Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra
January 28th, 2020
Las tecnologías de edición de genes han permitido a los investigadores generar mutantes de peces cebra para investigar la función génica con relativa facilidad. Aquí, proporcionamos una guía para realizar el genotipado de embriones paralelos y la cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Este enfoque imparcial proporciona una mayor precisión en los análisis fenotípicos basados en la hibridación in situ.
Las consecuencias de las mutaciones en la expresión génica a menudo se evalúan cualitativamente mediante hibridación in situ y generalmente se puntúen visualmente, lo cual es subjetivo y sesgado por las expectativas del investigador. Este método proporciona una manera más coherente de comparar experimentos in situ cuantificando las intensidades de la imagen y elimina ese sesgo. Esto también se puede adaptar fácilmente a otros sistemas modelo que utilizan la hibridación in situ como lector de una expresión génica.
Comience por tomar imágenes de los embriones manchados de hibridación in situ o DE ISH. Preparar una solución de glicerol y mezclarla para homogeneizarla. Transfiera los embriones a la solución de glicerol con una pipeta Pasteur de tres mililitros y déjelos reposar durante al menos cinco minutos.
Preparar y etiquetar suficientes tubos de PCR para transferir los embriones manchados de ISH después de la toma de imágenes, luego utilice una pipeta Pasteur de tres mililitros para agregar 100% glicerol al fondo del pozo de un portaobjetos de depresión de vidrio. Transfiera un único embrión manchado de ISH a la corredera de vidrio y orientelo bajo un microscopio estéreo equipado con una cámara digital y una iluminación inferior y superior. Con el primer embrión, ajuste el tiempo de iluminación y exposición con el aumento deseado.
Imagen de tantos embriones como sea necesario y etiqueta cada imagen con un número único. Después de la toma de imágenes, transfiera cada embrión a un tubo de PCR etiquetado con el mismo número y, si es necesario, aspire el exceso de glicerol de los tubos de PCR. Para extraer el ADN, añada de 40 a 75 microlitros de un tampón de lelisis alcalina como HoTSHOT a cada tubo.
Incubar los tubos a 95 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos y luego enfriarlos a cuatro grados centígrados. Añadir un volumen igual de tampón de neutralización y proceder con el genotipado para la mutación de interés. Para realizar el análisis de imágenes, seleccione y abra la imagen en Fiji e invierta haciendo clic en Editar y, a continuación, en Invertir, luego convierta el tipo de imagen a 8 bits haciendo clic en la pestaña Imagen, seleccionando Tipo y seleccionando 8 bits.
Seleccione la herramienta poligonal y dibuje manualmente la región de interés o ROI en la imagen alrededor de la región que contiene la señal ISH que se va a medir. Presione T para abrir el Administrador de ROI y seleccione la región de interés y, a continuación, haga clic en Medir. Copie el valor medio de la ventana Resultados en una hoja de cálculo.
Para medir la intensidad de fondo, mueva el ROI a una región del embrión sin manchas y haga clic en Agregar en el Administrador de ROI. Seleccione la región de fondo y haga clic en Medir y, a continuación, registre el valor de intensidad media en la hoja de cálculo. Obtenga la intensidad media del píxel de la señal de hibridación NC2 restando la intensidad media del fondo de la de la región manchada.
Después de determinar la intensidad media de cada muestra, asigne un genotipo a cada muestra. Si no se puede determinar el genotipo, excluya la muestra del análisis posterior. Ordene los valores medios de intensidad de la muestra según el genotipo y continúe con las pruebas estadísticas.
La utilidad de esta técnica se ha demostrado en ISH para dnmt3bb. 1 en embriones de un incrucigous heterocigoto runx1. Una disminución en dnmt3bb.
Se detectó 1 expresión en mutantes homocigotos runx1, mientras que los embriones heterocigotos no mostraron diferencias significativas en dnmt3bb. 1 expresión. Al intentar determinar el efecto de la mutación lmo4 en la expresión runx1, este análisis no mostró diferencias significativas en la expresión entre el tipo salvaje y los mutantes lmo4 homocigotas.
Sin embargo, una pequeña disminución de la expresión runx1 fue detectada por un solo embrión qPCR. En aproximadamente el 0,4% de los embriones con sonda runx1, la ISH tenía un fondo alto que resultó en un número negativo cuando se restó de la señal. En tales casos, los embriones fueron excluidos del análisis.
Cuatro regiones diferentes en los embriones han sido probadas para optimizar las correcciones de fondo. Si bien hubo una diferencia relativamente estable en la intensidad del ROI en cualquiera de las áreas de fondo, R3 siempre mostró una intensidad más alta que el ROI y no debe utilizarse para la corrección de fondo. R1 y R4 demostraron ser las áreas más apropiadas para la corrección de fondo.
Es importante encontrar las mejores condiciones para la toma de imágenes y mantenerlas sin cambios durante todo el experimento. También recomendamos cuantificar la intensidad del píxel antes de asignar un genotipo a cada muestra.
Visión general
Este artículo presenta un método para la genotipificación paralela de embriones y cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Al utilizar este enfoque imparcial, los investigadores pueden lograr una mayor precisión en los análisis fenotípicos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genética
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Las tecnologías de edición genética facilitan la generación de mutantes de pez cebra.
- La hibridación in situ es un método común para evaluar la expresión génica.
- Los métodos de puntuación tradicionales pueden introducir sesgos y subjetividad.
- Este estudio tiene como objetivo proporcionar un enfoque más consistente y cuantitativo.
Propósito del estudio
- Mejorar la precisión de los análisis fenotípicos en peces cebra.
- Proporcionar un método estandarizado para la genotipificación de embriones.
- Cuantificar objetivamente las señales de hibridación in situ.
Métodos utilizados
- Imágenes de embriones teñidos con ISH utilizando un microscopio estereoscópico.
- Preparación de soluciones de glicerol para la transferencia de embriones.
- Uso de tampón de lisis alcalina para la extracción de ADN.
- Empleando el software Fiji para el análisis de imágenes y cuantificación.
Principales resultados
- Demostró una disminución en la expresión de dnmt3bb.1 en mutantes homocigotos runx1.
- Identificó áreas de corrección de fondo apropiadas para el análisis de imágenes.
- No mostró diferencias significativas en la expresión entre el tipo salvaje y los mutantes homocigotos lmo4.
- Proporcionó un método confiable para asignar genotipos basados en la intensidad de píxeles.
Conclusiones
- El método mejora la fiabilidad del análisis de expresión génica.
- Puede adaptarse para su uso en otros sistemas modelo.
- Mantener condiciones de imagen consistentes es crucial para obtener resultados precisos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
