Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra
28 de enero de 2020
Las tecnologías de edición de genes han permitido a los investigadores generar mutantes de peces cebra para investigar la función génica con relativa facilidad. Aquí, proporcionamos una guía para realizar el genotipado de embriones paralelos y la cuantificación de señales de hibridación in situ en peces cebra. Este enfoque imparcial proporciona una mayor precisión en los análisis fenotípicos basados en la hibridación in situ.
Las consecuencias de las mutaciones en la expresión génica a menudo se evalúan cualitativamente mediante hibridación in situ y generalmente se puntúen visualmente, lo cual es subjetivo y sesgado por las expectativas del investigador. Este método proporciona una manera más coherente de comparar experimentos in situ cuantificando las intensidades de la imagen y elimina ese sesgo. Esto también se puede adaptar fácilmente a otros sistemas modelo que utilizan la hibridación in situ como lector de una expresión génica.
Comience por tomar imágenes de los embriones manchados de hibridación in situ o DE ISH. Preparar una solución de glicerol y mezclarla para homogeneizarla. Transfiera los embriones a la solución de glicerol con una pipeta Pasteur de tres mililitros y déjelos reposar durante al menos cinco minutos.
Preparar y etiquetar suficientes tubos de PCR para transferir los embriones manchados de ISH después de la toma de imágenes, luego utilice una pipeta Pasteur de tres mililitros para agregar 100% glicerol al fondo del pozo de un portaobjetos de depresión de vidrio. Transfiera un único embrión manchado de ISH a la corredera de vidrio y orientelo bajo un microscopio estéreo equipado con una cámara digital y una iluminación inferior y superior. Con el primer embrión, ajuste el tiempo de iluminación y exposición con el aumento deseado.
Imagen de tantos embriones como sea necesario y etiqueta cada imagen con un número único. Después de la toma de imágenes, transfiera cada embrión a un tubo de PCR etiquetado con el mismo número y, si es necesario, aspire el exceso de glicerol de los tubos de PCR. Para extraer el ADN, añada de 40 a 75 microlitros de un tampón de lelisis alcalina como HoTSHOT a cada tubo.
Incubar los tubos a 95 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos y luego enfriarlos a cuatro grados centígrados. Añadir un volumen igual de tampón de neutralización y proceder con el genotipado para la mutación de interés. Para realizar el análisis de imágenes, seleccione y abra la imagen en Fiji e invierta haciendo clic en Editar y, a continuación, en Invertir, luego convierta el tipo de imagen a 8 bits haciendo clic en la pestaña Imagen, seleccionando Tipo y seleccionando 8 bits.
Seleccione la herramienta poligonal y dibuje manualmente la región de interés o ROI en la imagen alrededor de la región que contiene la señal ISH que se va a medir. Presione T para abrir el Administrador de ROI y seleccione la región de interés y, a continuación, haga clic en Medir. Copie el valor medio de la ventana Resultados en una hoja de cálculo.
Para medir la intensidad de fondo, mueva el ROI a una región del embrión sin manchas y haga clic en Agregar en el Administrador de ROI. Seleccione la región de fondo y haga clic en Medir y, a continuación, registre el valor de intensidad media en la hoja de cálculo. Obtenga la intensidad media del píxel de la señal de hibridación NC2 restando la intensidad media del fondo de la de la región manchada.
Después de determinar la intensidad media de cada muestra, asigne un genotipo a cada muestra. Si no se puede determinar el genotipo, excluya la muestra del análisis posterior. Ordene los valores medios de intensidad de la muestra según el genotipo y continúe con las pruebas estadísticas.
La utilidad de esta técnica se ha demostrado en ISH para dnmt3bb. 1 en embriones de un incrucigous heterocigoto runx1. Una disminución en dnmt3bb.
Se detectó 1 expresión en mutantes homocigotos runx1, mientras que los embriones heterocigotos no mostraron diferencias significativas en dnmt3bb. 1 expresión. Al intentar determinar el efecto de la mutación lmo4 en la expresión runx1, este análisis no mostró diferencias significativas en la expresión entre el tipo salvaje y los mutantes lmo4 homocigotas.
Sin embargo, una pequeña disminución de la expresión runx1 fue detectada por un solo embrión qPCR. En aproximadamente el 0,4% de los embriones con sonda runx1, la ISH tenía un fondo alto que resultó en un número negativo cuando se restó de la señal. En tales casos, los embriones fueron excluidos del análisis.
Cuatro regiones diferentes en los embriones han sido probadas para optimizar las correcciones de fondo. Si bien hubo una diferencia relativamente estable en la intensidad del ROI en cualquiera de las áreas de fondo, R3 siempre mostró una intensidad más alta que el ROI y no debe utilizarse para la corrección de fondo. R1 y R4 demostraron ser las áreas más apropiadas para la corrección de fondo.
Es importante encontrar las mejores condiciones para la toma de imágenes y mantenerlas sin cambios durante todo el experimento. También recomendamos cuantificar la intensidad del píxel antes de asignar un genotipo a cada muestra.
Resumen
Este artículo presenta un método para la genotipificación paralela de embriones y la cuantificación de señales de hibridación in situ en pez cebra. Al utilizar este enfoque imparcial, los investigadores pueden lograr una mayor precisión en los análisis fenotípicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genética
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Las tecnologías de edición génica facilitan la generación de mutantes de pez cebra.
- La hibridación in situ es un método común para evaluar la expresión génica.
- Los métodos tradicionales de puntuación pueden introducir sesgos y subjetividad.
- Este estudio tiene como objetivo proporcionar un enfoque más consistente y cuantitativo.
Objetivo del estudio
- Mejorar la precisión de los análisis fenotípicos en pez cebra.
- Proporcionar un método estandarizado para la genotipificación de embriones.
- Cuantificar objetivamente las señales de hibridación in situ.
Métodos Utilizados
- Imagen de embriones teñidos con ISH utilizando un microscopio estereoscópico.
- Preparación de soluciones de glicerol para la transferencia de embriones.
- Uso de tampón de lisis alcalina para la extracción de ADN.
- Empleo del software Fiji para el análisis y cuantificación de imágenes.
Resultados principales
- Se demostró una disminución en la expresión de dnmt3bb.1 en mutantes homocigotos para runx1.
- Se identificaron áreas adecuadas de corrección de fondo para el análisis de imágenes.
- No se observaron diferencias significativas en la expresión entre el tipo silvestre y los mutantes homocigotos para lmo4.
- Se proporcionó un método confiable para asignar genotipos basado en la intensidad de los píxeles.
Conclusiones
- El método mejora la fiabilidad del análisis de expresión génica.
- Puede adaptarse para su uso en otros sistemas modelo.
- Mantener condiciones de imagen consistentes es crucial para obtener resultados precisos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis cuantitativo de hibridación in situ reduce la subjetividad en la evaluación de la expresión génica, mejorando la fiabilidad de los datos para la validación de objetivos en modelos de pez cebra. Este enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la correlación imparcial del genotipo con los patrones de expresión fenotípica. El método aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar mediciones estandarizadas y reproducibles en muestras de genotipos mixtos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación imparcial de señales de expresión génica restringidas espacialmente.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo consistente para comparar fenotipos mutantes y de tipo salvaje sin sesgo del observador.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al distinguir cambios significativos en la expresión del ruido de fondo en modelos genéticos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la cribado de compuestos posteriores mediante el establecimiento de perfiles de expresión basales.
- Reproducibilidad: Estandariza los protocolos de adquisición y análisis de imágenes para minimizar la variabilidad entre experimentos.
- Resultado cuantitativo: Genera datos medibles de intensidad de píxeles adecuados para comparaciones estadísticas entre grupos de tratamiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la consistencia desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el uso de lecturas fenotípicas objetivas.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la correlación entre cambios en la expresión génica y el estado genotípico para el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
- Decisiones Ajustadas al Riesgo: Permite tomar decisiones de avance basadas en datos al reducir los falsos positivos en estudios de validación de dianas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al vincular la confirmación genotípica con la evaluación fenotípica cuantitativa, apoyando la identificación de compuestos prometedores mediante la reducción de riesgos mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al proporcionar datos cuantitativos sobre la distribución de ARNm para aclarar la función génica en las vías del desarrollo.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante condiciones reproducibles de imagen y análisis para una evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de intensidad y valores corregidos por fondo que permiten la comparación estadística de condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica al garantizar una puntuación fenotípica consistente en diferentes sistemas modelo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de genotipificación y cuantificación aplicable a múltiples genes y líneas mutantes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en los datos de expresión génica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante protocolos estandarizados de manejo de embriones y análisis de imágenes.
- Valor estratégico: Perfecciona las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos objetivos para la asignación de capital en programas de etapa inicial.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo al distinguir los efectos biológicos reales de la variabilidad técnica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones de pez cebra, microscopía y técnicas básicas de genotipificación.
- Depende de un microscopio estereoscópico con capacidades de imagen digital y del software Fiji para el análisis.
- Necesita la estandarización entre equipos de las condiciones de imagen, tiempos de exposición y regiones de corrección del fondo.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes cepas de pez cebra y etapas de desarrollo.
- Comprende limitaciones prácticas, como la optimización de la corrección del fondo y la exclusión de muestras con genotipos indeterminados o ruido de fondo elevado.
