Name: Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Aprende a evaluar la biodisponibilidad de zinc en alimentos para Salmo salar mediante métodos analíticos, in vitro e in vivo. Esta combinación mejora la formulación de dietas en acuicultura.

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Este trabajo se realizó en el marco del proyecto APREMIA (Aparente disponibilidad y requerimiento de minerales en el salmón del Atlántico, subvención nº 244490) financiado por el Consejo Noruego de Investigación.

El ensayo de alimentación en la sección 4 se realizó de acuerdo con la legislación noruega (FOR-2015-06 - 18-761) y europea (Directiva 2010/63/UE).
1. Evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método SEC-ICP-MS
<ol><li>Tampón de extracción (100 mM Tris-HCl, pH 8.5)
	<ol>
<li>Prepare el tampón de extracción disolviendo una cantidad adecuada de tris(hidroximetil)aminometano para alcanzar la fuerza iónica deseada (100 mM) en ultrapuro H2O.</li>
		<li>Ajuste el pH de la solución a pH 8.5 con la solución de HCl, monitoreando el cambio de pH con un medidor de pH.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de muestras de piensos NOTA: La muestra de alimento utilizada se formuló a base de alimento comercial para salmón del Atlántico, que contiene fuentes de proteínas principalmente de ingredientes de origen vegetal (es decir, aproximadamente 5% de proteína de pescado, 10% de aceite de pescado, 68% de proteína de origen vegetal y 12% de aceite de origen vegetal). El sulfato de zinc se complementó con el alimento.<ol>
<li>Moler la muestra de alimento a mano con un mortero y un mortero.</li>
		<li>Tamice la muestra de alimentación para asegurarse de que la extracción se realiza en una fracción de alimentación con un tamaño de partícula similar (de 850 μm a 1,12 mm).</li>
		<li>Proceda a realizar la extracción de Zn.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de zinc de una muestra de alimento
	<ol>
<li>Pesar aproximadamente 0,5 g de pienso por triplicado en tubos cónicos de 15 ml.</li>
		<li>Añadir el tampón de extracción (5 mL de 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) a las muestras.</li>
		<li>Extraiga las muestras en un rotador (20 rpm) a 4 °C durante 24 h.</li>
		<li>Separar las fracciones solubles y no solubles por centrifugación durante 10 min a 3000 x g.</li>
		<li>Utilice un filtro de jeringa desechable de 0,45 μm para filtrar la fracción soluble.</li>
		<li>Transfiera las muestras filtradas a los tubos limpios.</li>
		<li>Realice el análisis de especiación de Zn en las fracciones solubles utilizando SEC-ICP-MS, como se describe en el paso 1.6. NOTA: En la Figura 2se describe un resumen del procedimiento para la extracción de Zn de una muestra de alimentación.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de fase móvil (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7.5)
	<ol>
<li>Preparar la solución de fase móvil disolviendo 6.057 g de tris(hidroximetil)aminometano en 1 L de solución de MeOH al 3% (v/v).</li>
		<li>Ajuste el pH de la solución a pH a 7.5 con la solución de HCl, monitoreando el cambio de pH con un medidor de pH.</li>
		<li>Filtre la solución de fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,45 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibración de peso molecular del rango de separación de columnas SEC
	<ol>
<li>Calibre el rango de separación realizando una calibración de peso molecular. NOTA: En este estudio se utilizaron tiroglobulina (660 kDa), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina B12 (1,36 kDa).</li>
		<li>Preparar cada una de las normas con una concentración conocida en ultrapura H2O.</li>
		<li>Prepare un vial de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) agregando 250 μL de estándar a un vial.</li>
		<li>Cargue los viales con estándares a la secuencia de las muestras.</li>
		<li>Ejecute la calibración de peso molecular al principio y al final de la secuencia analítica, monitoreando 127I (tiroglobulina), 66Zn (superóxido dismutasa Zn/Cu), 57Fe (mioglobina) y 59Co (vitamina B12). NOTA: La calibración del peso molecular se realiza simultáneamente con el análisis de especiación de Zn.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de especiación de zinc utilizando SEC-ICP-MS NOTA: El análisis de especiación de Zn por el método SEC-ICP-MS se desarrolló en base a los principios descritos en otra parte10,11 y se realizó una mayor optimización para el análisis de un alimento para salmón del Atlántico7.<ol>
<li>Realice el análisis de especiación de Zn en las fracciones solubles mediante el uso de una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y un HPLC junto con espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).</li>
		<li>Prepare un vial de HPLC añadiendo 250 μL de fracción soluble a un vial.</li>
		<li>Antes del análisis, aumente todas las muestras con 0,5 μL de vitamina B12. Este paso permite corregir los turnos de tiempos de retención, monitoreando 59Co.</li>
		<li>Diluir la fracción soluble con tampón de extracción (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) y ajustar a un volumen final de 1 mL.</li>
		<li>Prepare la secuencia de ejecución de las muestras en orden aleatorio.</li>
		<li>Ajuste el ICP-MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Siga la configuración del instrumento para el HPLC y el ICP-MS realizando el análisis de especiación de Zn (consulte la Tabla 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Solubilidad in vitro del Zn suplementado en la alimentación del salmón del Atlántico
NOTA: La muestra de alimento utilizada se formuló a base de alimentos comerciales para salmón del Atlántico, que contiene fuentes de proteínas principalmente de ingredientes de origen vegetal (es decir, aproximadamente 5% de harina de pescado, 10% de aceite de pescado, 68% de ingredientes de origen vegetal y 12% de aceite vegetal).
<ol><li>Moler las muestras de alimento de salmón del Atlántico durante 10 s a 3000 rpm utilizando un molino de cuchillas y almacenar a 4 ° C hasta un análisis adicional.</li>
	<li>Pesar ~ 0.2 g de las muestras de alimentación molidas en el paso 2.1 y agregar el radiotrazador Zn(65Zn) de actividad específica conocida en un tubo de muestra de volumen de 5 ml (con una tapa). PRECAUCIÓN: Este procedimiento debe realizarse dentro de una suite de radionúclidos. La persona que realiza este paso debe estar capacitada y certificada para manejar isótopos de radio. Las medidas de seguridad y precaución aconsejadas por la administración de seguridad radiológica del instituto deben seguirse estrictamente.</li>
	<li>Luego prepare la solución tampón luminal intestinal de agua dulce como se describe a continuación.<ol>
<li>Para la solución salina A, pesar 11,65 g de NaNO3, 0,55 g de KNO3 y 0,4 g de MgSO4. Disolver las sales en ultrapura H2O y ajustar a un volumen final de 60 mL.</li>
		<li>Para la solución salina B, pesar 0,31 g de Ca(NO3)2· 4 H2O. Disolver las sales en ultrapuro H2O y ajustar a un volumen final de 10 mL.</li>
		<li>Utilice la solución de caldo HEPES de 500 mM como solución salina C.</li>
		<li>Para la solución salina D, pesar 1,2 g de MgCl2,disolver la sal en ultrapuro H2O y ajustar a un volumen final de 20 mL.</li>
		<li>Para la solución salina E, pesar 0,9 g de MgSO4,disolver la sal en ultrapuro H2O y ajustar a un volumen final de 20 ml.</li>
		<li>Preparar solución de piruvato disolviendo 0,55 g de CH3COCOONa en 10 mL de ultrapuro H2O.</li>
		<li>Disolver 0,9 g de galactosa (C6H12O6) en ultrapuro H2O.</li>
		<li>Disolver bien utilizando un agitador magnético y esterilizar las soluciones salinas A, B, D y E mediante autoclave, y la solución C, piruvato y galactosa por filtración a través de un filtro de jeringa de 200 μm.</li>
		<li>Después de la preparación de las diferentes soluciones de stock, para preparar 100 mL de solución de trabajo del tampón, mezcle las soluciones preparadas anteriormente en la siguiente proporción: 6.8 mL de solución salina A, 4.14 mL de B, 5 mL de C, 2.5 mL de D, 1.5 mL de E y 1.14 mL cada una de piruvato y galactosa. Ensa consanita el volumen hasta 100 ml con agua desionizada. NOTA: El tampón anterior ahora representará la composición iónica de la luz intestinal que se encuentra en los salmónidos de agua dulce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar otras seis alícuotas del tampón descrito en el paso 2.6 y añadir uno de los siguientes aminoácidos (cisteína, metionina, glicina, histidina, lisina y arginina) para alcanzar una concentración molar final de 5 mM.</li>
	<li>Añadir el tampón luminal intestinal de agua dulce (volumen de reacción = 3 ml; pH 7,4) a la muestra de alimentación.</li>
	<li>Repita el paso 2.5 con los tampones descritos en 2.4 (en presencia de diferentes aminoácidos a una concentración de 5 mM).</li>
	<li>Cierre los tubos y déjelos girar en un girador giratorio durante 30 minutos a 25 rpm.</li>
	<li>Separar las fracciones solubles y no solubles mediante centrifugación durante 10 min a 1157 x g.</li>
	<li>Utilice un cajero gamma para medir los recuentos por minuto (cpm) de 65Zn en las fracciones solubles y no solubles.</li>
	<li>Calcular la proporción de los isótopos de radio de Zn(65Zn) presentes en las fracciones solubles y no solubles.</li>
</ol>3. Evaluación de la absorción de especies químicas de Zn utilizando un modelo intestinal in vitro (RTgutGC)
<ol><li>Cultivo de células RTgutGC NOTA: Todos los materiales de trabajo utilizados en este paso deben ser estériles.<ol>
<li>Revive las células RTgutGC congeladas suavemente en un baño de agua a 20 °C.</li>
		<li>Pipetee suavemente la solución que contiene las células y suspenda en 10 ml de medio L15 que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS). NOTA: El 10% de FBS solo se usa para revivir las células congeladas. Para el paso posterior, FBS se utiliza al 5%. La composición de FBS puede variar entre lotes, por lo que es recomendable comprar y almacenar tanto como sea necesario de un solo lote para evitar variaciones entre lotes en la composición del suero.</li>
		<li>Añadir la suspensión celular a matraces de cultivo celular de 75 cm2 e incubar en una incubadora a 19 °C en atmósfera normal.</li>
		<li>Verifique las células y cuando estén confluentes (80% de confluencia, evalúe visualmente examinando la densidad de la superficie celular bajo un microscopio), divida las células en nuevos matraces (paso posterior) o recolecte para usar en experimentos. NOTA: Un ejemplo de las células RTgutGC 1 h y 1 semana después de la siembra a los matraces de cultivo celular se muestra en la Figura 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección celular y preparación para experimentos de exposición
	<ol>
<li>Lave las células dos veces con 1 ml de solución de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA). Después de cada lavado, desvía la solución de EDTA con un tubo de succión estéril.</li>
		<li>Tratar las células con tripsina (0,7 ml de tripsina, en un 0,25% en solución salina tamponada con fosfato [PBS]).</li>
		<li>Gire suavemente el matraz en ángulos agudos para extender la tripsina a lo largo de la superficie del matraz.</li>
		<li>Continúe la rotación durante 2 minutos, mientras las celdas se separan.</li>
		<li>Después de girar suavemente durante 2 min, agregue 10 ml de medio L15 / FBS para neutralizar la tripsina.</li>
		<li>Decantar la suspensión celular resultante en un tubo cónico de centrífuga inferior utilizando una pipeta estéril y centrífuga durante 3 min a 130 x g.</li>
		<li>Determine la densidad de las células cosechadas mediante el conteo manual utilizando hemocitómetro.</li>
		<li>Agregue el volumen requerido del medio L15 / FBS para alcanzar una densidad celular de 5 x 104 celdas / ml.</li>
		<li>Sembrar las células en placas de 24 pozos pipeteando 1 ml de suspensión celular por pozo para alcanzar la densidad celular final de 5 x 104 células/pozo. NOTA: Preferiblemente use pipetas de dispensación múltiple para minimizar la variación y reducir el tiempo.</li>
		<li>Coloque las placas secuedradas en una incubadora bajo atmósfera normal a 19 °C durante 48 h antes de los experimentos. NOTA: Tripsina para almacenar a -20 °C; Solución EDTA y medios L15/FBS a 4 °C. Ajuste la temperatura de todas las soluciones y medios de trabajo a 19 °C justo antes de su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medios de exposición NOTA: Este paso debe realizarse bajo la campana de humos en condiciones asépticas y estériles.<ol>
<li>Preparar L15/ex mezclando 6,8 ml de solución salina A (paso 2.3.1), 1,14 ml de B (paso 2.3.2), 5 ml de C (paso 2.3.3) y 1,14 ml de piruvato (paso 2.3.6) y galactosa (paso 2.3.7). Ensa consaní el volumen hasta 100 ml utilizando agua destilada estéril de grado de cultivo celular.</li>
		<li>Preparar FW mezclando 6,8 ml de solución salina A (2.3.1), 4,14 ml de B (2.3.2), 5 ml de C (2.3.3), 2,5 ml de D (2.3.4), 1,5 ml de E (2.3.5) y 1,14 ml de piruvato (2.3.6) y galactosa (2.3.7). Ensanche el volumen hasta 100 ml utilizando agua destilada estéril de grado de cultivo celular.</li>
		<li>Cuantificar las concentraciones de iones en los medios de exposición utilizando ICP-MS como se describe en otra parte12. NOTA: Las concentraciones iónicas analizadas en las preparaciones de medios se presentan en la Tabla 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayos de afluencia de zinc(65Zn)
	<ol>
<li>Sembrar las células RTgutGC en placas de 24 pozos (5 x 104 células/pozo) en medio completo L15/FBS.</li>
		<li>Incubar durante 48 h en una incubadora con atmósfera normal a 19 °C.</li>
		<li>Ajustar todas las preparaciones de medios experimentales a pH 7.4 usando 0.5 M NaOH en presencia o ausencia de L-metionina (L-Met) o DL-metionina (DL-Met) a una concentración de 2 mM. NOTA: El ajuste del pH de los tampones descritos en 3.4.3 debe realizarse recién antes del tratamiento de las células en el paso 3.4.5.</li>
		<li>Después de completar el período de incubación, retire el medio de los pomos y enjuague bien con PBS.</li>
		<li>Agregue el medio experimental FW ajustado al pH y deje que se aclimate durante 20 minutos.</li>
		<li>Exponer las células RTgutGC a concentraciones nominales de 3,07, 6,14, 12,27 y 24,55 μM 65Zn(II) (como ZnCl2; ~4 kBq/mL) en los medios descritos en el paso 3.4.3.</li>
		<li>Inmediatamente después, mantenga las células en la incubadora a 19 °C durante 15 min.</li>
		<li>Después de que termine la incubación de 15 minutos, aspire el sobrenadante de cultivo y retire del pozo.</li>
		<li>Enjuague las células con medio FW helado (con 200 μM Zn, pH 7.4) y luego esconda mediante la adición del tampón de etilenglicol-bis(éter β-aminoetilo)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) de 5 mM (pH 7.4) durante 5 min, para deshacerse de cualquier 65Zn(II) adsorbido.</li>
		<li>Exponer las células a las preparaciones de medios anteriores en presencia o ausencia de 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] ácido heptano-2-carboxílico (BCH), un inhibidor del transporte de aminoácidos.</li>
		<li>Después del período de exposición de 15 min, repita los pasos 3.4.8 y 3.4.9.</li>
		<li>Las células RtgutGC se adherirán al fondo de los pozos como una monocapa. Digiera las células usando detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) caliente al 0,2% (100 μL/pozo). NOTA: La solución SDS debe colocarse durante 1 h en un baño de agua a 90 °C antes de su uso.</li>
		<li>Aspirar y recuperar el digestato celular en un tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Mida la radiactividad de los digestos celulares utilizando un contador gamma. NOTA: Los recuentos por minuto (cpm) deben corregirse para la desintegración radiactiva, la actividad de fondo y se someten a cálculos de actividad específicos siguiendo las fórmulas descritas por Glover y Hogstrand13.</li>
		<li>Para cuantificar la concentración de proteínas de las células, homogeneizar las células con 500 μL de 0,5 M NaOH.</li>
		<li>Utilice un kit de ensayo de Bradford para medir la concentración de proteínas en la muestra celular, con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. NOTA: Una vez cuantificada la concentración de proteínas, la tasa de absorción de Zn por las células RTgutGC se puede expresar como proteína pmoles Zn min-1 mg-1.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Disponibilidad aparente de Zn dietético en salmón del Atlántico (Salmo salar)
NOTA: Los alimentos para salmón del Atlántico se formularon a base de alimentos comerciales, que contienen fuentes de proteínas principalmente de ingredientes de origen vegetal (es decir, aproximadamente 5% de proteína de pescado, 10% de aceite de pescado, 68% de proteína de origen vegetal y 12% de aceite de planta). Dos alimentos se complementaron con una fuente inorgánica (sulfato de Zn) o una fuente orgánica (quelato de Zn de glicina) para lograr una concentración de Zn de 150 mg / kg de alimento. Además, se agregó óxido de itrio (grado de alimentación) al alimento al 0,01% como marcador inerte para permitir el cálculo del coeficiente de disponibilidad aparente.
<ol><li>Aclimatar el salmón del Atlántico (cepa SalmoBreed, edad 1+ años, grupos mixtos) en sus respectivos tanques hasta que los peces se acostumbren a las condiciones experimentales.</li>
	<li>Evaluar la aclimatación del salmón del Atlántico mediante el control de su ingesta diaria de alimento. NOTA: Esta prueba se realizó en tanques triplicados, por lo que se utilizaron un total de seis tanques. Durante el ensayo de alimentación, la temperatura del agua fue de 11,9 ± 0,3 °C y la saturación de oxígeno disuelto fue de 101 ± 5%.</li>
	<li>Alimente a los peces con alimentos experimentales durante 11 días.</li>
	<li>Sacrificar a los peces por sobredosis usando 6 ml de solución de caldo de metanosulfonato de tricaína por litro de agua.</li>
	<li>Recolecte una muestra agrupada de heces de los peces del mismo tanque en un plato mediante rayas desde la aleta ventral hasta el ano.</li>
	<li>Retire las heces de la placa con una espátula en un tubo cónico de 50 ml y almacene inmediatamente las muestras a -20 ° C. NOTA: Las muestras se mantuvieron a -20 °C hasta un análisis adicional.</li>
	<li>Seque congele las muestras de heces durante 72 h a -80 °C.</li>
	<li>Homogeneice manualmente la muestra de heces en un polvo fino utilizando un mortero y mortero.</li>
	<li>Determinar la concentración de Zn e itrio en las muestras de alimento y heces utilizando un ICP-MS (como se describe en otra parte9).</li>
	<li>Determinar el coeficiente de disponibilidad aparente (CAA, %) utilizando la siguiente fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59862/59862eq1.jpg">
</li>
</ol>

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<li>Krezel, A., Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+inorganic+chemistry+of+zinc+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The biological inorganic chemistry of zinc ions.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Fish+and+Shrimp%22">Nutrient Requirements of Fish and Shrimp</a>. , The National Academies Press. (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La absorción intestinal de Zn parece estar influenciada por la forma química de la especie Zn13. En este sentido, el uso de los protocolos descritos en este artículo permitió el estudio secuencial de los aspectos químicos y biológicos subyacentes a la "disponibilidad" de Zn en el salmón del Atlántico.
Este estudio informó el uso de un método de análisis de especiación de Zn. El método SEC-ICP-MS proporcionó datos cualitativos sobre el peso molecular de las especies químicas de Zn presentes en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico. Esto se logró comparando los tiempos de retención de los estándares de calibración de peso molecular (es decir, tiroglobulina (660 kDa), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina B12 (1,36 kDa)) con los tiempos de retención de picos que contienen Zn. Un desafío encontrado en el análisis de especiación de Zn fue la identificación de las especies químicas desconocidas de Zn debido a la falta de estándares analíticos. En SEC, la separación de las moléculas se basa en sus tamaños en relación con los poros en la fase estacionaria. En principio, las moléculas más grandes viajarán más rápido, eluyendo primero, y las moléculas más pequeñas viajarán más lentamente, eluiendo más tarde14. En consecuencia, cada pico de Zn que contiene podría contener varios compuestos con un peso molecular similar15. Esto también contribuye al desafío de identificar especies químicas desconocidas de Zn. Además, se probaron varias condiciones de extracción suaves para la extracción de Zn. El Zn extraído fue bajo (~10%). Se aplicaron condiciones de extracción suaves para mantener intactas las especies químicas de Zn, pero esto puede haber comprometido la eficiencia de extracción7.
En el ensayo de solubilidad in vitro, la solubilidad del Zn suplementado (como radioisótopo 65ZnCl2)indicó que los aminoácidos, especialmente la histidina y la lisina, aumentaron la solubilidad del Zn (Figura 5). El uso de muestras de alimentación directamente para ensayos de solubilidad in vitro en condiciones gastrointestinales simuladas se basa en el conocimiento de que el cambio en la especiación de Zn depende del pH16. Sin embargo, las condiciones ácidas al comienzo del tracto gastrointestinal pueden dar lugar a algún cambio en la especiación que podría ser irreversible (por ejemplo, ZnO -> ZnCl2,en presencia de HCl en condiciones ácidas en el estómago). Sin embargo, la fuente de Zn utilizada aquí es ZnSO4 y su solubilidad fue mejorada por aminoácidos en el medio. La siguiente pregunta a responder fue, ¿se puede traducir el aumento de la solubilidad en disponibilidad? Se utilizó la línea celular intestinal RTgutGC para estudiar esta cuestión. En el contexto de la nutrición mineral en animales, el término "disponibilidad" es difícil de definir y puede regularse diferencialmente en las células (in vitro) en comparación con un animal (in vivo). Por lo tanto, el término "absorción" se utilizó cuando se trataba de la evaluación in vitro utilizando una línea celular intestinal. La línea celular proporcionó información útil sobre los mecanismos de absorción de Zn en el epitelio intestinal, que es parte del complejo proceso regulador que rige la disponibilidad de minerales en los animales. Las células RTgutGC provocaron una mejor capacidad para la absorción apical de Zn en presencia de un aminoácido (es decir, metionina; Figura 6). Sin embargo, la disponibilidad aparente in vivo no difirió significativamente entre las fuentes de Zn inorgánicas y orgánicas en el salmón del Atlántico. En el estudio de disponibilidad in vivo, la comparación de la fuente de Zn se realizó a niveles dietéticos de Zn que exceden con creces los requisitos conocidos de Zn del salmón del Atlántico17,concentración total de Zn de 150 mg / kg de alimento. Las diferencias en la disponibilidad se visualizan mejor cuando los niveles dietéticos probados caen en el rango dinámico lineal antes de que el animal alcance la saturación. En el presente estudio in vivo, es posible que el salmón del Atlántico estuviera bien saturado para observar la diferencia en la absorción de Zn entre las fuentes utilizadas.
En resumen, el primer método proporcionó información cualitativa sobre diferentes especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico; el segundo método, la solubilidad in vitro del Zn suplementado se mejoró en presencia de ligandos de aminoácidos; el tercer método confirmó que la mejora de la solubilidad por aminoácidos puede mejorar la absorción en el epitelio intestinal; por el contrario, el cuarto método no logró encontrar diferencias en la disponibilidad de Zn de fuente inorgánica u orgánica al salmón del Atlántico. Para concluir, aunque no están alineados con los hallazgos in vivo, los protocolos in vitro proporcionaron información interesante para comprender los diferentes componentes de la disponibilidad de Zn.

La harina y el aceite de pescado se usaban tradicionalmente en la alimentación del salmón del Atlántico. Sin embargo, estos ingredientes están siendo reemplazados cada vez más por ingredientes de origen vegetal1. El cambio antes mencionado en la composición del alimento ha resultado en una baja disponibilidad dietética y una mayor necesidad de mejorar la disponibilidad de minerales en los alimentos para salmón del Atlántico, especialmente zinc (Zn)2. La disponibilidad reducida podría ser el resultado de un cambio en el nivel de Zn, las especies químicas de Zn y/o los factores antinutricionales presentes en la matriz de alimentación. En este escenario, ha surgido una nueva gama de aditivos considerados genéricamente como "fuentes orgánicas" con el potencial de ser una mejor fuente disponible de minerales dietéticos para los peces. Por lo tanto, es importante comprender la química y la fisiología fundamentales que rigen la disponibilidad de minerales y sus fuentes para los peces. El zinc es un oligoelemento esencial para todos los organismos vivos3. El papel del Zn como molécula de señalización se ha descrito tanto a nivel paracelular como intracelular en peces4. En el salmón del Atlántico, la deficiencia de Zn se ha asociado con anomalías esqueléticas y actividad reducida de varias metaloenzimas de Zn5,6.
Este estudio describe un enfoque sistemático para comprender la disponibilidad de Zn clasificándolo en cuatro compartimentos diferentes de complejidad química y biológica variada. Los métodos involucrados se describen en cuatro secciones, como se puede ver en la Figura 1:(1) evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método de cromatografía de exclusión de tamaño-espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (SEC-ICP-MS)7; (2) solubilidad in vitro del Zn suplementado en los piensos para salmón del Atlántico; (3) evaluación de la absorción de especies químicas de Zn por modelo intestinal in vitro (RTgutGC)8; y (4) disponibilidad aparente de Zn en salmón del Atlántico (Salmo salar)9. Se pueden desarrollar protocolos similares para otros minerales (por ejemplo, manganeso, selenio, cobre) de interés nutricional para las especies de peces de acuicultura.

<table><tbody><tr><td>0,45 y micro; m filtro de jeringa</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filtro de membrana</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % suero fetal bovino</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1282 Compugamma Laboratorio Gamma Counter</td><td>LKB Wallac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 placas de pocillos (Falcon, microplacas TPP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10048760</tr><tr><td>ácido 2-aminobiciclo(2.2.1)heptano-2-carboxílico</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A7902</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular de 75 cm2 (Falcon, matraces de cultivo de tejidos TPP)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG&nbsp;</td><td>90075</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf 5702</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>30089</td><td></td></tr><tr><td>DL-metionina</td><td>Alfa Aesar</td><td>59-51-8</td><td></td></tr><tr><td>D-metionina</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M9375</td><td></td></tr><tr><td>Alimento experimental para peces</td><td>Skretting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>410225</tr><tr><td>Columna de protección, tipo TSKgel SWxl (7 &mu; m tamaño de partícula)</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>53319</td><td></td></tr><tr><td>HPLC acoplado a un 7500ce ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Emsure ACS, ISO, 37% p/p, Merck</td><td>1.00317</td><td></td></tr><tr><td>Molino de cuchillas</td><td>GM 300, Retsch Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medio</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>21083027</tr><tr><td>L-metionina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>23128</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>LiChrosolv, grado HPLC, Merck&nbsp;</td><td>1.06035</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q de agua (18.2&nbsp; M&Omega; &nbsp; cm)&nbsp;</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myoglobin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>NexION 350D ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeta</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH&nbsp;</td><td>inoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>806552</tr><tr><td>Células RTgutGC&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Obtenido en especie de la Profesora Dra. Kristin Schirmer, Departamento de Toxicología Ambiental, Eawag, Instituto Federal Suizo de Ciencia y Tecnología Acuática, Suiza</td></tr><tr><td>Columna SEC, TSKgel G3000SWxl</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamiz de acero inoxidable (850?&mu; m - 1.12?mm)</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo sódico (SDS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>436143</tr><tr><td>Superóxido dismutasa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>S7571</td><td></td></tr><tr><td>Tiroglobulina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T1001</td><td></td></tr><tr><td>Metanassulfonato de tricaína</td><td>PharmaQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>252859</tr><tr><td>Tripsina al 0,25% en solución salina de tampón fosfato</td><td>Biowest</td><td>L0910</td><td></td></tr><tr><td>Versene EDTA solución</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Quelato de zinc de glicina</td><td>Fitobióticos</td> Sulfato de <td></td><td></td></tr><tr><td>zinc</td><td>Vilomix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del atlántico

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Evaluar la disponibilidad de microminerales dietéticos es un desafío importante en la nutrición mineral de las especies de peces. El presente artículo tiene como objetivo describir un enfoque sistemático que combina diferentes metodologías para evaluar la disponibilidad de zinc (Zn) en el salmón del Atlántico(Salmo salar). Teniendo en cuenta que varias especies químicas de Zn pueden estar presentes en un alimento para salmón del Atlántico, se hipotetizó que la disponibilidad de Zn está influenciada por las especies químicas de Zn presentes en el alimento. Por lo tanto, en este estudio, el primer protocolo trata sobre cómo extraer las diferentes especies químicas de Zn del alimento y analizarlas mediante un método de cromatografía de exclusión de tamaño-espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (SEC-ICP-MS). Posteriormente, se desarrolló un método in vitro para evaluar la solubilidad del Zn dietético en los alimentos para salmones del Atlántico. El tercer protocolo describe el método para estudiar el impacto del cambio en la composición de especies químicas de Zn en la absorción de Zn en un modelo epitelial intestinal de peces utilizando una línea celular intestinal de trucha arco iris (RTgutGC). Juntos, los hallazgos de los métodos in vitro se compararon con un estudio in vivo que examinó la aparente disponibilidad de fuentes inorgánicas y orgánicas de Zn suplementadas con alimentos para salmón del Atlántico. Los resultados mostraron que se pueden encontrar varias especies químicas de Zn en los alimentos y la eficiencia de una fuente orgánica de Zn depende en gran medida del ligando de aminoácidos utilizado para quelar Zn. Los hallazgos de los métodos in vitro tuvieron menos correlación con el resultado del estudio in vivo. Sin embargo, los protocolos in vitro descritos en este artículo proporcionaron información crucial sobre la disponibilidad de Zn y su evaluación en los alimentos para peces.

Evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método SEC-ICP-MS El método SEC-ICP-MS proporciona datos sobre las especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble de la alimentación del salmón del Atlántico. La Figura 4 ilustra el perfil cromatográfico de Zn encontrado en la fracción soluble. Este cromatograma se obtuvo utilizando el método SEC-ICP-MS. Se encontraron cinco picos que contenían Zn en las fracciones solubles de la alimentación del salmón del Atlántico. Cada pico tiene un peso molecular diferente; pico uno (~ 600 kDa), pico dos y pico tres (de 32 a 17 kDa), pico cuatro (de 17 a 1,36 kDa) y pico cinco (&gt; 1,36 kDa). El pico cuatro fue el más abundante, seguido por el pico dos, tres, cinco y uno, respectivamente. Las especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble pueden tener diferentes fuentes porque el alimento utilizado contiene ingredientes marinos y vegetales, y forma suplementada (es decir, sulfato de Zn). El rango de peso molecular de las especies químicas de Zn sugirió que estos compuestos podrían ser metaloproteínas.
Solubilidad in vitro del Zn suplementado en piensos para salmón del Atlántico La solubilidad de 65Zn suplementados aumentó en presencia de aminoácidos. Todos los aminoácidos probados aumentaron la solubilidad de 65Zn suplementados. Metionina, glicina, cisteína, histidina y lisina mejoraron la solubilidad de 65Zn; se encontró mayor solubilidad con histidina y lisina(Figura 5).
Evaluación de la absorción de especies de Zn utilizando un modelo intestinal in vitro (RTgutGC) La absorción apical de zinc en las células RTgutGC fue influenciada significativamente por la presencia de L-Met o DL-Met a concentraciones de 2 mM. Además, el impacto de la metionina en la absorción de Zn en las células RTgutGC se vio afectado negativamente por la presencia de BCH (un bloqueador del sistema de transporte de aminoácidos), en comparación con las células no tratadas con BCH (Figura 6).
Disponibilidad aparente de Zn dietético en salmón del Atlántico (Salmo salar) En los alimentos prácticos para el salmón del Atlántico, la disponibilidad aparente de Zn era la misma cuando se complementaba con una fuente inorgánica (sulfato de Zn) o una fuente orgánica (quelato de Zn de glicina). Los valores estimados para la disponibilidad aparente de Zn (%, n = 3) en el salmón del Atlántico fueron del 31% ± 12% cuando se suplementa con una fuente inorgánica (sulfato de Zn) y del 31% ± 3% cuando se complementa una fuente orgánica (quelato de Zn de glicina).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig1.jpg"> Figura 1: Resumen del enfoque sistemático para evaluar la disponibilidad de minerales utilizando métodos complementarios. Este enfoque se utilizó para estudiar la disponibilidad de zinc en el salmón del Atlántico, incluida la especiación de Zn, la solubilidad de Zn en el ambiente intestinal, la absorción de Zn por las células intestinales y la disponibilidad aparente de Zn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig2.jpg"> Figura 2: Resumen del procedimiento para la extracción de Zn de una muestra de pienso. El zinc se extrae de una muestra de alimento utilizando condiciones de extracción suaves. La extracción es seguida por el análisis de especiación de Zn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig3.jpg"> Figura 3: Un ejemplo de las células RTgutGC 1 h (izquierda) y 1 semana (derecha) después de la siembra en los matraces de cultivo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig3large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig4.jpg"> Figura 4: Un cromatograma que muestra los picos que contienen Zn de la fracción soluble de la alimentación del salmón del Atlántico y analizado por SEC-ICP-MS. Las tres réplicas se caracterizan por las líneas azul, roja y negra. Se realizó una calibración de peso molecular utilizando tiroglobulina (660 kDa, monitoreo 127I), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa, monitoreo 66Zn), mioglobina (17 kDa, monitoreo 57Fe), vitamina B12 (1.36 kDa, monitoreo 59Co); Pico 1 (P1): ~600 kDa, tiempo de retención (RT) 8.2 min; Pico 2+3 (P2+3): de 32 a 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Pico 4 (P4): de 17 a 1,36 kDa, RT 16,3 min; Pico 5 (P5): &gt; 1.36 kDa, Rt 23.2 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig5.jpg"> Figura 5: El impacto de los aminoácidos en la solubilidad in vitro del Zn suplementado en la alimentación del salmón del Atlántico. Los datos se presentan como media ± deS (n = 3). Los datos se analizaron a través de ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnet, comparando la media de cada grupo de AA con la del grupo de control (No AA). Los asteriscos denotan el nivel de significancia de ANOVA (valores P &lt; 0,05 (*), &lt; 0,01 (**), &lt; 0,001 (***) y &lt; 0,0001 (****)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig6.jpg"> Figura 6: La influencia de la metionina y un inhibidor del transporte de aminoácidos (ácido 2-aminobiciclo [2.2.1] heptano-2-carboxílico, BCH, 10 mM). Los datos se presentan como media ± deS (n = 3). Los datos se analizaron a través de ANOVA bidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey con p &lt; nivel de significancia de 0,05. Las diferencias post-hoc entre los grupos se representan como una letra de superíndice sobre las barras; las barras con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Configuración de HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Columna</td>
			<td>Columna SEC (30 cm x 7,8 mm, tamaño de partícula de 5 μm) + columna de protección (tamaño de partícula de 7 μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rango de calibración</td>
			<td>1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase móvil</td>
			<td>50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gasto</td>
			<td>0,7 ml min−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen de inyección</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Configuración de ICP–MS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Potencia de avance</td>
			<td>1550 W</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flujo de gas de plasma</td>
			<td>15,0 L mín−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flujo de gas portador</td>
			<td>0,86 L mín−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flujo de gas de maquillaje</td>
			<td>0,34 L min−1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de permanencia</td>
			<td>0,1 s por isótopo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isótopos monitoreados</td>
			<td>
127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Una descripción general de la configuración del instrumento para HPLC e ICP-MS.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Composición química (mM)</td>
			<td>L15/ex</td>
			<td>Medio experimental (L15/FW)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato de sodio</td>
			<td>155</td>
			<td>155</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato de potasio</td>
			<td>6.2</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato de magnesio</td>
			<td>3.8</td>
			<td>19.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato de calcio</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de magnesio</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Piruvato de sodio</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Galactosa</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH</td>
			<td>7.1</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fuerza iónica</td>
			<td>178</td>
			<td>258</td>
		</tr>
<tr height="36">
<td>Composición iónica (mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Calcio, Ca2+ *
</td>
			<td>1,6 ± 0,1</td>
			<td>5.3 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnesio, Mg2+ *
</td>
			<td>3,9 ± 0,3</td>
			<td>32,5 ± 0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Potasio, K+ *
</td>
			<td>8.2 ± 1.2</td>
			<td>8.6 ± 1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodio, Na+ *
</td>
			<td>160 ± 3</td>
			<td>157 ± 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato, NO3- **
</td>
			<td>164</td>
			<td>172.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato, SO4- **
</td>
			<td>3.8</td>
			<td>18.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro, Cl- **
</td>
			<td>1.5</td>
			<td>31.5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. La composición química e iónica de los medios experimentales probados.

Este artículo explica en detalle un enfoque sistemático para evaluar la disponibilidad de microminerales en el salmón del Atlántico. La metodología incluye herramientas y modelos con complejidad biológica creciente: (1) análisis de especiación química, (2) solubilidad in vitro, (3) estudios de captación en líneas celulares y (4) estudios de peces in vivo.

Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Estudiamos la disponibilidad de solubilidad de micrometales como el zinc selenio con diferentes formas o fuentes químicas, como lo llamamos, en el contexto del cambio en la composición del alimento. En una suite de radionúclidos, pese aproximadamente 0,2 gramos de muestras de alimento de salmón del Atlántico molido y mézclelo con un radiotrazador de zinc de actividad específica conocida en un tubo de muestra de volumen de cinco mililitros. Prepare otras seis alícuotas del tampón y agregue uno de los aminoácidos que se muestran aquí a cada uno para alcanzar una concentración molar final de cinco milimolares.Agregue un tampón luminal intestinal de agua dulce para alimentar la muestra. A continuación, agregue el tampón luminal intestinal de agua dulce a las alícuotas tampón que contienen los aminoácidos. Cierre los tubos y haga girarlos en un girador giratorio a 25 RPM durante 30 minutos.Luego, centrifugar a 1, 157 x g durante 10 minutos, para separar las fracciones solubles y no solubles. Utilice un cajero gamma para medir los recuentos por minuto del radiotrazador de zinc en las fracciones solubles y no solubles. Lave la línea celular intestinal derivada de la trucha arco iris dos veces con un mililitro de solución de EDTA y desvía la solución después de cada lavado con una pipeta.Trate las células lavadas con solución de tripsina al 0,25%. Gire suavemente el matraz en ángulos agudos durante dos minutos. Luego agregue 10 mililitros de medio L-15 que contenga 5% FBS para neutralizar la tripsina.Usando una pipeta estéril, decantar la suspensión celular resultante en un tubo de centrífuga inferior cónico. Centrifugar a 130 x G durante tres minutos. Luego, utilizando un hemocitómetro, determine la densidad de las células cosechadas mediante el conteo manual.Seme las células en placas de 24 pozos a una densidad celular de 50,000 células por mililitro, por pozo, e incube las placas a 19 grados Celsius bajo una atmósfera normal durante 48 horas antes de los experimentos. Después de alimentar a los peces durante 11 días y sacrificarlos, recolecte una muestra agrupada de las heces del pez despojándolas de la aleta ventral al ano y colóquela en un plato. Use una espátula para transferir las heces de la placa a un tubo cónico de 50 mililitros.Almacene inmediatamente las muestras a 20 grados centígrados. En este estudio, la disponibilidad mineral de la alimentación para peces se evalúa utilizando una serie de métodos complementarios. El análisis representativo de la alimentación del salmón del Atlántico a través del método de espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente por cromatografía de tamaño proporciona datos sobre las especies químicas de zinc que se encuentran en la fracción soluble.Cinco picos que contienen zinc se pueden ver en esta fracción, cada uno con un peso molecular diferente. Las especies químicas de zinc que se encuentran en la fracción soluble pueden tener diferentes fuentes, porque el alimento utilizado contiene ingredientes marinos y vegetales, y se complementa. El rango de peso molecular de estas especies sugiere que estos compuestos podrían ser metaloproteínas.Mientras que la solubilidad del zinc suplementado 65 aumenta la presencia de todos los aminoácidos probados, se encuentra una mayor solubilidad con la histidina y la lisina. La absorción apical de zinc en las células GC de Arteca está significativamente influenciada por la presencia de L-Met o DL-Met a dos concentraciones milimolares. Además, el impacto de la metionina en la absorción de zinc se ve afectado negativamente por la presencia de BCH.La principal ventaja de este protocolo es que intentamos combinar diferentes enfoques en estudios visuales, analíticos e invivo, para comparar y complementar entre sí cuando se trata de estudiar la disponibilidad de minerales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Aquí, presentamos un protocolo fácil de seguir para establecer un sistema hidropónico exitoso para estudios de nutrición de plantas. Este protocolo ha sido ampliamente probado en Arabidopsis y puede adaptarse fácilmente a otras especies de plantas para estudiar los requisitos nutricionales específicos o el efecto de elementos no esenciales en el crecimiento y desarrollo de las plantas.

La hidroponía: un sistema versátil para el Estudio de nutrientes Las respuestas de las plantas a la asignación y disponibilidad de nutrientes y la exposición a elementos tóxicos

El pez cebra está emergiendo como un modelo valioso de procesamiento de lípidos en la dieta y enfermedades metabólicas. Se describen los protocolos de alimentación para larvas ricas en lípidos, imágenes en vivo de análogos lipídicos fluorescentes en la dieta y cuantificación de la ingesta de alimentos. Estas técnicas se pueden aplicar a una variedad de técnicas de detección, imágenes e indagación basada en hipótesis.

La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos

Este protocolo describe el uso de hisopos de colector de aceite y análisis de lodos de sistemas de pez cebra, que conduce a aumento de detección en comparación con el uso de centinelas para detectar patógenos como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp.,  Pseudocapillaria tomentosa. También se propone un sistema para controlar la p. tomentosa huevos en cuarentena.

Proyección ambiental de hydrophila de la Aeromonasy Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa en los sistemas de pez cebra

Las líneas celulares cultivadas primarias o establecidas se utilizan comúnmente para abordar las cuestiones biológicas y mecanicistas fundamentales como un enfoque inicial antes de usar modelos animales. Este protocolo describe cómo preparar extractos celulares enteros y fracciones subcelulares para estudios de zinc (Zn) y otros oligoelementos con espectroscopía de absorbancia atómica.

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

El aumento de la tasa de análisis farmacológicos y toxicocinéticos de metales y compuestos a base de metales en el pez cebra puede ser ventajoso para los estudios de traducción ambiental y clínica. La limitación de la absorción de exposición desconocida en el agua se superó mediante la realización de análisis de metales traza en tejido de pez cebra digerido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente.

Absorción de dosis de exposición a compuestos a base de platino y rutenio en peces cebra mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente con aplicaciones más amplias

Este protocolo detalla la preparación de medios limitados en Zn2+, vasos de crecimiento y cultivos de semillas para producir ribosomas limitados en Zn2+ en micobacterias. Las trazas de Zn2+ conducen al crecimiento limitante de Zn2+ y describimos las características morfogénicas utilizadas como bioindicadores para verificar la limitación de Zn2+ in vitro en la bacteria modelo, Mycobacterium smegmatis, y el patógeno humano M. tuberculosis.

Uso de Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones de crecimiento limitadas por zinc en micobacterias

Este estudio presenta un método de alimentación basado en gelatina que permite la administración oral precisa, no invasiva y basada en la masa corporal en peces cebra adultos. El protocolo demuestra una aceptación fiable de la alimentación y, como prueba de principio, la entrega exitosa de MK-801, lo que resultó en los efectos conductuales esperados.

Un enfoque simple y preciso basado en alimentación para la administración oral de fármacos en peces

Aprende a evaluar la biodisponibilidad de zinc en alimentos para Salmo salar mediante métodos analíticos, in vitro e in vivo. Esta combinación mejora la formulación de dietas en acuicultura.

Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico

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