seguir adelante, asegúrese de que en Analizar>Establecer medidas, las opciones Area y Area Fraction estén seleccionadas. A continuación, en roi manager, seleccione Más>Multimedida.</li>
	<li>Convierta el valor %Area en mm2 utilizando el valor Area del ROI de la salida. Los valores %Area reflejan el porcentaje de la superficie cortical dorsal con el trazador de CSF.</li>
	<li>Trazar la afluencia del trazador CSF en mm2 en función del tiempo.</li>
</ol>

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<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit+%26+Run%27+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+%28TBI%29+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li>
<li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li>
<li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li>
<li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito un protocolo detallado para realizar imágenes transcraneales de LSC en ratones vivos utilizando macroscopios y trazadores fluorescentes disponibles comercialmente. Esta técnica es simple y mínimamente invasiva, pero cuantitativa. La imagen in vivo se correlaciona bien con métodos sensibles como el recuento de centelleo líquido de tracdores radiomarcados, incluidos 3H-dextran y 14C-inulin después de la administración de CM, y con cuantificación de sección coronal ex vivo<sup class="xre...

El líquido cefalorraquídeo (LCR) baña el cerebro y la médula espinal y participa en el mantenimiento de la homeostasis, el suministro de nutrientes y la regulación de la presión intracraneal1. El LESO en el espacio subaracnoideo entra en el cerebro a través de una red de espacios perivasculares (PVS) que rodean las arterias cortales corticales y luego fluye a lo largo de las arterias penetrantes2. Una vez en el parénquima, el Líquido Cefalrea (CSF) intercambia con fluido intersticial (ISF), llevando metabolitos nocivos como el amiloide y los agregados de proteína tau del cerebro a través de vías de materia blanca de baja resistencia y espacios peligrosos2,3 . Esta vía depende de los canales astrogliales de la aquaporina-4 (AQP4) y, por lo tanto, se ha llamado el sistema glial-linfático (ginfotico)4. Los productos de desecho del neuropil se eliminan en última instancia del LIF-ISF a través de vasos linfáticos cerca de los nervios craneales y en las meninges hacia los ganglios linfáticos cervicales5. El fallo de este sistema ha estado implicado en varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer6,7, lesión cerebral traumática3,y accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico8.
El transporte del LSCa se puede visualizar infundiendo marcadores en la cisterna magna (CM)9,10 y estudios glinfoticos en el pasado han utilizado principalmente la microscopía de dos fotones4,11,12, 13, imágenes por resonancia magnética (RM)14,15,16,17y imágenes ex vivo3,6,11, 18 para evaluar la cinética del trazador. La microscopía de dos fotones es un método adecuado para la toma de imágenes detalladas de los trazadores de LSN en pvSpres y el parénquima debido a su alta resolución espacial, sin embargo, tiene un campo de visión estrecho y requiere una ventana craneal invasiva o adelgazamiento del cráneo. La imagen ex vivo, en combinación con la inmunohistoquímica, permite análisis multinivel que van desde células individuales hasta todo el cerebro19. Sin embargo, el proceso de fijación de perfusión que se requiere para observar el tejido post mortem produce cambios profundos en la dirección del flujo de LSN y colapsa el PVS, alterando significativamente la distribución y la ubicación de los trazadores12. Finalmente, mientras que la RMN puede rastrear el flujo de LSF a través de todo el cerebro murino y humano, carece de resolución espacial y temporal del flujo perivascular.
Una nueva técnica, la imagen macroscópica transcraneal, resuelve algunas de estas limitaciones al permitir imágenes de campo amplio del transporte de LSC perivascular en toda la corteza dorsal de ratones vivos. Este tipo de imágenes se realiza con un macroscopio epifluorescente utilizando un cubo de filtro multibanda, una fuente de luz LED ajustable y una cámara CMOS de alta eficiencia10. Estas configuraciones son capaces de resolver PVS hasta 1-2 mm por debajo de la superficie del cráneo y pueden detectar fluoróforos de hasta 5-6 mm por debajo de la superficie cortical mientras dejan el cráneo completamente intacto10. Los filtros multibanda y los LED que pueden ajustar rápidamente la longitud de onda de excitación permiten el uso de múltiples fluoróforos, lo que permite etiquetar el LSC con marcadores de diferentes pesos moleculares y propiedades químicas en el mismo experimento.
Este procedimiento requiere una cirugía simple y mínimamente invasiva para exponer el cráneo y colocar una placa de cabeza ligera para estabilizar la cabeza durante la sesión de diagnóstico por imágenes. Los trazadores se pueden entregar en el CM sin perforar el cráneoo penetrar el tejido cortical con pipetas o cánulas 9,20. Tanto las cánulas CM como las placas de cabeza permanecen estables durante varios días a semanas y facilitan diseños experimentales más complejos en comparación con la visualización clásica de punto final. Este protocolo describe cómo se utilizan imágenes macroscópicas transcraneales para estudiar la función del sistema ginfogático después de la inyección aguda o crónica de un marcador fluorescente de LSN fluorescente en el CM de ratones anestesiados/dormidos o despiertos.

<table><tbody><tr><td>0,25% Bupivacaína HCl</td><td></td><td></td><td>Universidad de Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>100 &micro; L Jeringa hermética al gas modelo 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td><td>Hamilton Company</td><td>81020</td><td></td></tr><tr><td>A-M Systems Cemento dental en polvo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9991371</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td></td><td></td><td>Universidad de Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>Clorhexidina</td><td>Prevantics</td><td>B10800</td><td></td></tr><tr><td>CMOS Cámara</td><td>Hammamatsu</td><td>ORCA Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cabeza</td><td>Universidad de Rochester</td><td>Sin catálogo #</td><td>Hecho a medida en el taller mecánico de la Universidad de Rochester</td></tr><tr><td>Cauterio de alta temperatura</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Insta-set Accelerator</td><td>Bob Smith Industries</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano - Fluriso</td><td>Vet One</td><td>502017</td><td>Universidad de Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>Fuerte Memorial Hospital Farmacia</td></tr><tr><td>Krazy Pegamento</td><td>Elmer's Products, Inc</td><td>Sin catálogo #, ver enlace en comentarios</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td></tr><tr><td>Micropore Cinta quirúrgica</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polietileno .011" x .024" por pie, 100 ft. continuo</td><td>Braintree Scientific</td><td>PE10 Bomba de 100 pies</td><td></td></tr><tr><td>11 Elite Solo infusión Jeringa doble</td><td>Aparato Harvard</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>PURALUBE UNGÜENTO VETERINARIO</td><td>Dechra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puritan PurSwab Palitos de limpieza con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-553</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de investigación con zoom macro</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Placa de soporte de cabeza simple (para ratones)</td><td>Narishige International USA Inc</td><td>MAG-1</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de un solo uso, BD Medical</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas estériles de preparación de alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Tunable LED</td><td>PRIOR Lumen 1600-LED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>Universidad de Rochester Vivarium</td></tr></tbody></table>

en vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

El flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en roedores se ha estudiado en gran medida utilizando la cuantificación ex vivo de los trazadores. Técnicas como la microscopía de dos fotones y la resonancia magnética (RM) han permitido la cuantificación in vivo del flujo de LSN, pero están limitadas por la reducción de los volúmenes de imágenes y la baja resolución espacial, respectivamente. Trabajos recientes han encontrado que el LCH entra en el parénquima cerebral a través de una red de espacios perivasculares que rodean las arterias pial y penetrantes de la corteza de roedores. Esta entrada perivascular del LIF es un factor principal del sistema ginfotico, una vía implicada en el aclaramiento de solutos metabólicos tóxicos (p. ej., amiloide). Aquí, ilustramos una nueva técnica de imagen macroscópica que permite imágenes mesoscópicas en tiempo real de trazadores fluorescentes de CSF a través del cráneo intacto de ratones vivos. Este método mínimamente invasivo facilita una multitud de diseños experimentales y permite realizar pruebas únicas o repetidas de la dinámica del CSF. Los macroscopios tienen una alta resolución espacial y temporal y su gran pórtico y distancia de trabajo permiten la creación de imágenes mientras realizan tareas en dispositivos de comportamiento. Este enfoque de imagen ha sido validado utilizando mediciones de imágenes y fluorescencia de dos fotones obtenidas a partir de esta técnica se correlacionan fuertemente con la fluorescencia ex vivo y la cuantificación de trazadores radiomarcados. En este protocolo, describimos cómo se pueden utilizar imágenes macroscópicas transcraneales para evaluar el transporte ginfogático en ratones vivos, ofreciendo una alternativa accesible a las modalidades de imagen más costosas.

La afluencia de LSF se muestra en un macroscopio epifluorescente (Figura1A),que permite la toma de imágenes mesoscópicas del transporte del trazador de LSF en la corteza murina. La placa de cabeza de cráneo entero permite la visualización de los huesos nasales rostrales, tanto los huesos frontales como parietales en el centro, y la porción rostral del hueso interparietal caudalmente (Figura1B). Durante las imágenes, las suturas nasofrontal, sagital, coronal y la...

Las imágenes ópticas transcraneales permiten imágenes de campo amplio del transporte de líquido cefalorraquídeo en la corteza de ratones vivos a través de un cráneo intacto.

En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Esta nueva técnica para la toma de imágenes mesoscópicas en tiempo real de trazas florescentes de lesc a través del cráneo intacto de ratones vivos se puede utilizar para evaluar el transporte glimático. La principal ventaja es que esta técnica permite mediciones dinámicas de trazadores intracisternales in-vivo a una fracción del costo de otras modalidades de imagen. Los procedimientos necesarios para colocar la placa de la cabeza en la cánula magna cisterna son simples y mínimamente invasivos, pero requieren que la práctica se realice correctamente.La demostración visual de los pasos críticos de este método es necesaria para maximizar la calidad de la imagen y permitir comparaciones reproducibles entre diferentes ratones y grupos experimentales. Después de confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pies mojar el cuello y la cabeza con agua estéril y afeitar el pelaje humedecido. Limpie la piel expuesta con un hisopo de alcohol para eliminar cualquier vello residual y coloque el ratón en un marco estereotáctico encima de una almohadilla de temperatura controlada.Aplicar pomada en los ojos de los animales y limpiar la piel expuesta con un hisopo de clorhexidina. Después de 2 minutos, retire la clorhexidina con una toallita con alcohol y aplique una solución de iodona. Cuando la iodona se ha secado inyectar analgesia subcutánea en la parte superior del cráneo y el cuello.Comenzando en la parte del cuello que cubre la corteza occipital, haz un corte de línea media en la piel superada continuando rostralmente hacia la línea intraorbital. Extiende la incisión lateralmente hasta el borde donde el músculo temporal se inserta en el cráneo y extrae toda la piel de la incisión fusiforme para exponer los huesos frontal y parietal. Irrigar el cráneo con solución salina estéril, y utilizar hisopos de algodón para limpiar la superficie hasta que esté libre de escombros y pelo.Después de insertar la cánula magna cisterna aplicar una mezcla de cemento dental y pegamento de cianoacrilato en el lado ventral de la placa de la cabeza alrededor del borde. Coloque la placa de la cabeza sobre el cráneo de modo que el borde anterior de la placa se alinee con la punta posterior del hueso nasal y el borde posterior se alinee con el aspecto anterior del hueso interparietal asegurándose de que la sutura sagital esté centrada y recta en relación con la ventana. Es importante asegurarse de que la placa de la cabeza está asegurada y que no obstruye el campo de visión de la cánula magna de las cisternas.Utilice un par de gotas de acelerador de pegamento para fijar la posición de la placa de la cabeza y llenar los huecos restantes con la mezcla de cemento. Pegue la cánula diferencial magna a la placa de la cabeza y utilice la placa de la cabeza para colocar el ratón en el soporte de la cabeza en una posición fija. Coloque cuidadosamente el ratón y la bomba de infusión unidas a la cánula en un carro para su transporte al macrósco y coloque el soporte de cabeza en el escenario del macroscopio.Asegúrese de que la línea de la bomba de la jeringa a la cánula magna cisterna no esté tensa y que no tenga torceduras. Observe la frecuencia respiratoria y la coloración rosa de las membranas mucosas para confirmar una buena oxigenación. Encienda la cámara del macroscopio y el diodo emisor de luz e inicie el modo en vivo.Ajuste el aumento del campo de imagen para que se pueda visualizar claramente la sutura nasofrontal en la parte superior del campo y la sutura lambdoid en la parte inferior. Una vez en su lugar, el soporte de la cabeza a la etapa del macroscopio y enfoca el macroscopio en el cráneo expuesto hasta que el plano focal se encuentre en los lados laterales de los huesos parietales posteriores a las suturas coronales. Para la perfusión del trazador CSF, ajuste la bomba de perfusión a la velocidad y el volumen adecuados y establezca la longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición adecuados para el trazador para cada canal.A continuación, compruebe que la función de activación del macroscopio es correcta antes de iniciar simultáneamente la perfusión del trazador y la toma de imágenes. Durante la toma de imágenes se pueden identificar fácilmente las suturas naso frontal, sagital, coronal y lambdoide. Una vez que el trazador de líquido cefaéreo se ha infundido en la cisterna magna, la fluorescencia trazadora se observa por primera vez en grandes piscinas de lecnteide CSF en la cisterna olftica y la cisterna cuadreminal cerca del receso pineal y, finalmente, rodeando las arterias cerebrales medias.Luego, los trazadores de líquido cefasequiífos entran en su cerebro a lo largo de los espacios perículares de las ramas pelales corticales de la arteria cerebral media. Las imágenes de transporte de líquido cefalofes después de una lesión cerebral traumática revelan un trazador inicialmente en la cisterna oxifrontal, pero la afluencia glimática a lo largo de los espacios perivasculares corticales se suprime por completo en el lado de la lesión. El análisis cuantitativo en las imágenes in-vivo demuestra que el área de afluencia ipsilateral se reduce casi un tercio en comparación con el hemisferio contralateral.Para evitar artefactos de movimiento y los cambios en el plano focal, recuerde fijar correctamente la placa de la cabeza y el soporte de la placa de la cabeza y comprobar el nivel de anestesia del animal. Después del experimento, los resultados de las imágenes in-vivo se pueden validar aún más cuantificando la penetración del trazador utilizando la técnica real Esta técnica permite el estudio del sistema glimático de una manera fisiológica y mínimamente invasiva y puede ayudar a abordar futuras preguntas sobre la hidrodinámica del SEF en la salud y la enfermedad.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar...

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Imágenes de fluorescencia de la dinámica neuroinmune mediante un implante de cráneo

Fuente: Sweeney, A. M., et al. Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo a través del cráneo de ratón intacto mediante macroscopía de fluorescencia. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el proceso de visualización del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en un cerebro de ratón mediante imágenes de fluorescencia. Se inyecta un marcador fluorescente en la cisterna magna (CM), lo que permite rastrear su movimiento con LCR a través de los espacios subaracnoideos y...

Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo en un cerebro de ratón mediante macroscopía de fluorescencia

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

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