Preparación y caracterización de nanoliposomas para el atrapamiento de proteínas globulares hidrofílicas bioactivas

La preparación de nanocápsulas liposómicas mediante una técnica de extrusión se realizará paso a paso en el atrapamiento de tarin 48 kilodaltons globulares en proteína hidrófila purificada de colocasia esculenta se demostrará. Todos los procedimientos para la caracterización de las nanocápsulas incluyen la microscopía electrónica de barrido y también se seguirá la dispersión dinámica de la luz. Los procedimientos de capsulación pueden enfrentar algunos desafíos desde la elección de lípidos hasta el logro de la encapsulación de alta eficiencia, manteniendo la actividad biológica de las moléculas atrapadas.

El protocolo que se describirá puede superar algunas de estas dificultades. Pesar los componentes liposomas utilizando un equilibrio analítico. Disolver los componentes lipídicos en cloroformo utilizando un matraz volumétrico que cabe en un evaporador rotatorio para evitar la pérdida de material.

Revuelva la mezcla a 150 RPM durante 15 minutos. Retire el cloroformo con un evaporador rotatorio. Ajuste la boca volumétrica del matraz a la posición estándar para obtener la mejor eficiencia, mientras está en contacto con el agua del baño de calefacción.

Establezca los parámetros según el protocolo descrito. Después de unos 25 minutos, retire el matraz y deseche el disolvente evaporado adecuadamente. Se forma una película delgada y opaca que se puede visualizar fácilmente.

Hidratar la película de lípidos en una solución de sulfato de amonio que contenga tarin a un miligramo por mililitro. Revuelva la mezcla durante 40 minutos e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego, sonicar la suspensión durante un minuto a 25 grados Celsius, temperatura ambiente.

Para reducir el tamaño de la vesícula y evitar la agregación, coloque la membrana de policarbonato entre dos soportes de filtro pre-húmedos y colóquelo en el soporte. Inserte una jeringa vacía en el dispositivo, llene la otra con un mililitro de la suspensión liposomal e insértela en el lado opuesto. Realice una extrusión de 12 ciclos a través de una membrana de poro de policarbonato de 2 micrómetros.

Empuje lentamente la muestra de una jeringa a otra. Al final, la suspensión liposomal debe ser clara durante el proceso de excursión, como resultado de la reducción de tamaño. Alrededor de 2 mililitros de la muestra se pueden perder durante este paso.

Separe los liposomas por ultracentrifugación. Primero, pesa la muestra en el tubo de titanio y equilibra los tubos. Compruebe el volumen mínimo a llenar y, si es necesario, ajuste el volumen con sulfato de amonio.

Coloque los tubos de titanio en el cubo basculante. Abra la puerta centrífuga y coloque el rotor dentro. Cierre la puerta de la centrífuga, presione el vacío y espere hasta que el vacío alcance de 200 a menos de 20 micras.

Ajuste los parámetros en la pantalla de ultracentrífuga. Pulse recall, compruebe las condiciones e inicie la ejecución. Después de 90 minutos, suelte el vacío haciendo clic en el botón de vacío y abra la puerta de la centrífuga.

Retire el rotor del interior. Mantener la muestra de ultracentrífuga sobre hielo y luego separar el sobrenadante del pellet, girando el tubo boca abajo, en una centrífuga desechable de 59 mil para separar el sobrenadante del pellet. Almacene el sobrenadante que contiene la proteína no encapsulada a cuatro grados centígrados.

Esto se utilizará para determinar la eficiencia de encapsulación. El pellet se presenta como una jalea translúcida. Suspenda el pellet y caliente la solución salina tamponada HEPES.

Consulte el protocolo para obtener más información. Determinar la eficiencia de encapsulación por el protocolo de Peterson, con el fin de evitar interferencias lipídicas en la cuantificación de proteínas. Las muestras deben analizarse por triplicado.

En un tubo de microfugo, diluir el sobrenadante lipsomal o BSA a un miligramo por mililitro con agua hasta un volumen final de un mililitro. Añadir DOC e incubar durante 10 minutos. Añadir 1 mililitro de 72%TCA y mezclar bien.

Centrifugar a 3.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante evitando el tubo hacia abajo, poniéndolo sobre un papel absorbente y dejándolo secar. Suspenda el pellet en un mililitro de agua.

Mezclar bien para asegurarse de que el pellet está disuelto. A continuación, transfiera la muestra a los tubos de ensayo. Añadir un mililitro de reactivo A, mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Añadir 5 mililitros de reactivo B, mezclar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Determine la absorbancia a 750 nanómetros y calcule la eficiencia de encapsulación. El promedio de tamaño y la distribución del tamaño están determinados por la dispersión de luz dinámica.

Transfiera las nanovesículas liposómicas a una cubeta de tamaño desechable. Coloque la cubeta dentro del equipo. Establezca los parámetros del equipo.

Para la determinación de la estabilidad, almacene los liposomas en cuatro grados Celsius y compruebe la distribución del tamaño y el tamaño promedio regularmente. La caracterización de liposomas mediante microscopio electrónico de barrido se realiza de acuerdo con Murta y Ramasami en triplicado. Fije los resbalones de la cubierta de vidrio en la parte inferior de un plato de Petri con una cinta adhesiva.

Recubrir los resbalones de la cubierta con poli-L-lisina. Coloque un papel de filtro húmedo dentro de la placa Petri para mantener la humedad e incubar durante una hora. Enjuagar con agua destilada.

Agregue una gota de la muestra y deje que se seque durante una hora, a temperatura ambiente. Para fijar las muestras, cúbralas con glutaraldehído, preparado en tampón de fosfato. Coloque los papeles de filtro húmedos dentro de la placa Petri.

Es importante sellar el plato Petri. Incubar a cuatro grados centígrados durante 48 horas. Enjuague los resbalones de la cubierta tres veces durante cinco minutos cada uno, con el mismo tampón de fosfato.

Deshidrate las muestras de la siguiente manera lavando en una solución de concentración de etanol creciente del 35% al etanol absoluto. Seque químicamente las muestras con hexametildisilazane durante 10 minutos. El hexamethyldisilazane debe ser cuidadosamente manipulado dentro de una campana de humo.

Se debe permitir que las muestras se sequen durante la noche dentro de un desecador o dentro de la campana del humo a temperatura ambiente. Monte las muestras secas en un talón, con una cinta adhesiva conductora de carbono. Sputter los talones con oro.

Grabe imágenes SEM con un microscopio electrónico de barrido, SEM, en modo de vacío bajo y baja tensión, 20 kilovoltas. La figura uno describe la preparación de nano liposomas. Los fosfolípidos, la droga, la clavija y los químicos, los principales componentes liposomas, se disolvieron primero en cloroformo para obtener la película lipídica.

La película lipídica se rehidrató entonces en un tampón salino, que contenía la proteína hidrófila, tarin, que se entraba, y la incubación debía preformarse durante la noche. A continuación, se aplica sonicación y extrusión para generar pequeñas vesículas no pilales. El paso de ultracentrifugación separa la preparación liposomal de los lípidos libres y la proteína no encapsulada.

Mientras que el sobrenadante se utiliza para la determinación de la eficiencia de atrapamiento. Los nanoliposomas producidos utilizando la metodología antes mencionada exhiben una distribución de tamaño que oscila entre 51 y 396 nanómetros, y un tamaño promedio de 155 nanómetros. La preparación es homogénea, ya que el índice de polidispersidad es de 168.

Se alcanza una alta eficiencia de atrapamiento del 83% si los liposomas se extruyen a través de una membrana de 2 micrómetros tamaño de poro. Las características nanoliposomas morfológicas se evaluaron mediante microscopía electrónica de barrido. Los liposomas deben tratarse finalmente de manera similar a las células vivas, para obtener imágenes de mejor calidad.

Los procedimientos de fijación y secado son importantes para garantizar la visualización de vesículas intactas más pequeñas que soportan más de 20 kilovoltas en condiciones de vacío. Las figuras 2A y 2B muestran vesículas liposómicas de forma redonda en el rango de 121 nanómetros, analizadas a 20 kilovoltas. Mientras que las figuras 2C y 2D, muestran muestras mal preparadas.

Las muestras maltratadas solo se permiten para la observación de vesículas más grandes o dañadas, que no pueden resistir las condiciones de vacío o tensión. El protocolo descrito, aquí en, permitió la producción de vesículas reproducibles que muestran una forma redonda, una superficie pequeña y un tamaño promedio de aproximadamente 150 nanómetros. El método se puede utilizar para atrapar moléculas complejas y grandes, como una proteína tetérica, exhibiendo un corrector hidrófilo.

La auto atrapamiento deficiente es superior al 80% y la tasa de fugas es muy baja, inferior al 1,5% cuando las nanocápsulas se almacenan en cuatro grados Celsius. Esperamos que este video le ayude en la encapsulación de moléculas grandes, como teri.