Name: Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a realizar inmunohistoquímica fluorescente multiplex manual para identificar múltiples tipos celulares en tejido fijado en formol y embebido en parafina. Optimiza anticuerpos y evita errores comunes en el análisis del microambiente tumoral.

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Los autores quieren agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por su ayuda con la configuración y optimización de la tinción multiplex original. Los autores también quieren agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por consejos de uso del software de análisis. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Cáncer bajo el Premio Número P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El apoyo adicional fue proporcionado por Jeffery A. Colby Colon Cancer y Tom Liu Memorial Research Funds.

Todo el trabajo ha sido aprobado por la junta de revisión interna de la Universidad de Michigan.
1. Optimización de anticuerpos primarios y preparación de diapositivas
<ol><li>Determinar la concentración ideal de anticuerpos para multiplex utilizando IHC convencional.<ol>
<li>Pruebe los anticuerpos para el multiplex mediante inmunohistoquímica convencional manual (IHC)13.</li>
<li>Utilice tejidos específicos que tengan un tipo de célula abundante para cada anticuerpo analizado, como el uso de tejido de amígdala para pruebas de anticuerpos CD3.</li>
<li>Utilice la concentración de referencia para IHC recomendada por la empresa y luego complete el IHC con concentraciones de anticuerpos a las concentraciones recomendadas, así como las concentraciones superiores y inferiores a la concentración recomendada.</li>
</ol>
</li>
<li>Prepare el tejido incrustado de parafina fija de formalina en las diapositivas.<ol>
<li>Usando un microtome, corte bloques de tejido FFPE a un espesor de entre 4 y 6 m y aplíquelos a las diapositivas cargadas. NOTA: El uso de agua destilada garantiza un montaje y adherencia adecuados del tejido en todo el multiplex.</li>
<li>Coloque las diapositivas planas, el lado del tejido hacia arriba y deje secar a 37 oC durante la noche.</li>
<li>Guarde las diapositivas en una caja deslizante lejos de las temperaturas extremas hasta que estén listas para completar el multiplex.</li>
</ol>
</li>
</ol>2. Método general de tinción
<ol><li>Preparación de soluciones de lavado y recuperación de antígenos<ol>
<li>Preparar la solución de lavado de 0,1% TBST mezclando 9 L de agua desionizada, 1 L de solución salina tamponada (TBS) y 10 ml de polisorbato 20.</li>
<li>Preparar ambas soluciones de recuperación de antígenos (pH 6 y pH 9; Tabla de Materiales) diluyendo a 1x con agua desionizada.</li>
</ol></li>
<li>Desparafinación y rehidratación<ol>
<li>Hornee los portaobjetos, acostados, el lado del tejido hacia arriba a 60 oC durante 1 h en un horno de hibridación1. Retire los portaobjetos del horno y deje enfriar durante al menos 5 x 10 minutos y luego colóquelos en un portaobjetos vertical.</li>
<li>Tratar las diapositivas en las siguientes soluciones secuencialmente: xileno en triplicado, seguido de un único tratamiento de 100% etanol, 95% etanol, y por último 70% etanol para 10 min cada uno utilizando un conjunto de tinción de diapositivas1.</li>
<li>Lavar el bastidor de los portaobjetos durante 2 minutos con agua desionizada por inmersión en una caja de plástico, seguido de fijación por inmersión en una caja de plástico rellena de formalina tamponada neutra durante 30 min13. Lavar los portaobjetos en agua desionizada durante 2 minutos y luego proceder a la recuperación de antígenos.</li>
</ol></li>
<li>Recuperación de antígenos<ol>
<li>Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena a la línea interna (aproximadamente 300 ml) con tampón de recuperación de antígeno pH 6 o pH 9. NOTA: El tampón de recuperación de antígenos puede ser pH 6 o pH 9, que puede necesitar ser optimizado por epítopo. Sin embargo, comience por usar pH 9 para anticuerpos que se unen a epítopos nucleares y pH 6 para todos los demás anticuerpos.</li>
<li>Cubra la caja con una envoltura de plástico y use una banda de goma para asegurarla. Coloque la caja en el microondas en el borde de la placa giratoria (microondas debe estar equipado con tecnología de inversor para calefacción uniforme). Calentar los portaobjetos durante 45 s al 100% de potencia seguido de 15 min a 20% de potencia13. NOTA: El tratamiento de microondas puede necesitar optimización dependiendo del microondas utilizado.</li>
<li>Deje que las diapositivas se enfríen durante aproximadamente 15 x 20 minutos.</li>
</ol></li>
<li>Prepare soluciones de trabajo de anticuerpos y fluoróforos mientras se enfrían los portaobjetos.<ol>
<li>Preparar el diluyente de anticuerpos primarios disolviendo 0,5 g de gránulos de albúmina sérica bovina en 50 ml de TBST. Alternativamente, utilice 50 ml de 1x solución salina tamponada de fosfato (PBS) para disolver gránulos.</li>
<li>Realizar cada solución de trabajo de anticuerpos primarios a la concentración optimizada determinada en la sección 1, en el diluyente de anticuerpos primarios. Estimar aproximadamente 200 l por diapositiva.</li>
<li>Preparar la solución de trabajo de fluoróforo diluyendo cada fluoróforo en el diluyente de fluoróforo a una concentración de 1:100. NOTA: Esto puede necesitar ser optimizado dependiendo del anticuerpo. Estimar aproximadamente 100 l por diapositiva.</li>
<li>En el último día de tinción, prepare la solución de trabajo de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) añadiendo 3 gotas de DAPI en 1 ml de TBST.</li>
</ol></li>
<li>Tinción de diapositivas (lavado y bloqueo)<ol>
<li>Retire la caja del microondas después de enfriar y quite la envoltura de plástico, lave los portaobjetos con agua desionizada durante 2 minutos seguido de un lavado de 2 minutos en una caja de plástico llena de plástico TBST13.</li>
<li>Después de secar cada diapositiva alrededor del tejido con una delicada tarea limpiar con cuidado de no dejar que el tejido se seque, rastrear alrededor del exterior del tejido usando una pluma de barrera hidrófoba. No toque el tejido con la delicada toallita o pluma de la tarea.</li>
<li>Coloque cada diapositiva en la cámara humidificada y agregue la solución de bloqueo (aproximadamente 4 gotas) al tejido. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol></li>
<li>Tinción por diapositivas (aplicación de anticuerpos primarios)<ol>
<li>Tome cada diapositiva y retire la solución de bloqueo tocando el lado de la diapositiva en una pila de toallas de papel y usando una toallita de tarea delicada para eliminar el exceso de agente de bloqueo alrededor del tejido.</li>
<li>Vuelva a poner el portaobjetos en la cámara humidificada y añada aproximadamente 200 ml del anticuerpo primario de trabajo. Incubar en la cámara humidificada durante 1 h a RT.</li>
<li>Lavar con TBST durante 2 min por inmersión en triplicado13. NOTA: Después de cada paso de lavado, cambiar el TBST ayudará a garantizar una imagen más limpia.</li>
</ol></li>
<li>Tinción por deslizamiento (aplicación secundaria de anticuerpos)<ol>
<li>Elimina el TBST restante de cada diapositiva y aplica aproximadamente de 3 a 4 gotas de anticuerpo secundario (mezcla de anticuerpos conjugados secundarios de HRP de conejo y ratón). Incubar durante 10 min en la cámara humidificada aRT 13. NOTA: Si planea utilizar un anticuerpo primario que requiera un anticuerpo secundario que no sea ratón o conejo o elija utilizar un anticuerpo secundario alternativo, aplique el HRP conjugado secundario adecuado a las diapositivas e incubar en RT durante 45 minutos. tiempo de incubación puede ser necesario para la secundaria alternativa14.</li>
<li>Después de la incubación, lavar con TBST durante 2 min en triplicado13.</li>
</ol></li>
<li>Tinción por diapositivas (aplicación de fluoróforo)<ol>
<li>Aplicar aproximadamente 100 l de la solución de trabajo del fluoróforo e incubar en la cámara humidificada a RT durante 10 min13.</li>
<li>Lavar con TBST durante 2 min en triplicado13.</li>
</ol></li>
<li>Eliminación de anticuerpos<ol>
<li>Toboganes de microondas (45 s al 100% y 15 min a 20%) en la caja resistente al calor (ver paso 2.3.2) para la eliminación de anticuerpos13,14. NOTA: Esto completa una ronda del multiplex. Este es el único punto en el que se puede pausar el protocolo. Para pausar el protocolo, deje las diapositivas sumergidas en el búfer de recuperación de antígenos durante la noche a temperatura ambiente.</li>
</ol></li>
<li>Continúe rondas adicionales de tinción. Repita los pasos 2.5.1-2.9.1 para el resto de los pares de anticuerpos-fluoróforos. Una vez utilizados todos los anticuerpos y fluoróforos, proceda a la sección 2.11.</li>
<li>Aplicación y montaje DAPI<ol>
<li>Después de la última ronda de tinción en el multiplex, retire la última aplicación de anticuerpos con solución de recuperación de antígenos pH 613. Lavar con agua desionizada seguido de TBST durante 2 min cada13.</li>
<li>Aplicar aproximadamente 150 l de la solución DAPI en funcionamiento a los portaobjetos e incubar en la cámara humidificada durante 10 min a RT1.</li>
<li>Lavar con TBST durante aproximadamente 30 s y montar los cubreobjetos con un soporte antidescolor. Aplique esmalte de uñas transparente en las cuatro esquinas del cubreobjetos una vez que el soporte de montaje se haya secado para asegurar el cubreobjetos (opcional).</li>
</ol></li>
</ol>3. Detalles de biblioteca, monoplexes y multiplex
<ol><li>Elija diapositivas para crear una biblioteca de fluoróforos.<ol>
<li>Para un multiplex de 7 colores, recopile 7 diapositivas de tejido rico en células inmunitarias (es decir, amígdalas, bazo, etc.) para la biblioteca. NOTA: Elija las diapositivas de control que se utilizarán para una biblioteca de fluoróforos con cada diapositiva que represente cada fluoróforo único que se utilizará en el multiplex. Las diapositivas de control deben tener un epítopo abundante de elección y pueden ser el mismo tipo de tejido para cada fluoróforo.</li>
</ol></li>
<li>Diapositivas de la biblioteca de imágenes y manchas para su uso con monoplexes y multiplexores.<ol>
<li>Siga los pasos 2.1 a 2.9.1 utilizando las diapositivas de control y las diapositivas de tejido de control de su elección. Coloque un fluoróforo diferente en cada diapositiva a una concentración de 1:100; una diapositiva debe contener sólo DAPI.</li>
<li>Continúe con la sección 2.11 excepto omitir la tinción DAPI y, en su lugar, utilice TBST y monte como se describe.</li>
<li>Después de dejar que las diapositivas se sequen durante la noche, la imagen con todos los canales DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, puntos cuánticos semiconductores y isotiocianato de fluoresceína (FITC) estableciendo la exposición a 250 ms con la función de protección de saturación1. NOTA: Los tiempos de exposición se pueden ajustar a 50 a 250 ms13.</li>
<li>Cargue las imágenes de la biblioteca en el software y utilíquelas en el análisis de los monoplexes y multiplex.</li>
</ol></li>
<li>Elija diapositivas para monoplexes.<ol>
<li>Elija diapositivas de control que tengan un abundante epítopo de elección basado en anticuerpos optimizados (sección 1). Para cada ronda de tinción que se realice en el multiplex, seleccione ese número de diapositivas de control para crear monoplexes. NOTA: El propósito del monoplex es determinar la mejor posición (orden) para cada anticuerpo que se utilizará en el multiplex.</li>
</ol></li>
<li>Monoplexes de manchas.<ol>
<li>Siga las secciones 2.1-2.11 utilizando el anticuerpo primario en un orden diferente (posición) para cada una de las diapositivas. Cada diapositiva debe tener un solo anticuerpo primario aplicado en un orden (posición) diferente de las otras diapositivas. NOTA: Para cada diapositiva en la que la ronda no solicite ningún anticuerpo primario o fluoróforo, utilice en su lugar diluyente de anticuerpos primarios y diluyente de fluoróforo13.</li>
</ol></li>
<li>Diapositivas de imagen y analizar el monoplex.<ol>
<li>Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales capturacadacada cada imagen utilizando DAPI para enfocar. NOTA: Los tiempos de exposición se pueden ajustar a 50 a 250 ms14.</li>
<li>Usando el software de análisis evaluar cada diapositiva monoplex mirando la intensidad fluorescente del marcador manchado.</li>
<li>Compare esta intensidad con el fondo. Si es al menos 5 a 10 veces mayor que el fondo, la posición de esa diapositiva es una posición óptima para usar en el multiplex final.</li>
</ol></li>
<li>Elija diapositivas para el multiplex.<ol>
<li>Elija las diapositivas de interés y agregue una diapositiva adicional que se utilizará como diapositiva en blanco para la resta de autofluorescencia después de la tinción y la creación de imágenes.</li>
</ol></li>
<li>Mancha el multiplex.<ol>
<li>Sobre la base de los resultados monoplex, elija el orden apropiado (posiciones) para cada anticuerpo basado en el paso 3.5.3. Asigne cada fluoróforo a un anticuerpo. NOTA: Esto puede necesitar optimización; sin embargo, el plan de utilizar anticuerpos brillantes para marcadores menos abundantes1, los anticuerpos colocalizadores deben combinarse con fluoróforos en espectros lejanos entresí 13,y los fluoróforos con el espectro 540 y 570 no deben ser colocalizados debido a a los problemas de superposición espectral1.</li>
<li>Continúe con las secciones 2.1 a 2.11 asegurando que la diapositiva en blanco no reciba anticuerpos primarios, fluoroforós o DAPI, en su lugar use diluyente de anticuerpos, diluyente de fluorofótesis y TBST respectivamente en su lugar.</li>
</ol></li>
<li>Multiplexdez de imagen y análisis de la integridad de la tinción<ol>
<li>Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales, capture cada imagen utilizando DAPI para enfocar.</li>
<li>Utilizando el software de análisis (Tablade materiales),evalúe cada multiplex por color falso fluorescente. NOTA: Una imagen clara debe demostrar cada marcador claramente. Si un marcador se ve difuso y granulado o es inexistente, es probable que el marcador no funcionara y necesite volver a optimizarse.</li>
<li>Usando el software de análisis, evalúe cada multiplex por vista patológico. La vista patopatos confirmará la especificidad de cada marcador. Comparar con IHC previamente optimizado (sección 1).</li>
</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las muestras de tejido intactas de la biopsia de tumores sólidos y la resección quirúrgica siguen siendo importantes herramientas diagnósticas y predictivas para el análisis de la enfermedad, así como el pronóstico del paciente. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) es una técnica novedosa que combina los beneficios de la inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF) y la citometría de flujo. Los métodos anteriores para sondear las células in situ hanpermitido la evaluación ...

La visualización de un microambiente tumoral intacto (TME) es esencial para evaluar no sólo la infiltración celular en neoplasias malignas sólidas, sino también las interacciones de células a células. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) ha surgido como una herramienta eficaz para el fenotipado multiantígeno de células en el estudio del cáncer y las enfermedades asociadas1,2,3,4, 5,6,7. Esto, en combinación con nuevos programas y software diseñados para analizargrandes conjuntos de datos, permite la observación de interacciones complejas entre las células 1,2,4. El factor limitante de la velocidad en la adquisición de datos es a menudo la calidad del tejido manchado antes del análisis.
Las técnicas anteriores utilizadas para las células fenotipo en el TME incluyen inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo, todas las cuales presentan limitaciones significativas. IHC utiliza secciones de tejido de parafina fija incrustada de formalina (FFPE) que se deparan y rehidratan antes de ser manchadas por la mayoría de las veces un anticuerpo. El uso de un anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante(HRP) y una reacción química permite la visualización de un solo epítopo antigénico 8. Mientras que IHC es confiable y se realiza en el tejido FFPE que es fácil de trabajar con, limitaciones al espectro de luz visible significa que sólo uno o dos marcadores pueden ser confiables distinguidos y la colocación de antígenos bastante difícil8. Una forma de ampliar los marcadores disponibles y, por lo tanto, los antígenos que se pueden sondear en una sola sección es cambiar a fluorescencia que permite el uso de una gama más amplia del espectro visual. Para IF, el tejido congelado o FFPE se transfiere a diapositivas y anticuerpos utilizados que se conjugan a varios fluoróforos. Si bien esto aumenta el número de antígenos que se pueden sondear, hay varias limitaciones importantes. En primer lugar, debido a que cada anticuerpo normalmente sólo tiene un fluoróforo unido, el brillo a menudo no es lo suficientemente fuerte como para superar la autofluorescencia tisular. Es por esta razón, la mayoría de IF se realiza en tejido congelado que es caro de almacenar y difícil de trabajar con. Un número limitado de etiquetas fluorescentes están disponibles para su uso debido a la superposición espectral y la reactividad de las especies cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos no conjugados. La citometría de flujo, que consiste en el procesamiento de tejido fresco en una suspensión de una solacélula y el etiquetado con anticuerpos fluorescentes ha sido el estándar de oro para el inmunofenotipado durante décadas 9,10. Un beneficio de la citometría de flujo es la capacidad de etiquetar múltiples anticuerpos sin preocupación por la reactividad cruzada de las especies, ya que la mayoría se conjugan. Debido a que las células son "visualizadas" por una máquina y no los ojos humanos, hay muchos más fluoróforos disponibles, pero esto tiene un costo. La compensación debe hacerse manualmente, lo que puede alterar significativamente los resultados produciendo poblaciones falsas positivas y negativas. La limitación más significativa de la citometría de flujo es que la arquitectura tisular y posteriormente toda la información espacial se pierde por la necesidad de la suspensión de células individuales.
La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) utilizando un microscopio fluorescente automatizado en combinación con un software novedoso combina los beneficios de IHC, IF y la citometría de flujo al permitir la tinción de tejido multiantígeno con amplificación de señal y retención de relaciones espaciales sin necesidad de compensación. El tejido FFPE se coloca en diapositivas cargadas que, después de la recuperación del antígeno, se someten a una ronda de aplicación de anticuerpos primarios al antígeno objetivo de interés seguido de un anticuerpo secundario con una etiqueta química HRP, similar a IHC. Después de la colocación del anticuerpo secundario, una reacción específica de HRP da como resultado una unión covalente de fluoróforo al epítopo de interés11. Una vez que el tejido está etiquetado, se completa otra ronda de calentamiento de las diapositivas eliminando el complejo de anticuerpos primarios y secundarios previamente aplicados dejando sólo la etiqueta fluorescente unida al epítopo de tejido11. Esto permite que múltiples anticuerpos de cualquier especie sean reaplicados sin preocupación por la reactividad cruzada11,12. Para minimizar cualquier necesidad de compensación manual de múltiples colorantes fluorescentes, se utiliza una colección de fluoróforos con poca superposición espectral, incluida una mancha de contador nuclear, para completar el mfIHC. Para tener en cuenta la autofluorescencia encontrada con el tejido FFPE, el software resta la autofluorescencia de la imagen final utilizando una imagen de una diapositiva en blanco que es posible debido a la fuerza de fluorescencia específica de antígeno después del fluoróforo amplificación de la señal. Utilizando programas novedosos diseñados para grandes conjuntos de datos, las ubicaciones de celdas se pueden identificar y analizar para el contexto espacial1,2,4. La limitación más significativa de esta técnica es el tiempo de optimización. Una metodología detallada con instrucciones para el diseño experimental y la estrategia de tinción e imagen se encuentra aquí. mfIHC será útil para laboratorios que actualmente no tienen un sistema de tinción automatizado optimizado que le gustaría entender mejor el contexto espacial de las interacciones de célula a célula en el tejido FFPE intacto utilizando la técnica manual.

<table><tbody><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher</td><td>HC8001GAL</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td>HC10001GL</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Fisher</td><td>HC11001GL</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>Akoya Biosciences</td><td></td><td>CLS135783 inForm versión 2.3.0</td></tr><tr><td>Montaje antidecoloración</td><td>ThermoFisher</td><td>P36961</td><td>ProLong Solución</td></tr> de <tr><td>bloqueo de diamante</td><td>Vector</td><td>SP-6000</td><td>Bloxall</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Toallita para tareas delicadas</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente fluorescente</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARD1A01EA</td><td>Ópalo Diluyente TSA</td></tr><tr><td>Fluoróforo 520</td><td>Akoya Biociencias</td><td>FP1487001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoróforo 540</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1494001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoróforo 570</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1488001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoróforo 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1495001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoróforo 650</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1496001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoróforo 690</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoróforo DAPI</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1490</td><td>3 gotas en TBST o PBS</td></tr><tr><td>Caja resistente al calor</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-904</td><td>Caja portaobjetos de plástico-verde</td></tr><tr><td>Cámara humidificada</td><td>Ibi Scientific</td><td>AT-12</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>FisherBiotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de barrera hidrofóbica</td><td>Microscopio Vector</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge</td></tr><tr><td></td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS140089</td><td>Mantra estación de trabajo de patología cuantitativa</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Panasonic</td><td>NN-A661S</td><td>con tecnología inverter</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>10% formalina tamponada neutra</td></tr><tr><td>Tampón de recuperación de antígenos pH 6</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR600</td><td>AR6</td></tr><tr><td>Tampón de recuperación de antígenos pH 9</td><td>Akoya Biosciences</td><td>AR900</td><td>AR9</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Caja portaobjetos de plástico</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-906</td><td></td></tr><tr><td>Envoltura de plástico</td><td>Fisher</td><td>NC9070936</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-800</td><td>Tween 20</td></tr><tr><td>Primario anticuerpo CD163</td><td>Lecia</td><td>NCL-LCD163</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario CD3</td><td>Dako</td><td>A0452</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario CD8</td><td>Spring Bio</td><td>M5390</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario FOXP3</td><td>Dako</td><td>M3515</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario pancitoqueratina</td><td>Cell Signaling</td><td>12653</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario PD-L1</td><td>Cell Señalización</td><td>13684</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Akoya Biosciences</td><td>ARH1001EA</td><td>Polímero de ópalo</td></tr><tr><td>Juego de tinción de portaobjetos</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>6254001</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada Tris</td><td>Corning</td><td>46-012-CM</td><td>TBS</td></tr><tr><td>Gradilla de portaobjetos vertical</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>X3P1GAL</tr></tbody></table>

optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

La evaluación del microambiente del tejido intacto para el análisis de la infiltración celular y la organización espacial son esenciales para comprender la complejidad de los procesos de la enfermedad. Las técnicas principales utilizadas en el pasado incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) que permiten la visualización de las células como una instantánea en el tiempo utilizando entre 1 y 4 marcadores. Ambas técnicas tienen deficiencias, incluida la dificultad para manchar objetivos malgénicos y limitaciones relacionadas con la reactividad entre especies. IHC es confiable y reproducible, pero la naturaleza de la química y la dependencia del espectro de luz visible permite utilizar sólo unos pocos marcadores y hace que la colocalización sea un reto. El uso de IF amplía los marcadores potenciales, pero normalmente se basa en el tejido congelado debido a la extensa autofluorescencia del tejido después de la fijación de formalina. La citometría de flujo, una técnica que permite el etiquetado simultáneo de múltiples epítopos, deroga muchas de las deficiencias de IF e IHC, sin embargo, la necesidad de examinar las células como una suspensión de una sola célula pierde el contexto espacial de las células que descartan Relaciones. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puentes de estas tecnologías que permiten el fenotipado celular multiepitope en tejido de parafina fija inhacina (FFPE) de formalina, preservando al mismo tiempo la arquitectura general del microambiente y el espacio relación de las células dentro del tejido intacto no interrumpido. Los fluoróforos de alta intensidad fluorescente que se unen covalentemente al epítopo tisular permiten múltiples aplicaciones de anticuerpos primarios sin preocuparse de la reactividad cruzada específica de la especie por anticuerpos secundarios. Aunque se ha demostrado que esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de enfermedades, el proceso de creación de una estrategia de tinción mfIHC útil puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la amplia optimización y diseño. Con el fin de hacer imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para mitigar el período de optimización para el análisis manual, presentados aquí son métodos para la preparación de diapositivas, optimización de anticuerpos, diseño multiplex, así como errores, así como errores comúnmente durante el proceso de tinción.

El proceso general de obtención de un ensayo multiplex de 7 colores sigue un patrón repetitivo. La Figura 1 describe el proceso en forma diagramamática. Una vez que los portaobjetos se cortan y secan o se reciben del laboratorio y se hornean en un horno de hibridación a 60 oC durante 1 h, luego proceder a la desfinación y rehidratación, fijar los portaobjetos en formalina de nuevo seguido de recuperación de antígeno. Cada ronda de multiplexación comienza en la recuperación del antígeno y ter...

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

La inmunohistoquímica fluorescente múltiple identifica múltiples tipos de células y sus ubicaciones en tejido integrado de parafina fijada en formalina, lo que permite no sólo la identificación celular, sino también el análisis espacial de célula a célula. La principal ventaja de esta técnica manual es el uso de múltiples anticuerpos de la misma especie sin reactividad cruzada. Esta técnica permite una visión en profundidad de las interacciones de las células inmunes y cancerosas en el microambiente tumoral.Al probar esta técnica por primera vez, permita aproximadamente tres a cuatro días de tinción y realice un seguimiento de cada paso completamente durante el proceso. Un método más débil del proceso de tinción y el diseño multiplex es fundamental para disminuir los escollos comunes y esperados. Comience desparafinando y rehidratando las diapositivas.Colóquelos en el horno de hibridación con el lado del tejido hacia arriba y hornéelos a 60 grados Centígrados durante una hora. Saque las diapositivas del horno y déjelas enfriar durante cinco a 10 minutos en un portaobjetos vertical. A continuación, utilice un conjunto de tinción deslizante para tratar las diapositivas tres veces con xileno y una vez con 100%etanol, 95% etanol y 70% etanol durante 10 minutos cada uno.Lave el estante de los portaobjetos con agua desionizada y luego fije las diapositivas sumergiéndolas en formalina tamponada neutra durante 30 minutos. Lave los toboganes con agua durante dos minutos y proceda con la recuperación de antígenos. Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena de pH 6.0 o pH 9.0 antigen buffer.Cubra la caja con una envoltura de plástico y fíjela con una banda de goma. Coloque la caja en un microondas equipado con inversor en el borde de la placa giratoria y caliente los portaobjetos durante 45 segundos a una potencia del 100%, seguido de 15 minutos a una potencia del 20%. Deje que las diapositivas se enfríen durante 15 a 20 minutos después de la microwaving.Mientras tanto, preparar soluciones de trabajo de anticuerpos y fluoróforos. Preparar el diluyente de anticuerpos primario disolviendo 0,5 gramos de gránulos de albúmina sérica bovina en 50 mililitros de TBST o 1X PBS. Diluir cada solución de trabajo de anticuerpos primarios a una concentración optimizada previamente determinada.Diluir cada fluoróforo en el diluyente de fluoróforo a una concentración de uno a 100. En el último día de tinción, prepare la solución de trabajo DAPI agregando tres gotas de DAPI a un mililitro de TBST. Una vez que los portaobjetos se enfríen, retírelos del microondas y quítelos de la envoltura de plástico.Lávelos con agua desionizada durante dos minutos seguido de un lavado de dos minutos con TBST. Después del lavado, seque el portaobjetos alrededor del tejido con una delicada limpieza de la tarea y trace alrededor del exterior del tejido con una pluma de barrera hidrófoba, teniendo cuidado de no tocar el tejido o dejar que se seque. Coloque cada diapositiva en la cámara del humidificador y agregue aproximadamente cuatro gotas de solución de bloqueo al tejido.A continuación, incubar los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente y proceder con la aplicación primaria de anticuerpos. Retire la solución de bloqueo de cada diapositiva tocando el lado de la diapositiva en una pila de toallas de papel y utilice una delicada toallita de tarea para eliminar la solución restante. Coloque el portaobjetos de nuevo en la cámara humidificada, agregue aproximadamente 200 microlitros del anticuerpo primario de trabajo e incubar durante una hora.Después de la incubación, lave los portaobjetos tres veces sumergiéndolos en TBST durante dos minutos por lavado. Apague el TBST restante de cada diapositiva y aplique aproximadamente de tres a cuatro gotas de anticuerpo secundario. Incubar los portaobjetos en la cámara humidificada durante 10 minutos.Lave los portaobjetos de nuevo con TBST y aplique aproximadamente 100 microlitros de la solución de trabajo de fluoróforo. Vuelva a colocar los portaobjetos en la cámara humidificada e incubar durante 10 minutos. Repita el lavado TBST y luego microonda los portaobjetos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito para eliminar los anticuerpos.Una cosa importante a recordar durante este proceso de tinción de varios días es detenerse después del paso de microwaving y dejar las diapositivas en el tampón de recuperación de antígenos durante la noche, asegurando la integridad del tejido y las manchas. Retire la última aplicación de anticuerpos con la solución de recuperación de antígenos y lave los portaobjetos con agua desionizada seguida de TBST durante dos minutos por lavado. Repita los pasos de tinción para el resto de los pares de fluroforos de anticuerpos y, a continuación, proceda con la aplicación DAPI.Aplique aproximadamente 150 microlitros de solución DAPI de trabajo a cada tobogán e incubarlos en la cámara humidificada durante 10 minutos. Después de la incubación, lave los portaobjetos con TBST durante aproximadamente 30 segundos y monte los resbalones de la cubierta. Una vez que el medio de montaje se haya secado, aplique un esmalte de uñas transparente en las cuatro esquinas del resbalón de la cubierta para fijarlo.Para analizar el monoplex, imagine las diapositivas en el microscopio con una exposición de 250 milisegundos utilizando DAPI para enfocar. Evalúe cada diapositiva monoplex observando la intensidad de fluorescencia del marcador teñido y compare esta intensidad con el fondo. Utilice la posición de deslizamiento en el multiplexor final si la intensidad del marcador teñido es al menos cinco veces mayor que el fondo.Al manchar el multiplex, elija el orden adecuado para cada anticuerpo y asigne cada fluoróforo a un anticuerpo. Proceda con la tinción del multiplex como se describió anteriormente y prepare una diapositiva en blanco que reciba diluyente de anticuerpos, diluyente de fluoróforo y TBST en lugar de anticuerpo primario, fluoróforo o DAPI. Cuando esté listo para crear una imagen del multiplex en el microscopio, establezca la exposición en 250 milisegundos para todos los canales y capture cada imagen utilizando DAPI para enfocar.A continuación, utilice el software de análisis para evaluar cada multiplex por color fluorescente falso y por vista de patología, que confirmará la especificidad de cada marcador. Para asegurar el éxito del ensayo multiplex, se debe realizar un ensayo monoplex para determinar el orden de cada anticuerpo. Por ejemplo, cuando Foxp3 está en la tercera posición de la matriz, se demuestra la tinción y colocación específicas y robustas con CD3.Por el contrario, cuando Foxp3 está en la primera posición, se produce una tinción inespecífica de Foxp3. Las áreas de color rojo y granulado están presentes en la mayor parte del portaobjetos, y la intensidad fluorescente de estas áreas es baja. Otro paso importante en este ensayo es la contramancha DEPI, que es la base para la identificación celular y el análisis posterior.Se puede ver un contraste claro entre las imágenes con DAPI que trabajan y no funcionan. Para el ensayo multiplex, las hermosas imágenes compuestas no siempre reflejan una mancha precisa. Mientras que CD3 se visualiza y muestra tinción específica, la vista de campo brillante patológica de CD163 demuestra que el anticuerpo es inespecífico.Una imagen multiplex óptima muestra una tinción específica en una imagen compuesta, y la especificidad CD3 y CD163 se confirma con la vista de campo brillante de patología. Después de este procedimiento, se pueden realizar cálculos de autoopotipado y análisis espacial para analizar más a fondo las interacciones de celda a célula. Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores exploren el patrón espacial de las células y el tejido intacto, mejorando nuestra comprensión del microambiente inmune tumoral.

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Investigación

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