Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Dado que este método analiza las células de la solución, se puede utilizar para estudiar las células en un entorno casi nativo. Esto incluye el análisis de muestras de células derivadas del paciente. Esta técnica requiere poca o ninguna preparación de muestras de células.

Por lo tanto, podemos analizar células individuales en línea en condiciones ambientales, lo que nos permite explorar la heterogeneidad celular. Esta técnica se puede aplicar para estudiar biopsias líquidas de una variedad de diferentes estados de la enfermedad, ya que puede analizar diferentes tipos de células directamente aisladas de muestras de pacientes. Para convertir tubos de vidrio de un solo agujero en una sonda cónica con una punta afilada, coloque primero un tubo de vidrio de un solo agujero en las abrazaderas de un soporte de pipeta vertical, centrando el vidrio con respecto a la bobina de calentamiento y apriete para asegurar el tubo en su lugar.

La bobina de calentamiento se compone de un alambre de resistencia al cromo de níquel de 18 calibre enrollado alrededor de una varilla de metal 2,5 veces. Ajuste el tubo de vidrio con el programa de temperatura 19.5. Ajuste el émbolo solenoide en cuatro.

Dispare el solenoide para tirar del tubo de vidrio. Este paso crea dos sondas fusionadas en la punta. Utilice suéteres para cortar aproximadamente un milímetro de distancia de la punta de cada sonda, creando un orificio de aproximadamente 10 micras de diámetro en la punta de la sonda.

Para doblar la sonda de vidrio para facilitar el acoplamiento al ICMP, configuración de SCMS de sonda única. Primero coloca una sonda de vidrio tirado en el microforge. Coloque la parte superior aproximadamente tres milímetros por encima del cable de calefacción de platino.

A continuación, gire el calor del cable de platino al 30% de la temperatura máxima. Doble la sonda aproximadamente a 45 grados de la posición original. Coloque el microinyector del microscopio invertido en dos sistemas de manipulación celular en una mesa motorizada para facilitar el acoplamiento con el espectrómetro de masas.

Para configurar el dispositivo de selección de celdas de vidrio, inserte la sonda de selección de celda de vidrio dentro del soporte de metal del microinyector colocando la diapositiva larga en el soporte capilar y apretando el tornillo para fijar la sonda en su lugar. Coloque las puntas de la sonda en ángulo paralelo a la placa calentada. Fije el soporte metálico del microinyector en el sistema de manipulación celular.

A continuación, coloque la punta de la sonda cerca del centro de la luz invertida del microscopio. Fije la corredera de vidrio que contiene la sonda única en la abrazadera del brazo del sistema de manipulación celular. Conecte el disolvente que proporciona capilar a una unión conductora colocando el capilar en el manguito de la férula de plástico y apretando el dedo el accesorio.

Conecte el otro lado de la unión conductora a un capilar que esté conectado a una jeringa que contenga el disolvente de muestreo colocando el capilar en el manguito y apretando el accesorio. Utilice acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% como disolvente de muestreo en estos experimentos. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa en el espectrómetro de masas.

Coloque la ionización de nanoelectrospray o el emisor nano ESI aproximadamente un milímetro hasta el orificio del tubo de transferencia de iones extendido. Utilice el sistema de manipulación celular para controlar los movimientos espaciales de la sonda única y colocar el emisor nano ESI de forma centralizada delante del tubo de transferencia de iones extendidos. Pipetear las células del matraz de cultivo celular en un tubo centrífugo de 15 mililitros.

Gire las células a 400 veces G en 37 grados Celsius durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Resuspender las células en cuatro mililitros de medio RPMI que contiene el compuesto del fármaco en la concentración de tratamiento deseada. Personalice los parámetros experimentales para el espectrómetro de masas.

En el encabezado del modo de escaneo del software del instrumento, seleccione definir análisis. Utilice una resolución de 60.000 A M sobre Z 400, un microescaneo de 100 milisegundos de tiempo máximo de inyección y un control automático de ganancia. En la bomba de jeringa, seleccione el caudal de 150 nanolitros por minuto.

Seleccione la fuente NSI y aplique una tensión de aproximadamente 4,5 kilovoltas. Encienda el microscopio invertido a 40 veces el aumento seleccionado tanto para la placa superior como para la lente inferior. Conéctelo al puerto USB de un portátil para capturar transmisiones de vídeo en directo.

Encienda la placa calentada y establézcala en 37 grados Centígrados. En el equipo, vaya a la pestaña Adquirir datos y seleccione continuamente el tiempo adquirido. Para preparar la muestra para el análisis, pipetee de dos a tres de la muestra en la tapa de un pequeño plato de petri.

Coloque la muestra en el centro de la luz del microscopio invertido en la parte superior de la placa calentada. Prepare la sonda de selección de células de vidrio para su análisis. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la sonda de modo que su parte superior se centre bajo el microcsope invertido en el mismo plano que las celdas.

Utilice el sistema de manipulación de celdas para mover la punta de la sonda de selección de celdas a una celda de destino para su análisis. Este proceso se supervisa mediante el microscopio invertido. Gire suavemente el mango del microinyector para ajustar la posición del aceite mineral dentro del tubo.

El microinyector proporciona una succión suave para asegurar la célula objetivo a la punta de la sonda de selección de células. Utilice el sistema de manipulación celular para mover la celda en la punta de la sonda de selección de celdas a la punta de una sola sonda utilizando un microscopio digital centrado en la punta de una sola sonda para monitorear este proceso. Las células K-562 no tratadas se utilizan para establecer el método experimental.

En un experimento típico de SCMS, se pueden observar cambios obvios de espectros de masa a partir de la transferencia de una célula durante la detección del contenido celular y después de terminar la medición. Tres picos de lípidos celulares comunes incluyendo PC 34:4, PC 36:4, y PC 38:5 se monitorean para asegurarse de que la célula se transfiere con éxito y se detecta contenido celular. La identidad de muchos PC en el rango de masa de 750 a 850 se confirma utilizando MSMS en muestras de lito celular no tratada.

Utilizando la configuración de MS de sonda única ICMP, Gemcitabine, Taxol y OSW1 se detectaron después de la incubación con células K-562. Estos resultados sugieren que este método se puede utilizar para estudiar lípidos intracelulares, fármacos y metabolitos a nivel de células únicas a partir de las células en solución en un entorno casi nativo. Recuerde colocar de forma segura la sonda de selección de celda de vidrio en el soporte universal de la pipeta para que la succión se pueda aplicar adecuadamente.

Este método también se puede aplicar a muestras derivadas del paciente para distinguir las diferencias entre los metabolitos celulares de una variedad de tipos celulares, lo que nos permite obtener una mejor comprensión de estos estados de la enfermedad. Después de desarrollar este método, potencialmente podríamos implementar la cuantificación de compuestos farmacológicos a nivel de célula única. Cuando se trabaja con células, es importante tener un equipo de protección personal adecuado, incluyendo bata de laboratorio y guantes.

Se puede usar un desgaste ocular adicional cuando se trabaja con vidrio.