Name: Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Aprende a realizar pantallas CRISPR-Cas9 en células de mamíferos usando bibliotecas de sgRNA y secuenciación masiva. Este protocolo permite identificar genes esenciales y mapear interacciones genéticas de forma sistemática.

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Este trabajo fue apoyado por el Genoma Canadá, el Fondo de Investigación de Ontario y los Institutos Canadienses para la Investigación Sanitaria (MOP-142375, PJT-148802).

<ol><li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li>
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<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
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<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knock-out+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
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<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li>
<li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li>
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<li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAGEL%3A+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).</li>
<li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , Available from:
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<li>Pedregosa, F. V., G,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scikit-learn%3A+Machine+Learning+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li>
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<li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR%2FCas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knock-out+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554(2014).</li>
<li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li>
<li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li>
<li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators%3A+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

Debido a su simplicidad de uso y alta flexibilidad, la tecnología CRISPR ha sido ampliamente adoptada como la herramienta de elección para la edición precisa del genoma. El cribado CRISPR agrupado proporciona un método para interrogar miles de perturbaciones genéticas en un solo experimento. En las pantallas agrupadas, las bibliotecas sgRNA sirven como códigos de barras moleculares, ya que cada secuencia es única y se asigna al gen objetivo. Al aislar el ADN genómico de la población celular, los genes que causan el fenot...

CRISPR-Cas, abreviatura de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas y nucleasas asociadas a CRISPR, consiste en una única proteína de nucleasa (por ejemplo, Cas9) en complejo con un ARN guía sintético (sgRNA). Este complejo de ribonucleoproteínas se dirige a la enzima Cas9 para inducir roturas de ADN de doble cadena en un locus genómico específico1. Los cortes de doble cadena se pueden reparar mediante reparación dirigida por homología (HDR) o, más comúnmente, a través de unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo de reparación propenso a errores que da como resultado la inserción y/o deleciones (INDELS) que con frecuencia interrumpen la función génica 1. La eficiencia y simplicidad de CRISPR permite un nivel de segmentación genómica hasta ahora inalcanzable que supera con creces las tecnologías de edición del genoma anteriores [es decir, nucleasas de dedos de zinc (ZNF) o nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción ( TALENS), ambos sufren de mayor complejidad de diseño, menor eficiencia de transfección y limitaciones en la edición de genes multiplex2].
La aplicación básica de investigación de la edición del genoma basado en ARN de una sola guía de CRISPR ha permitido a los científicos interrogar de manera eficiente y económica las funciones de los genes individuales y la topología de las redes de interacción genética. La capacidad de realizar pantallas funcionales de todo el genoma se ha visto muy mejorada por el uso del sistema CRISPR-Cas, particularmente en comparación con tecnologías de perturbación genética anteriores, como la interferencia del ARN (ARN) y la mutagénesis de las trampas genéticas. En particular, el ARNi sufre de altos efectos fuera del objetivo y derribos incompletos, lo que resulta en una menor sensibilidad y especificidad en comparación con CRISPR3,4,5, mientras que los métodos de captura genética sólo son factibles en haploides células para pantallas de pérdida de funciones, limitando el alcance de los modelos de celda que se pueden interrogar6. La capacidad de CRISPR para generar un knock-out genético completo proporciona un sistema biológicamente más robusto para interrogar fenotipos mutantes, con bajo ruido, efectos mínimos fuera del objetivo y actividad constante a través de los reactivos5. Las bibliotecas de sgRNA CRISPR-Cas9 que se dirigen a todo el genoma humano están ahora ampliamente disponibles, permitiendo la generación simultánea de miles de noqueos genéticos en un solo experimento3,7,8,9 .
Hemos desarrollado bibliotecas lentivirales de sgRNA únicas para todo el genoma CRISPR-Cas9 llamadas las bibliotecas Toronto Knock-out (TKO) (disponibles a través de Addgene) que son compactas y están optimizadas para secuencias para facilitar pantallas genómicas funcionales de alta resolución. La última biblioteca, TKOv3, se dirige a 18.000 genes de codificación de proteínas humanas con 71.090 guías optimizadas para la eficiencia de edición utilizando datos empíricos10. Además, TKOv3 está disponible como una biblioteca de un componente (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) que expresa Cas9 y sgRNAs en un solo vector, aliviando la necesidad de generar células estables de expresión de Cas9, lo que permite el desconexión del genoma en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. TKOv3 también está disponible en un vector sin Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) y se puede utilizar en celdas que expresan Cas911.
Una población celular editada por CRISPR-Cas9 en todo el genoma puede estar expuesta a diferentes condiciones de crecimiento, con la abundancia de sgRNA a lo largo del tiempo cuantificada por la secuenciación de próxima generación, proporcionando una lectura para evaluar la deserción o el enriquecimiento de células con Perturbaciones. Las bibliotecas CRISPR knock-out se pueden aprovechar para identificar genes que, tras la perturbación, causan defectos de aptitud celular, sensibilidad moderada a los medicamentos (por ejemplo, genes sensibles o resistentes), regulan la expresión de proteínas (por ejemplo, reportero), o son necesarios para un determinado función de la vía y estado celular12,13,14. Por ejemplo, las pantallas de aptitud diferencial en una línea celular cancerosa pueden identificar tanto el agotamiento o la reducción de oncogenes como el enriquecimiento o un aumento de los genes supresores tumorales3,14,15. Del mismo modo, el uso de dosis intermedias de fármacos terapéuticos puede revelar tanto la resistencia a los fármacos como los genes de sensibilización16,17.
Aquí se proporciona un protocolo de cribado detallado para la detección de la pérdida de función CRISPR-Cas9 a escala del genoma utilizando las bibliotecas Knock-out de Toronto (TKOv1 o v3) en células de mamíferos desde la generación de bibliotecas, el rendimiento de cribado hasta el análisis de datos. Aunque este protocolo se ha optimizado para su detección con las bibliotecas Knock-out de Toronto, se puede aplicar y convertirse en escalable para todas las bibliotecas agrupadas de SgRNA de CRISPR.

<table><tbody><tr>Filtro <td></td><td></td><td></td>de <td>0,22 micras</td></tr><tr><td>30 grados; Incubadora de</td><td></td><td></td><td></td>placa C</tr><tr><td>37&deg; Incubadora vibratoria</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>37&deg; C, 5% CO2 incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X Tampón TAE</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N Solución de ácido clorhídrico</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alamar azul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina,Aislamiento de choque térmico, fracción V. mín. 98%, grado biotecnológico</td><td>Bioshop</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modificación de Eagles Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>Medios de cultivo Cel</td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>BTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Células electrocompetentes Endura</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células de envasado</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Número de paso recomendado < 15</td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (polibreno)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Polímero catiónico para mejorar la eficiencia de la transducción</td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (polibreno)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de agar LB con carbenicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio LB con carbenicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN de bajo peso molecular</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medios de suero reducidos</td></tr><tr><td>Plásmido maxi kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G (plásmido de envoltura)</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #12259</td><td>sistema lentiviral</td></tr><tr><td>psPAX2 (plásmido de empaquetado)</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #12260</td><td>sistema lentiviral</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Wisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>QIAkit de extracción rápida en gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Ensayo dsDNA BR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorómetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>medio de recuperación S.O.C</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Tinción de gel de ADN segura ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Toronto KnockOut Biblioteca CRIPSR (TKOv3) - Cas9 incluido</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #90203</td><td>Biblioteca CRISPR de todo el genoma, incluye Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Biblioteca CRIPSR Toronto KnockOut (TKOv3) - Addgene no cas9</td><td>Addgene</td><td>ID #125517</td><td>Biblioteca CRISPR de todo el genoma, no Cas9, 71.090 sgRNA</td></tr><tr><td>Solución Tris-EDTA (TE), pH8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard kit de purificación de ADN genómico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Reactivo de transfección de ADN</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>Reactivo de transfección a base de lípidos</td></tr></tbody></table>

pantallas genéticas basadas en crispr en células de mamíferos

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

La edición del genoma utilizando el sistema CRISPR-Cas ha avanzado enormemente la capacidad de editar con precisión los genomas de varios organismos. En el contexto de las células de los mamíferos, esta tecnología representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma para estudios genómicos funcionales. Las bibliotecas de ARN guía (sgRNA) dirigidas a todos los marcos de lectura abiertos permiten la generación fácil de miles de perturbaciones genéticas en un solo grupo de células que se pueden analizar para fenotipos específicos para implicar la función génica y los procesos celulares en un manera imparcial y sistemática. Las pantallas CRISPR-Cas proporcionan a los investigadores un método simple, eficiente y económico para descubrir los planos genéticos de los fenotipos celulares. Además, el análisis diferencial de las pantallas realizadas en varias líneas celulares y de diferentes tipos de cáncer puede identificar genes que son esenciales desde el punto de vista contextual en las células tumorales, revelando objetivos potenciales para terapias específicas contra el cáncer. Realizar pantallas de todo el genoma en células humanas puede ser desalentador, ya que esto implica el manejo de decenas de millones de células y requiere el análisis de grandes conjuntos de datos. Los detalles de estas pantallas, como la caracterización de líneas celulares, las consideraciones de la biblioteca CRISPR y la comprensión de las limitaciones y capacidades de la tecnología CRISPR durante el análisis, a menudo se pasan por alto. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el rendimiento exitoso de las pantallas basadas en CRISPR-Cas9 en todo el genoma agrupado.

Descripción general del flujo de trabajo de cribado CRISPR a escala del genoma
La Figura 1 ilustra una visión general del flujo de trabajo de cribado CRISPR agrupado, comenzando con la infección de las células diana con lentivirus de la biblioteca CRISPR a un MOI bajo para garantizar eventos de integración única y una representación adecuada de la biblioteca (normalmente de 200 a 10...

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Las pantallas desplegables con pantallas CRISPR proporcionan a los investigadores un método simple, eficiente y económico para interrogar la función de la cadena a nivel de todo el genoma. La ventaja de CRISPR es su flexibilidad de editar cualquier gen simplemente cambiando la secuencia de guía. Las bibliotecas de guías CRISPR permiten a los investigadores interrogar todo el genoma de cualquier organismo en un experimento de una manera imparcial y sistemática.Actualmente, las pantallas CRISPR se utilizan para identificar genes esenciales en cientos de cánceres humanos y para mapear interacciones genéticas. Las pantallas también pueden perfilar de forma exhaustiva los medicamentos para revelar los mecanismos de acción de los medicamentos. Las bibliotecas CRISPR descritas aquí se dirigen a las células humanas.Sin embargo, las bibliotecas de guías dirigidas a otras especies, como el ratón, están disponibles y se pueden examinar de forma similar. Realizar pantallas de ancho del genoma en células humanas puede ser desalentador en la práctica, ya que implica el manejo de decenas de millones en células y requiere el análisis de grandes conjuntos de datos. Antes de iniciar una pantalla, asegúrese de que las líneas celulares se caracterizan cuidadosamente.Esto incluye conocer la pureza de su línea celular, duplicar el tiempo, eficiencias de transducción de lentivirus y sensibilidad a los agentes de selección de antibióticos. Una demostración visual proporcionará una imagen de cómo manejar prácticamente los millones de células requeridas en una pantalla y realizar un seguimiento de miles de perturbaciones de manera sistemática. Demostrando el procedimiento estarán Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh y Ryan Climie, todos técnicos de mi laboratorio.Comience transformando el plásmido CRISPR sgRNA ya hecho en células electrocompetentes y creándolos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando esté listo para cosechar las colonias, agregue siete mililitros de LB con carbenicillina a cada plato y raspe las colonias con el esparcidor celular. Utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir las células raspadas a un matraz cónico estéril de un litro, y enjuague la placa con cinco mililitros de LB con carenicillina.Una vez más, transfiera la solución de enjuague al matraz. Centrifugar las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y luego, determinar el peso del pellet húmedo. Purificar el ADN plásmido utilizando un kit de purificación de plásmido a escala Maxi o Mega.Preparar las células para la transfección sembrando 293 células T e incubando durante la noche. Al día siguiente, preparar la mezcla de tres plásmidos de transfección para placas de 15 centímetros. Calcular la cantidad de plásmido necesaria para una transfección y hacer una mezcla de plásmidos para el número de placas, más una, para ser transfectados.A continuación, prepare un reactivo de transfección a base de lípidos para cada transfección y medios séricos reducidos alícuotas en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para el número de placas a transfectar. Agregue el reactivo de transfección, mezcle suavemente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue ADN al reactivo de transfección en una proporción de tres a uno de reactivo de transfección a microgramos del complejo de ADN.Mezclar la solución suavemente y dejar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue la mezcla de transfección a las células de envasado e incubarlas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. El día de la cosecha viral, compruebe las células en busca de morfología anormal y fusionada como una indicación de una buena producción de virus, y cosecha el lentivirus recogiendo el sobrenadante y transfiriéndolo a un tubo de centrífuga estéril.Comience seleccionando la cobertura de la biblioteca de ARN de guía CRISPR que se mantendrá en toda la pantalla. Según la cobertura de la biblioteca, determine el número de células necesarias para mantenerlo por ARN guía y el número de células necesarias para la infección en MOI 0.3. A continuación, determinar el número de placas necesarias para configurar la infección y luego, cosechar y sembrar las células a cada plato.Agregue bromuro de hexadimetrina a todas las placas y agregue el volumen de virus necesario para el cribado y controle dos placas. No agregue virus para controlar uno. Sustituya ese volumen por un medio.Mezcle bien las placas inclinando y coloque las placas en una incubadora, asegurándose de que estén niveladas. Cosecha las células infectadas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y recoge tres réplicas de pellets celulares de las células agrupadas para la extracción del ADN genómico. Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos y lavarlas con PBS.Etiquete los tubos y congele los pellets celulares a menos 80 grados centígrados. Divida el grupo de celdas infectadas en tres grupos de réplica, asegurándose de mantener la cobertura de la biblioteca dentro de cada réplica. Siembra las células en una densidad que normalmente se utilizaría al expandirlas.Utilice el mismo número de celdas para cada réplica y el mismo número total de celdas entre réplicas. Continúe pasando las células y cosecha tres réplicas de pellets celulares de cada réplica de células infectadas agrupadas por hasta 15 a 20 duplicaciones celulares. En cada pasaje, cosecha las células de todas las placas de cada réplica.Etiquete cada pellet con la designación de tiempo y réplica. Configurar PCR1 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito con un total de 100 microgramos de ADN genómico a 3,5 microgramos de ADN genómico por reacción de 50 microlitros y configurar reacciones idénticas de 50 microlitros para lograr la cobertura deseada. Configure una reacción del tubo PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Utilice cinco microlitros del producto PCR1 agrupado como plantilla y utilice combinaciones de imprimación de índice únicas para cada muestra individual para permitir la agrupación de muestras de biblioteca de secuenciación. Después de completar la PCR, ejecute el producto de tubo PCR en un gel de 2% de agarosa a baja tensión durante una de una a 1 hora y media. Visualice el producto en un transilluminador de luz azul e exciba la banda de par base 200.Purificar el ADN y medir su cantidad y calidad con un espectrofotómetro y un fluorómetro. Una biblioteca de ARN guía ideal debe tener cada ARN guía representado en cantidades similares. La secuenciación de próxima generación se puede utilizar para confirmar que la biblioteca tiene una distribución estrecha de los ARN de guía.El análisis de recuperación de precisión se puede utilizar para evaluar el rendimiento de la pantalla. Una pantalla de alto rendimiento debe recuperar un gran número de genes esenciales a un factor base mayor que seis y una tasa de descubrimiento falso de menos del 5% La curva de recuperación de precisión debe tener un codo afilado y una línea recta al punto terminal. El factor Bayes representa una medida de confianza que el nocaut del gen resulta en un defecto de aptitud.Las puntuaciones altas indican una mayor confianza, mientras que las puntuaciones bajas sugieren que el nocaut del gen proporciona ventajas de crecimiento. Las piscinas eliminatorias en todo el genoma se pueden cultivar en presencia de un exceso de agente farmacológico para buscar genes de resistencia supresora. Para realizar una pantalla de selección positiva para el supresor del bloque de timidina, los recuentos de lectura normalizados para todos los ARN guías en T0 se trazan contra recuentos de lectura normalizados medios para muestras tratadas con timidina.Un detalle clave para realizar con éxito las pantallas CRISPR es mantener una buena distribución de cada ARN guía, desde la transfección del plásmido hasta la transducción de células. Esto minimizará la posibilidad de efectos aleatorios que pueden sesgar la representación del ARN guía y conducir a resultados falsos positivos o negativos. Después de una validación de pantalla, se deben realizar experimentos para confirmar los hits porque la pantalla principal solo identifica los posibles hits.Dependiendo de la biología de los hits, se pueden utilizar varios métodos. La edición CRISPR, combinada con la secuenciación de próxima generación, ha permitido la pérdida de pantallas de funciones a escala del genoma en diversos sistemas de modelos humanos. Debido a la simplicidad de CRISPR, este tipo de pantallas son ahora ampliamente accesibles para todos los investigadores, lo que permite a más científicos utilizar métodos genéticos funcionales para estudiar los procesos biológicos y la enfermedad.

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Investigación

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Genética

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