Name: Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a analizar células individuales en suspensión mediante espectrometría de masas con sonda única y sistema de manipulación celular integrado. Este método permite detectar metabolitos, lípidos y fármacos intracelulares con mínima preparación de muestra.

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Los autores agradecen a Naga Rama Kothapalli por su trabajo en el desarrollo de la preparación de muestras para células de suspensión y experimentos de lisato celular. Además, los autores agradecen a los NIH (R01GM116116 y R21CA204706) por su financiación.

1. Fabricación de la sonda de selección de celdas de vidrio
<ol><li>Convierta tubos de vidrio de un solo diámetro en una sonda cónica con una punta afilada.<ol>
<li>Coloque un tubo de vidrio de un solo orificio (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) en las abrazaderas de un soporte de pipeta vertical, centrando el vidrio con respecto a la bobina de calentamiento y apriete para fijar el tubo en su lugar. La bobina de calentamiento se compone de un alambre de resistencia al níquel-cromo de calibre 18 (60 mm de longitud) enrollado alrededor de una varilla metálica (diámetro de 3,90 mm) 2,5 veces.</li>
		<li>Ajuste el tubo de vidrio con el programa de temperatura 19.5 (unidad del fabricante). Este parámetro se puede modificar para un instrumento en particular.</li>
		<li>Ajuste el émbolo solenoide a 4 (unidad del fabricante). Este parámetro se puede modificar para un instrumento en particular.</li>
		<li>Activa el solenoide para tirar del tubo de vidrio. Este paso crea dos sondas fusionadas en la punta.</li>
		<li>Utilice pinzas para cortar 1 mm de distancia de la punta de cada sonda, creando un orificio de 10 m de diámetro en la punta de la sonda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doble la sonda de vidrio para facilitar el acoplamiento a la configuración SCMS ICMP/de una sola sonda.<ol>
<li>Coloque una sonda de vidrio tirado en la microforja, colocando la punta de 3 mm por encima del cable de calentamiento de platino.</li>
		<li>Gire el calor del cable de platino al 30% de la temperatura máxima.</li>
		<li>Doble la sonda a 45o desde la posición original (Figura2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ensamblaje integrado de la plataforma de manipulación celular
<ol><li>Coloque el microscopio invertido, el microinyector y dos sistemas de manipulación celular en una mesa motorizada para facilitar el acoplamiento con el espectrómetro de masas.<ol>
<li>Modifique uno de los sistemas de manipulación celular para acomodar una sola sonda reemplazando el extremo por una abrazadera de brazo.</li>
		<li>Utilice una jeringa de plástico con una aguja para llenar el microinyector con aceite mineral. Evite las burbujas en el tubo, ya que esto afectará la succión.</li>
		<li>Sustituya la inserción del escenario del microscopio invertido por la placa calentada. Fije la placa calentada a 37 oC antes del análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configure el dispositivo de selección de celdas de vidrio.<ol>
<li>Inserte la sonda de selección de celda de vidrio dentro del soporte metálico del microinyector colocando el lado largo (no doblado) en el soporte capilar y apretando el tornillo para fijar la sonda en su lugar. Coloque el ángulo de la punta de la sonda paralelo a la placa calentada. ADVERTENCIA: La sonda de vidrio es muy afilada y frágil, y se rompe fácilmente. Proteja sus ojos y tenga mucho cuidado al insertar la sonda en el microinyector.</li>
		<li>Fije el soporte metálico del microinyector en el sistema de manipulación celular. Coloque la punta de la sonda cerca del centro de la luz invertida del microscopio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cree un tubo de transferencia de iones extendido para la entrada del espectrómetro de masas
<ol><li>Utilice una cortadora de metal para cortar una pieza de tubo de acero inoxidable (OD: 0.0625 (1/16) in, ID: 0.021 in) a 250 mm de longitud.</li>
	<li>Mida 135 mm desde el extremo y coloque un asco metálico para que 135 mm se exponga a la atmósfera y 115 mm estarán dentro del espectrómetro de masas. Asegure el asco usando dos llaves para apretarla.</li>
</ol>4. Acople el ICMP con una configuración de una sola sonda
<ol><li>Fije la corredera de vidrio que contiene la sonda única en la abrazadera del brazo del sistema de manipulación celular. NOTA: Las sondas individuales se fabrican de acuerdo con un protocolo48 publicado anteriormente con dos cambios menores en el estudio actual: el emisor nano-ESI se hace más largo para facilitar el acoplamiento al espectrómetro de masas, y las sondas individuales se pegan al vidrio lado en el lado derecho para evitar interferir con el movimiento espacial del dispositivo de selección de celda de vidrio (Figura 2).</li>
	<li>Conecte el capilar que proporciona disolvente a una unión conductora colocando el capilar en el manguito (1/16 x .005 pulg.) de la férula de plástico y apretando el accesorio con los dedos.<ol>
<li>Conectar el otro lado de la unión conductora a un capilar (ID: 40 m, OD: 150 m), que se conecta a una jeringa que contiene el disolvente de muestreo, colocando el capilar en el manguito (1/32 x .007 pulg.) y apretando el accesorio. Utilice acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico como disolvente de muestreo en estos experimentos. NOTA: El disolvente de muestreo es flexible, pero debe contener principalmente acetonitrilo (o acetonitrilo con ácido fórmico para una mejor ionización) para una lisis celular de microescala rápida.</li>
		<li>Fije la jeringa en la bomba de la jeringa en el espectrómetro de masas.</li>
		<li>Coloque el cable de tensión de ionización en un cable de cobre conectado a la unión conductora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el emisor nano-ESI a 1 mm en el orificio del tubo de transferencia de iones extendido.<ol>
<li>Utilice el sistema de manipulación celular para controlar los movimientos espaciales de la sonda única y colocar el emisor nano-ESI centralmente delante del tubo de transferencia de iones extendido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparación de muestras de células suspendidas
<ol><li>El día antes del análisis (-18-24 h), las células de salida de semillas para su prueba en un matraz de cultivo celular (T25). K562 células de leucemia mieloide humana se utilizan como modelos en este estudio.<ol>
<li>Caliente 1x fosfato tamponado salino (PBS) y Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio complementado con 10% suero bovino fetal sintético (FBS) y 1% penicilina-estreptomicina a 37 oC durante 30 min.</li>
		<li>Semilla s 1 x 106 células en un volumen total de 10 ml mediante la combinación de células con medio cálido. En general, utilice una pipeta de 10 ml para colocar 8 ml de medio RPMI en un matraz de cultivo celular. A continuación, utilice una pipeta de 2 ml para poner 2 ml de células K562 confluentes en el medio para 1 x 106 células.</li>
		<li>Incubar las células a 37oC y 5%co2 hasta su análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare las células para el análisis.<ol>
<li>Pipetear las células del matraz de cultivo celular en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
		<li>Gire las células hacia abajo a 400 x g y 37 oC durante 5 min y deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en 4 ml de medio RPMI que contiene el compuesto del fármaco a la concentración de tratamiento deseada. NOTA: Para el análisis de celdas de control, vuelva a suspender las celdas en 4 ml de medio RPMI y vaya al paso6.</li>
		<li>Incubar las células durante el tiempo de tratamiento a37oC y 5% co2 .</li>
		<li>Esgire las células a 400 x g y 37 oC durante 5 min.</li>
		<li>Las células se resuspenden en 10 ml de PBS, y centrífugan a 400 x g y 37 oC durante 5 min. Después de girar, descarte el sobrenadante. Repita este paso 3 veces para minimizar la detección de fármacos de componentes extracelulares.</li>
		<li>Resuspender celdas en 4 ml de PBS para su análisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Realice mediciones SCMS utilizando la configuración ICMP/de una sola sonda
<ol><li>Personalice los parámetros para el espectrómetro de masas para el experimento.<ol>
<li>En el encabezado Modo de escaneado del software del instrumento, seleccione Definir escaneado. Utilice una resolución de 60.000 m/m a m/z 400, 1 microescaneado, tiempo máximo de inyección de 100 ms y control automático de ganancia (AGC) activado. Para los experimentos se utilizó un rango de masa (m/z) de 100-1000. Los parámetros se pueden modificar en función del modelo de instrumento.</li>
		<li>En Bomba de jeringa, seleccione un caudal de 150 nL/min. El caudal debe optimizarse para cada experimento.</li>
		<li>Seleccione la fuente NSI y aplique una tensión de 4,5 kV. Este parámetro también debe optimizarse para cada experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encienda el microscopio invertido (con aumento de 40x seleccionado tanto para la placa superior como para la lente inferior) y conéctelo al puerto USB de un portátil para capturar fuentes de vídeo en directo. Encienda la placa calentada y establézala a 37 oC.</li>
	<li>En el equipo, vaya a la pestaña Adquirir datos y seleccione Continuamente en Tiempo de adquisición .</li>
	<li>Prepare la muestra para el análisis.<ol>
<li>Pipeta de 2-3 ml de muestra en la tapa de una pequeña placa Petri (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Coloque la muestra en el centro de la luz del microscopio invertido en la parte superior de la placa calentada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare la sonda de selección de celdas de vidrio para su análisis. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la sonda para que su punta se enfoque bajo el microscopio invertido en el mismo plano que las células.</li>
	<li>Seleccione una celda individual para el análisis.<ol>
<li>Utilice el sistema de manipulación de celdas para mover la punta de la sonda de selección de celda a una celda de destino. Este proceso se supervisa mediante el microscopio invertido. NOTA: Si la punta de la sonda de selección de celda no se puede enfocar en el mismo plano que las celdas, es posible que la parte doblada de la sonda no esté en ángulo adecuada. Ajuste la posición de la sonda de selección de células hasta que ambas puntas de la sonda se puedan enfocar junto con las células bajo el microscopio.</li>
		<li>Gire suavemente el mango del microinyector para ajustar la posición del aceite mineral dentro del tubo. El microinyector proporciona una succión suave para fijar la célula objetivo a la punta de la sonda de selección de células. NOTA: Si la sonda de selección de celdano no puede capturar la célula a través de la fuerza de aspiración, compruebe la sonda de selección de celda para asegurarse de que está completamente insertada en el soporte capilar. Además, inspeccione los niveles de aceite mineral en el microinyector y la tubería, y expulse el aire si los hay.</li>
		<li>Utilice el sistema de manipulación celular para mover la celda en la punta de la sonda de selección de celda a la punta de una sola sonda, utilizando un microscopio digital centrado en la punta de una sola sonda para monitorear este proceso. Al tocar, una pequeña gota de acetonitrilo en la punta de una sola sonda induce una silda rápida de la célula, y luego el lisato celular se ioniza inmediatamente para el análisis en línea de la EM. NOTA: Debido a que la celda seleccionada está asegurada a la punta de la sonda de selección de celda a través de una succión suave, esta celda se puede separar potencialmente durante su transferencia a la punta de una sola sonda. Por lo tanto, si las señales iónionas de lípidos celulares típicos (ver resultados representativos a continuación) no se observan dentro de 5 s, es posible que la célula se desató, y se necesita la selección de una célula diferente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La plataforma integrada de manipulación y análisis celular está construida para ampliar la versatilidad del método de Ep de una sola sonda, permitiendo el análisis rápido y en línea de células no adherentes en un entorno casi nativo. Una ventaja importante de la técnica es que se requiere una preparación mínima de la muestra, por lo que las células se analizan en condiciones que imitan su estado estándar. Particularmente, las células individuales de interés pueden ser identificadas y seleccionadas visualmente, minimizando la influencia del efecto de la matriz en la eficiencia de la ionización de la EM mientras se mantienen las células en su entorno natural, por lo que los resultados son más representativos de las células nativas de las células nativas estado (Figura S3). Esta técnica se puede utilizar potencialmente para estudiar las células del paciente suspendidas en biofluidos en estudios futuros. Otra ventaja de esta técnica es la selección flexible del disolvente de muestreo. Es importante incluir acetonitrilo como el disolvente de muestreo principal para que la lisis en microescala pueda ocurrir rápidamente. Potencialmente, las normas internas (por ejemplo, compuestos farmacológicos etiquetados isotópicamente) pueden añadirse al disolvente de muestreo para cuantificar moléculas de interés (por ejemplo, moléculas de fármacos) de células individuales, incluidas aquellas que pueden desempeñar un papel clave en la revolución personalización de tratamientos farmacológicos en el futuro54.
Aunque este sistema integrado se puede utilizar convenientemente para analizar amplios rangos de celdas, una limitación del método es que ni la sonda de una sola sonda ni la sonda de selección de celda está disponible comercialmente; dictando la necesidad de optimización de muchos parámetros (por ejemplo, caudal, voltaje, longitud entre el emisor nano-ESI y el tubo de transferencia iónico, etc.) antes de cada experimento. Además, debido a la pequeñez de la sonda de selección de una sola sonda y de la célula, la perturbación ambiental (por ejemplo, el flujo de aire) puede dar lugar a dificultades para establecer una unión entre las dos sondas. Una solución a corto plazo es la flexión de la sonda de selección de celda cerca del final para minimizar la longitud del estrechado. El trabajo futuro incluye el desarrollo de una carcasa para encerrar las partes críticas de la configuración para minimizar los efectos ambientales. Debido a la cantidad limitada de contenido celular y el corto tiempo de adquisición (2-3 s) de una célula, el análisis de EmS/MS sólo se puede llevar a cabo para especies relativamente abundantes. Otros factores que influyen en la sensibilidad de detección incluyen la eficiencia de ionización suprimida debido a la introducción de la matriz junto con la célula y la posible pérdida de iones a través del tubo de transferencia de iones extendido.

La biología humana, especialmente la biología de la enfermedad, se entiende cada vez más como el resultado de actividades a nivel de células individuales, pero los métodos analíticos tradicionales, como la espectrometría de masas de cromatografía líquida (LCMS), se utilizan generalmente para analizar muestras preparadas a partir de poblaciones de células, mientras que la información molecular adquirida no puede representar con precisión los procesos químicos a nivel de células individuales. Estos métodos tradicionales estándar son incapaces de discernir los efectos de la heterogeneidad celular en una medición analítica, y el proceso de destrucción y mezcla de las células para preparar el lisado potencialmente conduce a la alteración o pérdida de la componentes1,2. Estas limitaciones de los métodos tradicionales son especialmente importantes en el análisis de las células del paciente, en el que las muestras obtenidas pueden contener una mezcla compleja de muchos tipos de células diferentes. Para superar estas deficiencias, los métodos de análisis molecular de una sola célula, incluidos los métodos de espectrometría de masas de una sola célula (SCMS), se están desarrollando y aplicando cada vez más al bioanálisis, especialmente de metabolitos celulares y bajo peso molecular biomoléculas3,4.
Las primeras técnicas SCMS desarrolladas utilizaron técnicas basadas en vacío para realizar los análisis en condiciones no ambientales2,5,6,7,8,9, 10,11. Las técnicas SCMS no ambientales son capaces de analizar lípidos celulares y metabolitos, pero requieren pretratamiento de muestras en condiciones artificiales, y por lo tanto no son adecuadas para el análisis en tiempo real. El proceso de preparación de muestras para el análisis no ambiental incluye la adición de componentes de matriz, y esta preparación puede alterar los componentes celulares de su entorno natural12. Por lo tanto, las técnicas de espectrometría de masas ambientales (MS), que no requieren un vacío para el entorno de muestreo, se utilizan para analizar las células en un entorno casi nativo. No tener un entorno de vacío permite versatilidad en el diseño experimental; cámaras se pueden agregar para monitorear el proceso celular y las técnicas de ionización más suaves se pueden combinar con técnicas de separación para recibir mejor información de cada experimento de una sola célula4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
El método SCMS de una sola sonda es una técnica ambiental que analiza líneas celulares de cáncer de mamíferos vivos en un entorno casi nativo21,43,44,45,46. Además, el dispositivo de una sola sonda se ha utilizado para otras aplicaciones de espectrometría de masas, incluyendo el análisis de moléculas extracelulares en esferoides multicelulares e imágenes de EM de tejidos47,48,49 ,50,51,52. Sin embargo, dado que la inmovilización celular en sustratos es necesaria para este método, las células de suspensión no se pueden analizar directamente utilizando esta técnica3,53. Por lo tanto, el sistema SCMS de una sola sonda no se podía utilizar directamente para muestrear células individuales no adherentes, como líneas celulares no adherentes o células de suspensión aisladas de la sangre de un paciente u otros fluidos corporales54. En este trabajo, se combina una plataforma de manipulación de células integrada (ICMP) con la técnica SCMS de una sola sonda para analizar células de suspensión en línea en vivo con una preparación mínima de la muestra (Figura 1)46. El ICMP consiste en un microscopio invertido para monitorear la selección celular, una sonda de selección de celdas de vidrio, un microinyector para capturar células flotantes individuales, una placa calentada para mantener la temperatura celular, dos sistemas de manipulación celular para controlar el espacio movimientos tanto de la sonda de selección de células de vidrio como de una sola sonda, y un microscopio digital para observar la transferencia celular desde la punta de la sonda de selección de células a la punta de una sola sonda. La fabricación de la sonda única se detalla en publicaciones anteriores y no se abordará aquí21,48. El sistema ICMP/de una sola sonda está acoplado a un espectrómetro de masas de alta resolución. Esta configuración integrada permite el muestreo de células únicas identificadas a partir de muestras biológicas complejas con efectos mínimos de moléculas de matriz.

<table><tbody><tr><td>Acetontrilo</td><td>Millipore Co.</td><td>AX0145-1</td><td>Disolvente de muestreo</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>6221</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>Alambre de cobre</td><td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td><td>Muerto blando, redondo, calibre 20, 25 pies</td><td>Configuración de unión conductora</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico digital</td><td>Shenzhen D& F Co.</td><td>Supereyes T004</td><td>Analysis</td></tr><tr><td>Micropipeta desechable, 1-5 y micro; L</td><td>Rochester Scientific</td><td>5065</td><td>Fabricación de sonda de selección celular</td></tr><tr><td>Tubo de cuarzo de doble orificio, 1.120 "x0.005" x12"</td> <td>Friedrich & Dimmock, Inc.</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td>Fabricación de una sola sonda</td></tr><tr><td>Resina epoxi</td><td>Devcon</td><td>Nº de pieza 20945</td><td>Fabricación de una sola sonda</td></tr><tr><td>Sistema de manipulación de células Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>Transferman NK517800397-U.R.</td><td>Icmp</td></tr><tr><td>Tuerca externa</td><td>VALCO*CHEMINERT</td><td>EN1</td><td>Fabricación de tubos de transferencia de iones</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388-500ML</td><td>Disolvente de muestreo</td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida, ID: 40 y micro; m, OD: 100 y micro; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP040105</td><td>Fabricación de una sola sonda, configuración de unión conductora</td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida, ID: 50 y micro; m, OD: 150 y micro; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150015</td><td>Configuración de unión conductora</td></tr><tr><td>HyClone Suero fetal bovino sintético (FBS)</td><td>Fischer Sci</td><td>SH3006603</td><td>Microfiltro</td></tr><tr><td>en línea</td> para cultivo celular <td>IDEX Health & Science LLC</td><td>M-520 Configuración de</td><td>unión conductora</td></tr><tr><td>Extractor láser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-2000</td><td>Fabricación de una sola sonda</td></tr><tr><td>Lámpara LED UV</td><td>Foshan Liang Ya Equipo dental</td><td>LY-C240</td><td>Fabricación de una sola sonda</td></tr><tr><td>LTQ Espectrómetro de masas Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td>Análisis</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige, Co.</td><td>MF-9</td><td>Fabricación de sondas de selección celular</td></tr><tr><td>Microunion</td><td>IDEX Health & Science LLC</td><td>M-539 Tubo de</td><td>PEEK de unión conductora</td></tr><tr><td>, 1/32x0.005x 5 pies</td><td>IDEX Health & Science LLC</td><td>1576</td><td>Configuración de unión conductora</td></tr><tr><td>Tubo PEEK, 1/32x0.007x 5ft</td><td>IDEX Health & Science LLC</td><td>1577</td><td>Configuración de unión conductora</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15140-122 Placa de</td> Petri de <td>cultivo celular</td></tr><tr><td>, 35x10 mm</td><td>VWR</td><td>25382-334 Preparación de</td><td>muestras</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>VWR</td><td>0780-50L</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Alambre de platino</td><td>Narishige, Co.</td><td>Modelo PT-A Microforge</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Nikon</td><td>PSM-2120</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>RPMI, 1X con Corning glutagro</td><td>Corning</td><td>10-104-CV</td><td>Cultivo</td></tr><tr><td>celular Tubos de un solo orificio</td><td>Boralex</td><td>5065</td><td>Fabricación de sondas de selección de células</td></tr><tr><td>Casquillos de acero inoxidable, para 1/16" de diámetro exterior</td><td>IDEX Health & Science LLC</td><td>VHP-200-01x Fabricación de tubos de</td><td>transferencia de iones</td></tr><tr><td>Tubos de acero inoxidable, 1/32x 205 y micro; m x30 cm</td><td>IDEX Salud & Science LLC</td><td>U-1128 Fabricación de tubos de</td><td>transferencia de iones</td></tr><tr><td>Jeringa, 250 y micro; L</td><td>Hamilton</td><td>1725LTN250UL</td><td>Jeringa de muestreo Matraz</td></tr><tr><td>T25</td><td>CellStar</td><td>690160</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Brida de interfaz de fuente de iones Thermo LTQ XL</td><td>Nuevo objetivo</td><td>PB5500</td><td>Análisis</td></tr><tr><td>ThermoPlate</td><td>TokaiHit</td><td>55R30N</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Cortador de tubos, para 1/16" acero inoxidable</td><td>SUPELCO</td><td>58692-U</td><td>Fabricación de tubos de transferencia de iones</td></tr><tr><td>Microscopio de fotografía digital USB</td><td>dx.com</td><td>SO2 25~500X</td><td>Análisis</td></tr><tr><td>Resina de curado UV</td><td>Prime</td><td>Dental N.º de artículo 006.030</td><td>Fabricación de una sola sonda</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 720</td><td>Fabricación de sondas de selección de celdas</td></tr><tr><td>Carcasa de voltaje</td><td>PicoChip</td><td>PCH-A00120</td><td>Interfaz ICMP/MS</td></tr><tr><td>Cortador de alambre</td><td>Craftsman</td><td>4 1/2 en extremo</td><td>Configuración de unión conductora</td></tr></tbody></table>

plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

La espectrometría de masas de una sola célula (SCMS) permite la detección sensible y el análisis preciso de amplios rangos de especies celulares a nivel de células individuales. La sonda única, un dispositivo de muestreo e ionización a microescala, se puede acoplar con un espectrómetro de masas para el análisis Rápido y en línea de SCMS de componentes celulares en condiciones ambientales. Anteriormente, la técnica SCMS de una sola sonda se utilizaba principalmente para medir las células inmovilizadas en un sustrato, limitando los tipos de células para los estudios. En el estudio actual, la tecnología SCMS de una sola sonda se ha integrado con un sistema de manipulación celular, normalmente utilizado para la fertilización in vitro. Esta plataforma integrada de manipulación y análisis de células utiliza una sonda de selección de células para capturar células flotantes individuales identificadas y transferir las células a la punta de una sola sonda para la lisis de microescala, seguida de un análisis inmediato de espectrometría de masas. Este proceso de captura y transferencia elimina las células de la solución circundante antes del análisis, minimizando la introducción de moléculas de matriz en el análisis de espectrometría de masas. Esta configuración integrada es capaz de analizar SCMS de células aisladas por pacientes dirigidas presentes en muestras de fluidos corporales (por ejemplo, orina, sangre, saliva, etc.), lo que permite posibles aplicaciones de análisis SCMS a la medicina humana y la biología de enfermedades.

En primer lugar, las células K562 no tratadas se utilizan para establecer el método experimental. En un experimento típico de SCMS, se pueden observar cambios obvios de espectros de masa mediante la transferencia de una célula, durante la detección de contenido celular y después de finalizar la medición (FiguraS1). Tres picos celulares comunes de lípidos (fosfatidilcolina, PC), incluyendo PC(34:4)(m/z 754.536), PC(36:4) (m/z 782.567), y PC(38:5) (m/z 808.583), se monitorean para asegurarse de que la célula se transfiere con éxito celular y celular y celular y celular se detectan contenidos (FiguraS2)21,43,46,55,56. Si no se observan picos de lípidos dentro de 5 s, el nivel de aceite mineral en el microinyector se altera para reducir la succión que sostiene la célula en la punta de la sonda de selección celular; se debe tener precaución para que no se expulse ningún aceite mineral de la sonda de selección celular. La identidad de muchos PC en el rango de masa de m/z 750-850 se confirma utilizando MS/MS en muestras de lisato celular no tratadas (Figura3, Figura S2, Tabla 1)46.
Las células K562 también se someten a tratamiento con varios compuestos farmacológicos para ampliar la versatilidad del método. Las células K562 se incuban con gemcitabina (1 m) y taxol (1 m) durante 1 h y OSW-1 (100 nM, 1 m) durante 4 h y 2 h, respectivamente. Las células se lavan con PBS para minimizar la detección de compuestos farmacológicos a partir de contenido extracelular. La contribución de la matriz (por ejemplo, iones del medio de cultivo celular, PBS y disolvente) a espectros de masa de contenido celular puede eliminarse a través de la resta de datos, debido a sus señales iónicas significativamente diferentes (FiguraS3). Los tres compuestos farmacológicos se detectan utilizando la configuración ICMP/de una sola sonda MS (Figura S4)46. Estos resultados sugieren que este método se puede utilizar para estudiar lípidos intracelulares, medicamentos y metabolitos en el nivel de una sola célula de las células en solución en un entorno casi nativo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg"> Figura 1. Configuración experimental para experimentos de MS de células de suspensión única. (A) La plataforma de manipulación de células integrada (ICMP) junto con un espectrómetro de masas. (B) Esquema para el análisis de celdas suspendidas. (C) Vista experimental de las celdas K562 que se seleccionarán mediante la sonda de selección de celdas. Reimpreso con permiso de Standke et al.46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg"> Figura 2. Fotos de una sonda única modificada y una sonda de selección de celda sin usar para experimentos de MS de una sola célula de suspensión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg"> Figura 3. Espectro de masa ampliado desde una sola célula que muestra las especies representativas (m/z 750-850). Las estructuras químicas se confirman mediante el análisis MS/MS (FiguraS1). Reimpreso con permiso de Standke et al46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>
Molécula de fármaco*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Error de masa (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Gemcitabina + H] +
</td>
			<td>264.076</td>
			<td>11.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>[Taxol + Na] +
</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2.74</td>
		</tr>
<tr>
<td>[OSW-1 + Na] +
</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0.89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lípidos celulares</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:4) + H] +
</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:3) + H] +
</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3.44</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(34:2) + H] +
</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:5) + H] +
</td>
			<td>780.551</td>
			<td>3.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:4) + H] +
</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(36:3) + H] +
</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:7) + H] +
</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:6) + H] +
</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:5) + H] +
</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(38:4) + H] +
</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>[PC(40:7) + H] +
</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Se identificaron componentes celulares mediante la configuración ICMP/Single-probe. La detección de todos los compuestos farmacológicos se confirmó comparando los resultados de la EM/MS con el compuesto estándar.

Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Dado que este método analiza las células de la solución, se puede utilizar para estudiar las células en un entorno casi nativo. Esto incluye el análisis de muestras de células derivadas del paciente. Esta técnica requiere poca o ninguna preparación de muestras de células.Por lo tanto, podemos analizar células individuales en línea en condiciones ambientales, lo que nos permite explorar la heterogeneidad celular. Esta técnica se puede aplicar para estudiar biopsias líquidas de una variedad de diferentes estados de la enfermedad, ya que puede analizar diferentes tipos de células directamente aisladas de muestras de pacientes. Para convertir tubos de vidrio de un solo agujero en una sonda cónica con una punta afilada, coloque primero un tubo de vidrio de un solo agujero en las abrazaderas de un soporte de pipeta vertical, centrando el vidrio con respecto a la bobina de calentamiento y apriete para asegurar el tubo en su lugar.La bobina de calentamiento se compone de un alambre de resistencia al cromo de níquel de 18 calibre enrollado alrededor de una varilla de metal 2,5 veces. Ajuste el tubo de vidrio con el programa de temperatura 19.5. Ajuste el émbolo solenoide en cuatro.Dispare el solenoide para tirar del tubo de vidrio. Este paso crea dos sondas fusionadas en la punta. Utilice suéteres para cortar aproximadamente un milímetro de distancia de la punta de cada sonda, creando un orificio de aproximadamente 10 micras de diámetro en la punta de la sonda.Para doblar la sonda de vidrio para facilitar el acoplamiento al ICMP, configuración de SCMS de sonda única. Primero coloca una sonda de vidrio tirado en el microforge. Coloque la parte superior aproximadamente tres milímetros por encima del cable de calefacción de platino.A continuación, gire el calor del cable de platino al 30% de la temperatura máxima. Doble la sonda aproximadamente a 45 grados de la posición original. Coloque el microinyector del microscopio invertido en dos sistemas de manipulación celular en una mesa motorizada para facilitar el acoplamiento con el espectrómetro de masas.Para configurar el dispositivo de selección de celdas de vidrio, inserte la sonda de selección de celda de vidrio dentro del soporte de metal del microinyector colocando la diapositiva larga en el soporte capilar y apretando el tornillo para fijar la sonda en su lugar. Coloque las puntas de la sonda en ángulo paralelo a la placa calentada. Fije el soporte metálico del microinyector en el sistema de manipulación celular.A continuación, coloque la punta de la sonda cerca del centro de la luz invertida del microscopio. Fije la corredera de vidrio que contiene la sonda única en la abrazadera del brazo del sistema de manipulación celular. Conecte el disolvente que proporciona capilar a una unión conductora colocando el capilar en el manguito de la férula de plástico y apretando el dedo el accesorio.Conecte el otro lado de la unión conductora a un capilar que esté conectado a una jeringa que contenga el disolvente de muestreo colocando el capilar en el manguito y apretando el accesorio. Utilice acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% como disolvente de muestreo en estos experimentos. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa en el espectrómetro de masas.Coloque la ionización de nanoelectrospray o el emisor nano ESI aproximadamente un milímetro hasta el orificio del tubo de transferencia de iones extendido. Utilice el sistema de manipulación celular para controlar los movimientos espaciales de la sonda única y colocar el emisor nano ESI de forma centralizada delante del tubo de transferencia de iones extendidos. Pipetear las células del matraz de cultivo celular en un tubo centrífugo de 15 mililitros.Gire las células a 400 veces G en 37 grados Celsius durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Resuspender las células en cuatro mililitros de medio RPMI que contiene el compuesto del fármaco en la concentración de tratamiento deseada. Personalice los parámetros experimentales para el espectrómetro de masas.En el encabezado del modo de escaneo del software del instrumento, seleccione definir análisis. Utilice una resolución de 60.000 A M sobre Z 400, un microescaneo de 100 milisegundos de tiempo máximo de inyección y un control automático de ganancia. En la bomba de jeringa, seleccione el caudal de 150 nanolitros por minuto.Seleccione la fuente NSI y aplique una tensión de aproximadamente 4,5 kilovoltas. Encienda el microscopio invertido a 40 veces el aumento seleccionado tanto para la placa superior como para la lente inferior. Conéctelo al puerto USB de un portátil para capturar transmisiones de vídeo en directo.Encienda la placa calentada y establézcala en 37 grados Centígrados. En el equipo, vaya a la pestaña Adquirir datos y seleccione continuamente el tiempo adquirido. Para preparar la muestra para el análisis, pipetee de dos a tres de la muestra en la tapa de un pequeño plato de petri.Coloque la muestra en el centro de la luz del microscopio invertido en la parte superior de la placa calentada. Prepare la sonda de selección de células de vidrio para su análisis. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la sonda de modo que su parte superior se centre bajo el microcsope invertido en el mismo plano que las celdas.Utilice el sistema de manipulación de celdas para mover la punta de la sonda de selección de celdas a una celda de destino para su análisis. Este proceso se supervisa mediante el microscopio invertido. Gire suavemente el mango del microinyector para ajustar la posición del aceite mineral dentro del tubo.El microinyector proporciona una succión suave para asegurar la célula objetivo a la punta de la sonda de selección de células. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la celda en la punta de la sonda de selección de celdas a la punta de una sola sonda utilizando un microscopio digital centrado en la punta de una sola sonda para monitorear este proceso. Las células K-562 no tratadas se utilizan para establecer el método experimental.En un experimento típico de SCMS, se pueden observar cambios obvios de espectros de masa a partir de la transferencia de una célula durante la detección del contenido celular y después de terminar la medición. Tres picos de lípidos celulares comunes incluyendo PC 34:4, PC 36:4, y PC 38:5 se monitorean para asegurarse de que la célula se transfiere con éxito y se detecta contenido celular. La identidad de muchos PC en el rango de masa de 750 a 850 se confirma utilizando MSMS en muestras de lito celular no tratada.Utilizando la configuración de MS de sonda única ICMP, Gemcitabine, Taxol y OSW1 se detectaron después de la incubación con células K-562. Estos resultados sugieren que este método se puede utilizar para estudiar lípidos intracelulares, fármacos y metabolitos a nivel de células únicas a partir de las células en solución en un entorno casi nativo. Recuerde colocar de forma segura la sonda de selección de celda de vidrio en el soporte universal de la pipeta para que la succión se pueda aplicar adecuadamente.Este método también se puede aplicar a muestras derivadas del paciente para distinguir las diferencias entre los metabolitos celulares de una variedad de tipos celulares, lo que nos permite obtener una mejor comprensión de estos estados de la enfermedad. Después de desarrollar este método, potencialmente podríamos implementar la cuantificación de compuestos farmacológicos a nivel de célula única. Cuando se trabaja con células, es importante tener un equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio y guantes.Se puede usar un desgaste ocular adicional cuando se trabaja con vidrio.

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Química

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