Name: La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a detectar 5-hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones mediante inmunofluorescencia y DNA dot-blot. Este protocolo accesible revela la dinámica epigenética durante el desarrollo neuronal.

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XL fue apoyado en parte por el Programa Nacional De I+D clave de China (2017YFE0196600), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 31771395, 31571518). Q.S. contó con el apoyo del Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFC1001703) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Zhejiang (2017C03009). W.X. contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LY18H020002) y el Departamento de Tecnología Científica de la provincia de Zhejiang (2017C37057).

Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad de Zhejiang.
1. La cultura de las células madre neuronales adultas y las neuronas
<ol><li>Aísle las células madre neurales adultas del antecebrade de un ratón macho adulto (8-10 semanas de edad) C57/BL6 como se describió anteriormente31,32.</li>
	<li>Cultivo de células madre neurales adultas en medio DMEM/F-12 que contiene 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, y 2 mM L-glutamina en una incubadora de 5% CO2 a 37 oC. Inducir la diferenciación de las células madre neurales adultas con ácido retinoico de 1 M y forskoline de 5 M durante 48 h como se describió anteriormente31,32.</li>
	<li>Aísle las neuronas del hipocampo embrionario 17 (E17) del ratón y el cultivo con un medio neurobasal que contenga de 0,25% de L-glutamina, 0,125% glutaMax y 2% suplemento de B27 en una incubadora de 5% de CO2 a 37 oC como se describió anteriormente33.</li>
</ol>2. Perfusión transcardial del ratón
<ol><li>Preparar 10% hidrato cloral, 4% paraformaldehído (PFA) y solución salina tamponada fosfato (PBS) un día antes del experimento, y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Anestetiza un ratón c57 BL/6J macho o hembra adulto con un 10% de hidrato cloral (50 mg/kg, i.p.), y asegúrate de que el animal sea profundamente anestesiado comprobando la reacción corporal. Fije cada extremidad con cinta adhesiva en una placa de plástico (en posición boca arriba).</li>
	<li>Cortar la piel y luego el músculo con tijeras de cirugía. Abra la cavidad torácica con una tijera quirúrgica. Exponga el corazón y corte una pequeña parte de la aurícula derecha con una tijera quirúrgica fina.</li>
	<li>Perfundie el ratón con una jeringa esterilizada desechable de 10 ml del ventrículo izquierdo con PBS frío (alrededor de 30 ml por ratón adulto).</li>
	<li>Perfundie el ratón con 4% pfa (alrededor de 30 mL en 10 min por ratones adultos) hasta que esté rígido.</li>
	<li>Abra el cráneo del ratón con fórceps óseos. Retire el cerebro y colóquelo en 5 ml de PFA al 4% en un tubo centrífugo de 15 ml para la post-fijación a 4 oC. NOTA: Limpie el área quirúrgica una vez finalizada la cirugía.</li>
	<li>Al menos 24 h más tarde, transferir las muestras cerebrales en una solución de sacarosa del 30% para una deshidratación completa a 4 oC.</li>
</ol>3. Seccionamiento cerebral
<ol><li>Incruste las muestras cerebrales en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) en un recipiente pequeño, y enfríe a -20 oC durante al menos 1 h.</li>
	<li>Secciona muestras cerebrales a un espesor de 20-40 m con un microtome de criostato.</li>
	<li>Recoger secciones en PBS y almacenar a 4 oC.</li>
</ol>4. Mancha de inmunofluorescencia
<ol><li>Recoge las secciones con las regiones cerebrales objetivo y colócalas en una placa de 24 pocillos con PBS. Para las células cultivadas en un cubreobjetos, vaya directamente al paso 4.2.</li>
	<li>Lavar con PBS en la coctelera a temperatura ambiente durante 10 min. Repita esto dos veces más.</li>
	<li>Retire el PBS y trátelo con 1 M HCl precalentado durante 30 min a 37 oC. NOTA: Preparar 1 M HCl añadiendo 1 ml de ácido clorhídrico (36-38%) en 10 ml de agua en una campana química. Precalentar 1 M HCl en la incubadora a 37oC.</li>
	<li>Lave las muestras con PBS durante 5 min. Repita esto dos veces más.</li>
	<li>Bloquear las muestras con PBS que contengan 3% de suero normal de cabra y 0,1% de Triton X-100 durante 1 h en la coctelera a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar secciones con anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 oC en la coctelera. NOTA: Utilice los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos policlonales de conejo anti-5-hidroximetilcitosina (1:5.000), anticuerpo monoclonal de ratón anti-NeuN (1:500).</li>
	<li>Saque las muestras e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Lave las muestras con PBS durante 10 min. Repita esto dos veces más.</li>
	<li>Incubar con anticuerpos secundarios correspondientes a los anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 1 h en la coctelera. Cubra la placa con aluminio. NOTA: Utilice los siguientes anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488 cabra anticonejo IgG (1:500), Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG (1:500). Núcleos de contrastaína con 4o-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).</li>
	<li>Lave las muestras con PBS durante 10 minutos en la coctelera. Repite esto dos veces más.</li>
	<li>Monte las secciones del cerebro en las diapositivas, agregue la cantidad adecuada de medio de montaje antidescoloro (alrededor de 100-150 l) y cubra con vidrio de cubierta premium. Selle con esmalte de uñas.</li>
	<li>Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia regular o confocal.</li>
</ol>5. Aislamiento genómico del ADN
<ol><li>Eutanasia un ratón adulto C57 BL/6J (masculino o femenino) por luxación cervical y extirpa el cerebro.</li>
	<li>Disecciona los tejidos del hipocampo, la corteza y el cerebelo en un plato refrigerado por hielo. Moler los tejidos con una trituradora de tejido en 1 ml de tampón de lisis de ADN y transferirlos a un tubo de microcentrífuga limpio. Añadir 250 g de proteinasa K por 600 ml de tampón de lisis. Para los pellets celulares, agregue directamente tampón de lisis, proteinasa K, y mezcle bien. NOTA: Preparar tampón de lisis de ADN: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8.5. Lavar y autoclave la trituradora de tejido antes del experimento.</li>
	<li>El segundo día, añadir alrededor de 50 g de RNase A por muestra durante al menos 12 h a 37 oC.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1) y mezclar completamente.</li>
	<li>Centrifugar a 20.817 x g durante 15 minutos y remover el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Añadir 600 l de cloroformo al sobrenadante para precipitar el ADN, y mezclar a fondo.</li>
	<li>Centrifugar a 20.817 x g durante 15 minutos, y retirar el sobrenadante en otro tubo nuevo.</li>
	<li>Añadir 500 l de isopropanol al sobrenadante, y mezclar bien.</li>
	<li>Centrifugar a 20.817 x g durante 15 min, y retirar el sobrenadante por completo.</li>
	<li>Lavar la precipitación con 1 ml de 70% de etanol, centrifugar a 20.817 x g durante 1 min, y retirar el sobrenadante por completo. Repita una vez.</li>
	<li>Seque el pellet de ADN por completo.</li>
	<li>Disolver el pellet de ADN con tampón Tris-HCl (pH 8.5) a la concentración adecuada.</li>
</ol>6. Blot de puntos de ADN
<ol><li>Prepare las soluciones: 2 M NaOH, tampón Tris-HCl (pH 8.5), 6x citrato de sodio salino (SSC).</li>
	<li>Haga la mezcla de muestra como Tabla 1.</li>
	<li>Desnaturalice las muestras de ADN a 100 oC durante 10 minutos y enfríe en hielo.</li>
	<li>Corte el tamaño adecuado de la membrana de nylon (por ejemplo, Hybond-N+) y enjuague con 6x SSC.</li>
	<li>Coloque la membrana en el aparato de punto-blot y conéctela a la bomba de vacío. Detectar 6 l de mezcla por punto en la membrana.</li>
	<li>Hibrida durante 30 min a 80oC y bloquea la membrana de la muestra con leche sin grasa en solución salina tamponada (TBS) durante 1 h.</li>
	<li>Incubar con anticuerpo primario a 4oC durante la noche. NOTA: el siguiente anticuerpo primario: conejo policlonal anti-5-hidroximetilcitosina (1:5.000).</li>
	<li>En el segundo día, incubar las membranas de la muestra a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar con TBS durante 10 min. Repita este lavado dos veces más.</li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpo secundario anticonejo (1:5.000) durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar con TBS durante 10 min. Repita este lavado dos veces más.</li>
	<li>Visualice las señales de quimioluminiscencia y cuantifique las intensidades de la señal.</li>
</ol>

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</ol>

No existen intereses financieros en competencia.

Las modificaciones epigenéticas desempeñan un papel esencial durante el desarrollo cerebral, la maduración y la función. Como marcador estable para la modificación del ADN, la dinámica de 5 hmC responde a la adaptación conductual, la actividad neuronal y está correlacionada positivamente con la expresión génica; por lo tanto, está involucrado en la función normal del cerebro y el trastorno neurológico4. Para explorar su función en células y tejidos, es necesario detectar la existencia de 5-hmC y c...

Se ha demostrado que las modificaciones epigenéticas, incluidas la modificación del ADN, la modificación de la histona y la modificación del ARN, desempeñan funciones esenciales en diversos procesos biológicos y enfermedades1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Durante mucho tiempo, la metilación del ADN (es decir, 5-metilcitosina (5-mC)) se ha visto como un marcador epigenético altamente estable y no puede modificarse más en el genoma. Recientemente, se ha encontrado que 5-mC podría ser oxidado a 5-hidroximetilcitosina(5-hmC) por TET (diez-once translocaciones) proteínas de la familia incluyendo TET1, TET2, y TET38,9. Otros estudios muestran que 5-hmC podría servir como un marcador estable y desempeñar funciones biológicas a través de la regulación de la expresión génica4,10,11,12.
Las pruebas actuales indican que 5-hmC está altamente enriquecido en tejidos/células neuronales en relación con otros tipos de tejidos en mamíferos, y exhibe características dinámicas durante el desarrollo neuronal13,14. En el sistema neuronal, las modificaciones epigenéticas mediadas por 5 hmC desempeñan un papel importante en la regulación de las células madre neuronales, la actividad neuronal, el aprendizaje y la memoria, y está implicada en múltiples trastornos neurológicos como el síndrome de Rett, el autismo, la enfermedad de Alzheimer enfermedad, enfermedad de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Existen varios enfoques para detectar 5 hmC en células y tejidos14,21,22,23,24. Aquí, describimos dos métodos para detectar la existencia de 5 hmC y cuantificar el nivel global de 5-hmC: la tinción de inmunofluorescencia y el ADN punto-blot. Estos dos métodos son convenientes y sensibles, y se han utilizado con éxito en estudios anteriores25,26,27,28,29,30. Los pasos clave de estos dos métodos son la desnaturalización del ADN. Para la tinción de inmunofluorescencia de 5 hmC, se requiere el pretratamiento de muestras con 1 M HCl. Para la eliminación de puntos de 5 hmC, la desnaturalización del ADN se realiza con la solución NaOH. Estos dos métodos junto con la secuenciación de próxima generación son herramientas muy útiles para investigar la función de 5 hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop software</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anti-5-hidroximetilcitosina</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo criostato</td><td>Medio Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos-básico</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nylon (Hybond&trade;-N+ )</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>OCT</td><td>Pluma Leica 14020108926</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24:1 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>retinoicoSigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de 5-hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Se han identificado múltiples modificaciones del ADN en el genoma de los mamíferos. De eso, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina-mediada mecanismos epigenéticos se han estudiado intensamente. 5-hidroximetilcitosina muestra características dinámicas durante el desarrollo embrionario y postnatal del cerebro, desempeña una función reguladora en la expresión génica, y participa en múltiples trastornos neurológicos. Aquí, describimos los métodos detallados incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la mancha de puntos de ADN para detectar 5-hidroximetilcitosina en células cultivadas y tejidos cerebrales de ratón.

Para revelar la distribución de 5 hmC en el hipocampo de ratones adultos, realizamos inmunofluorescencia con anticuerpos contra células neuronales (NeuN) y 5-hmC. En el hipocampo, 5-hmC co-localizado bien con marcador de células neuronales NeuN (Figura 1A-H), lo que sugiere un enriquecimiento de 5-hmC en las neuronas.
Para determinar la dinámica de 5 hmC durante el desarrollo neuronal, primero se realizó un punto-blot con muestras de ADN aisladas ...

Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en células y tejidos cerebrales, utilizando la tinción de inmunofluorescencia y métodos de adn-blot.

La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en las células y los tejidos cerebrales usando inmunofluorescencia, el nuevo método, y la mancha de puntos de ADN. 5-hidroximetilcitosina, es decir, 5hmC, modificación epigenética mitigada, desempeña una función importante en la regulación de la expresión génica e implicado en múltiples trastornos neurológicos.En realidad, nuestros métodos se pueden utilizar para detectar 5hmC en múltiples células y tejidos. Es conveniente y se puede realizar con equipos comunes en el laboratorio. Comience colocando el ratón boca arriba en una tabla de plástico y fijando cada extremidad con cinta adhesiva.Usa tijeras quirúrgicas para cortar la piel y el músculo, y abre la cavidad torácica. Exponga el corazón y corte una pequeña parte de la aurícula derecha con finas tijeras quirúrgicas. Usando una jeringa desechable de 10 mililitros, perfunde el ratón del ventrículo izquierdo con PBS frío.A continuación, perfunda el ratón con 4%PFA hasta que esté rígido. Luego, abre el cráneo con fórceps óseos y extrae el cerebro. Coloque el cerebro en un tubo centrífugo de 15 mililitros lleno de cinco mililitros de 4%PFA y guárdelo a cuatro grados centígrados.Después de 24 horas, transfiera el cerebro a una solución de 30% sacarosa y déjelo a cuatro grados centígrados para una deshidratación completa. Antes de la sección, imbed el cerebro en un compuesto de temperatura de corte óptima y enfriar a menos 20 grados Celsius durante al menos una hora. Secciones de muestras cerebrales con un grosor de 20 a 40 micrómetros utilizando un microtoma criostato.Recoger secciones en PBS y almacenar a cuatro grados Celsius. Recoge las secciones cerebrales de interés y colólas en una placa de 24 pozos con PBS. Lavar las secciones con PBS en una coctelera durante 10 minutos.Retire el PBS y trate con ácido clorhídrico de un molar precalentado a 37 grados centígrados durante 30 minutos. El ácido clorhídrico es corrosivo y prepáralo en la bodega química. Luego, lave las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos y bloquee con PBS que contenga un 3% de suero de cabra normal y un 0,1%Tritón X-100.Deje las muestras en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Añadir anticuerpos primarios específicos a las secciones e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius en un agitador. Al día siguiente, saque las muestras y déjelas a temperatura ambiente durante una hora.Lave las muestras tres veces con PBS y agregue anticuerpos secundarios. Cubra la placa con aluminio y déjela a temperatura ambiente durante una hora mientras agita. Después de la incubación, lave las muestras tres veces con PBS y móntelos en los portaobjetos.Agregue de 100 a 150 microlitros de medio de montaje anti-fade, cubra con un vidrio de cubierta premium y selle con esmalte de uñas. Imagen de las secciones cerebrales con un microscopio regular o confocal. Para aislar el ADN genómico, comience diseccionando el hipocampo, la corteza y los tejidos del cerebelo en un plato refrigerado por hielo.Añadir un mililitro de tampón de lysis de ADN y moler los tejidos. Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio y añada 250 microgramos de proteinasa-K por cada 600 microlitros de tampón de lelisis. Luego, agregue unos 50 microgramos de RNase A por muestra e incubar durante al menos 12 horas a 37 grados centígrados.Después de la incubación, añadir un volumen igual de alcohol isoamilo de cloroformo fenol y mezclar a fondo. Centrifugar la mezcla de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue 600 microlitros de cloroformo al sobrenadante, mezcle bien y centrifugar de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue 500 microlitros de isopropanol. Mezcle bien y centrifugar de nuevo para precipitar el ADN. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el pellet de ADN con 70% de etanol de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Seque el pellet de ADN por completo y luego disuelva en el tampón Tris-HCl. Antes de empezar, prepare las soluciones requeridas y la mezcla de muestras de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Desnaturalizar la muestra de ADN calentándola a 100 grados Celsius durante 10 minutos y luego, colóquela sobre hielo.Corte el tamaño adecuado de una membrana de nylon y enjuáguela con 6X SSC. Coloque la membrana en un aparato de punto-blot y conecte la bomba de vacío. Detecte puntos de seis microlitros en la membrana e hibridí durante 30 minutos a 80 grados centígrados.Luego, bloquee la membrana de la muestra con leche libre de grasa y solución salina tamponada Tris, o TBS, durante una hora. Añadir el anticuerpo anti-5-hidroximetilcitosina de conejo policlonal a la membrana e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, deje la membrana de la muestra a temperatura ambiente durante una hora y, a continuación, lave la membrana tres veces con TBS.Incubar la membrana con el anticuerpo secundario anti-conejo durante 30 minutos y luego, lavar tres veces con TBS. Visualizar las señales de quimiminiscencia y cuantificar su intensidad. Este protocolo se puede utilizar para visualizar 5-hidroximetilcitosina, o 5hmC, en el hipocampo de ratones adultos.La inmunofluorescencia con anticuerpos contra las células neuronales, el 5hmC revela que hay un enriquecimiento de 5hmC en las neuronas. La dinámica de 5hmC durante el desarrollo neuronal se puede determinar con un ensayo de punto-blot de muestras de ADN aisladas de células madre neuronales adultas proliferantes y diferenciadas. Los niveles globales de 5hmC aumentan significativamente durante la diferenciación y el nivel de 5hmC en las neuronas es mayor que en las células madre neurales.El paso clave de este método es asegurarse de que la desnaturalización completa de las muestras de ADN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El EpiMark 5 HMC y 5-MC Kit de análisis se puede utilizar para analizar y cuantificar la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina dentro de un lugar específico de la SPE. El kit distingue 5-MC de 5 HMC por la adición de glucosa al grupo hidroxilo de la 5-HMC a través de una reacción enzimática utilizando β-glucosiltransferasa (T4-BGT). Cuando el 5-HMC se produce en el contexto de las CCGG, esta modificación convierte un sitio escindible MspI a un sitio no escindibles.

Alta sensibilidad de detección de 5 hidroximetilcitosina en el tejido cerebral Balb / C

Se describe un proceso de etiquetado en dos etapas utilizando β-glucosiltransferasa (β-GT) para transferir una azida-glucosa al 5-HMC, seguido de química para transferir un enlazador de biotina para el enriquecimiento fácil y densidad independiente. Este método de marcaje eficaz y específico permite el enriquecimiento de 5-HMC con fondo extremadamente bajo y de alto rendimiento de mapeo epigenómico a través de secuenciación de próxima generación.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

La administración de dos análogos de timidina, edu y BrdU, en ratones embarazada permite el análisis de la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales y en el cerebro de ratón embrionario. Este método es útil para determinar los efectos del estrés genotóxico, incluyendo la radiación ionizante, durante el desarrollo del cerebro.

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

En este trabajo describimos un método inmunoquímico sensible para mapear la distribución espacial de los derivados de oxidación de 5mC basado en el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y la amplificación de la señal de tiramida.

La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Recién descubierto formas oxidadas de la 5-METILCITOSINA (oxi-mCs), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) puede representar distintas modificaciones de ADN con papeles funcionales únicas. Aquí se describe un flujo de trabajo semi cuantitativa para la visualización de la distribución espacial de la oxi-mCs, perfiles de intensidad de señal y colocalización.

Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

El objetivo de este informe es describir el protocolo para la detección de immunohistochemical robusto de marcadores epigenéticos, 5-METILCITOSINA (5mC) y 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en el desarrollo y postmitotic retina de ratón.

La detección de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en desarrollo y en la Retina de ratón Postmitotic

El ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado es un método basado en anticuerpos utilizado para enriquecer fragmentos de ARN metilados. Junto con la secuenciación profunda, conduce a la identificación de transcripciones que llevan la modificación m5C.

Ensayo de inmunoprecipitación de ARN metilado para estudiar la modificación m5C en Arabidopsis

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Este artículo describe un protocolo para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina normal y aberrante dentro de embriones intactos de pez cebra.

Monitorización espaciotemporal rápida y eficiente de la metilación normal y aberrante de la citosina en embriones intactos de pez cebra

Aprende a detectar 5-hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones mediante inmunofluorescencia y DNA dot-blot. Este protocolo accesible revela la dinámica epigenética durante el desarrollo neuronal.

La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

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