Preparación de muestras para espectrometría de masas de ionización por electrospray de sonda
19 de febrero de 2020
En este artículo se presentan métodos de preparación de muestras para un método analítico único en tiempo real basado en la espectrometría de masas ambientales. Este método nos permite realizar análisis en tiempo real de las moléculas biológicas in vivo sin ningún pretratamiento especial.
Por lo tanto, se trata de espectrometría de masas ambientales única, especialmente adecuada para analizar muestras biológicas, tanto in vitro como in vivo. Como esto no requiere regularmente un pretratamiento especial de muestras, como la clasificación celular, el fraccionamiento y la concentración, puede analizar una muestra con una pérdida mínima de componentes biológicos, especialmente aquellas que existen como cantidad muy pequeña. Esta técnica le permite analizar las materias primas directamente en un minuto por espectrometría de masas.
La rapidez es un obstáculo en la robustez del sistema, principales ventajas inherentes a esta técnica. Todo lo que tienes que hacer es preparar sílice, 10 miligramos de tejido muestra, y 10 microlitros de proliferar. Y ponlos en un cartucho desechable.
Se establece en la máquina PESI-MS, y obtendrá el resultado en unos minutos. Al elegir el espectrómetro de masas adecuado, puede anotar la identidad molecular. Para comenzar, recupere el hígado o el tejido renal del congelador.
En una placa de corcho, corte la muestra de tejido a aproximadamente dos por dos por dos milímetros usando un bisturí o cuchillo. Alternativamente, perforar la muestra con el Trepan y recortar la longitud de la columna a dos milímetros. Si el tejido está contaminado con sangre, lave brevemente con solución salina con fosfato frío helado.
Coloque aproximadamente 10 miligramos de la muestra cortada o perforada en un microtubo de plástico y agregue 100 microlitros de 50% de etanol. Utilice una micropesta para homogeneizar la muestra. A continuación, con el pipetman, coloque 10 microlitros del homogeneizar en el pozo del cartucho del espectrómetro de masas.
Coloque el cartucho en la cámara de ionización del espectrómetro de masas de ionización directa de la sonda e instale la sonda de aguja de acero inoxidable que se utilizará para la ionización de la muestra. Cierre firmemente la tapa de la cámara para activar automáticamente el dispositivo de seguridad. Inicie el ordenador de a bordo haciendo clic en el icono de inicio para analizar, utilizando los paneles en pantalla, aplicar una tensión de 2,3 kilovoltas a la aguja para generar la electrospray y asegurarse de que la frecuencia de la aguja es de tres hercios.
Espere 30 segundos a que se complete la medición. Después de medir cada muestra, deseche el cartucho y la aguja en un eliminador de riesgo biológico. Para analizar los espectros de masa, abra el software asociado con el espectrómetro de masas.
Haga clic en el archivo L-C-D en la ventana del navegador de archivos de datos del software. Al elegir, haga clic en un único pico de la ventana del espectro de masas y para representar automáticamente un E-I-C. Marque el T-I-C y el E-I-C, y haga clic en el icono del espectro promedio para seleccionar el rango de la ventana de tiempo para generar el espectro de masas.
Exporte los datos de texto espectral de masa. Para analizar los fluidos corporales, extraiga hasta 10 microlitros de la muestra de suero y prescinda en un microtubo de 1,5 mililitros. Añadir 190 microlitros de 50% etanol al tubo, luego vórtice durante dos minutos a temperatura ambiente.
Para eliminar todos los glóbulos rojos, centrifuga el líquido a 15.000 veces G durante uno a cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 10 microlitros del sobrenadante al pozo del cartucho y proceda a medir en el espectrómetro de masas como anteriormente. Este protocolo muestra la preparación de muestras para PESI-MS en muestras sólidas, muestras líquidas y animales vivos.
El carcinoma de células renales humanas muestra picos característicos de lípidos neutros. Hubo picos relativamente fuertes en los espectros en la relación masa-carga de 900 de tejido de carcinoma de células renales humanas que no fueron identificados en el tejido no canceroso circundante. Estos picos representan principalmente glicerol triacílico.
Ejemplo de datos adquiridos en tejidos hepáticos normales, representa la lesión neoplásica de un paciente con hepatitis crónica y cirrosis hepática. Suero humano de tres individuos fue analizado usando PESI-MS, había claras diferencias en los patrones espectrales entre los individuos. Para los cambios metabólicos en 5-FdU inyectado intravenosamente en el vaso de cola de un ratón, se logró una detección muy rápida y sensible de 5-FdU con aducto de sodio en el hígado in situ.
Como la profundidad de la punta de la aguja desde el sitio del tejido, juega el papel más importante en la ionización que lee la adquisición exitosa de datos, asegúrese de seguir las instrucciones. Puede identificar las especies moleculares examinando la base de datos comercial. Esta es una manera de calificar el mecanismo molecular de la enfermedad.
Muchos investigadores se han interesado en la aplicación de esta técnica para predecir la prosperidad de la enfermedad y su pronóstico. Especialmente usando la biopsia de Ricket. Sólo asegúrese de no ser pinchado por la aguja de la sonda.
Esto se puede evitar simplemente con un instrumento específico para extraer la aguja de la máquina.
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Descripción general
Este artículo presenta un método único de espectrometría de masas en condiciones ambientales para el análisis en tiempo real de muestras biológicas in vivo. Esta técnica permite el análisis de materiales tisulares crudos sin tratamientos previos especiales, minimizando la pérdida de componentes biológicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Espectrometría de masas
- Análisis biológico
- Química analítica
Antecedentes
- La espectrometría de masas ambiental es adecuada tanto para análisis in vitro como in vivo.
- El método no requiere un tratamiento previo extenso de las muestras.
- Permite el análisis de muestras con pérdida mínima de componentes biológicos.
- El análisis rápido es una ventaja clave de esta técnica.
Objetivo del estudio
- Presentar un método para el análisis en tiempo real de moléculas biológicas.
- Mostrar la eficiencia del análisis de materiales tisulares crudos.
- Destacar las ventajas del uso de espectrometría de masas en condiciones ambientales.
Métodos Utilizados
- Preparación de especímenes de sílice y tejidos.
- Uso de cartuchos desechables para el análisis de muestras.
- Análisis directo de muestras biológicas mediante espectrometría de masas.
- Procesamiento rápido de muestras en menos de un minuto.
Resultados principales
- El método permite un análisis rápido sin pérdida significativa de componentes.
- Es eficaz para analizar muestras con cantidades muy pequeñas de material biológico.
- Demuestra robustez y fiabilidad en el análisis en tiempo real.
- Facilita el estudio de moléculas biológicas en su estado nativo.
Conclusiones
- La espectrometría de masas ambiental es una herramienta valiosa para el análisis biológico.
- La técnica mejora la comprensión de los procesos biológicos.
- Ofrece un método rápido y eficiente para el análisis en tiempo real.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La espectrometría de masas con ionización por electroaspersión mediante sonda (PESI-MS) permite el análisis molecular en tiempo real de muestras biológicas con un tratamiento previo mínimo, lo que facilita la validación rápida de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. La técnica requiere únicamente 10 mg de tejido o 10 µL de suero, lo que la hace adecuada para muestras preclínicas de bajo volumen y reduce la pérdida de componentes biológicos. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al proporcionar datos directos, in situ, sobre metabolitos y la dinámica de fármacos en sistemas vivos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de lípidos neutros y metabolitos directamente a partir de tejidos sólidos, como el carcinoma de células renales.
- Valor operativo: Requiere una preparación mínima de la muestra, únicamente la homogenización del tejido en etanol al 50 %, lo que reduce la complejidad y la variabilidad del procedimiento.
- Valor predictivo: Facilita la validación de mecanismos moleculares mediante la coincidencia con bases de datos comerciales, ayudando en la evaluación de la confianza en el blanco.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Permite el análisis directo del suero sanguíneo humano tras una simple precipitación con etanol y centrifugación, posibilitando la detección de biomarcadores basada en fluidos.
- Valor operativo: Utiliza cartuchos desechables y sondas de acero inoxidable, lo que garantiza la estandarización y reduce el riesgo de contaminación cruzada.
- Escalabilidad: Facilita un rápido procesamiento de muestras —resultados en pocos minutos—, lo que favorece la preparación para cribados de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite el seguimiento en tiempo real de la dinámica de metabolitos o fármacos en órganos específicos de animales vivos, como la detección de 5-FdU en hígado de ratón.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Proporciona datos moleculares in situ sin destrucción del tejido, preservando el contexto fisiológico para una mejor traducción preclínica a clínica.
- Avance Ajustado al Riesgo: Detecta patrones espectrales asociados a enfermedades (por ejemplo, lesiones neoplásicas en hígado cirrótico) para orientar decisiones de avance o interrupción.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La PESI-MS se integra en el continuo de descubrimiento desde la biología inicial hasta la identificación de compuestos activos, ofreciendo lecturas moleculares rápidas y cuantitativas que apoyan la comprobación de hipótesis y la preparación de ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la detección de firmas moleculares específicas de tejidos (por ejemplo, triacilgliceroles en carcinoma) sin necesidad de fraccionamiento.
- Detección: Permite el análisis de fluidos y tejidos listos para ensayos mediante la introducción estandarizada de muestras basada en cartuchos.
- Análisis: Genera datos espectrométricos de masas (picos m/z, EIC, TIC) para comparaciones cuantitativas entre diferentes condiciones e individuos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante el monitoreo in vivo de metabolitos de fármacos, como la 5-FdU intravenosa en la vena de la cola de ratón.
- Reutilización Empresarial: Utiliza hardware reutilizable (sonda, cámara) con consumibles desechables, lo que permite la estandarización entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar datos moleculares directos de sistemas biológicos intactos.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de muestras (10 mg de tejido, 10 µL de suero, 50% de etanol) y ajustes fijos de voltaje y frecuencia (2,3 kV, 3 Hz).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección rápida de metabolitos o fármacos en modelos de enfermedades.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante la detección de picos específicos de la enfermedad (por ejemplo, m/z 900 en carcinoma) ausentes en los controles.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de espectrometría de masas, incluida la preparación de disolventes (etanol al 50 %) y el uso de centrífuga para el procesamiento de suero.
- Necesita un espectrómetro de masas con ionización por sonda directa, que cuente con un sistema de cartuchos compatible y una sonda de aguja de acero inoxidable.
- Exige la estandarización entre equipos en el manejo de muestras —corte de tejidos, homogenización y transferencia del sobrenadante— para garantizar la consistencia de los datos.
- Debe tenerse en cuenta la profundidad de la punta de la aguja como una variable crítica que afecta la eficiencia de ionización y la calidad de los datos en aplicaciones in vivo.
- Se limita a muestras compatibles con la ionización ambiental; los efectos de matriz pueden requerir optimización en biofluidos complejos.
