Name: Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a producir hepatoesferas 3D funcionales a partir de células madre pluripotentes humanas mediante autoensamblaje celular en moldes de agarosa. Este método permite controlar el tamaño de las esferas hepáticas para aplicaciones en modelado de enfermedades y cribado de fármacos.

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Este estudio fue apoyado con premios de la Plataforma de Medicina Regenerativa del Reino Unido (MRC MR/L022974/1) y la Oficina del Científico Jefe (TCS/16/37).

1. Preparación de moldes de microplacas de agarosa
NOTA: Los medios utilizados para estos experimentos deben ser estériles y a temperatura ambiente (RT) para el cultivo celular.
<ol><li>
Preparar moldes de agarosa al 2%.
	<ol>
<li>Disolver 2 g de agarosa de baja temperatura de fusión en 100 ml de agua destilada esterilizada. Calienta cuidadosamente en un microondas con el intervalo temblando para disolver por completo.</li>
		<li>Añadir 520 l de agarosa fundida a un molde de formato de 256 pozos y dejar solidificar.</li>
		<li>Transfiera cada microplaca de agarosa en un solo pozo de una placa de 12 pocillos.</li>
		<li>Agregue 1,5 ml de 1 solución salina con búfer de fosfato (DPBS) de Dulbecco con Ca2+/Mg2+ a cada pocil y retire las burbujas de aire de los micropozos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una punta de pipeta P1000. Esto se realiza para garantizar una sembración celular uniforme. NOTA: Las microplacas de agarosa se pueden almacenar durante un máximo de 6 meses a 4 oC en 1x DPBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sembrar células madre pluripotentes humanas en placas de micropocillos de agarosa
<ol><li>
Preparación de la suspensión celular
	<ol>
<li>Aspirar el medio de una cultura indiferenciada de hPSCcomo se describió anteriormente8. NOTA: los hPSC se cultivan en LN-521 en mTeSR1 con el medio cambiado cada 24 h, y se pasa regularmente una vez que las células alcanzan 75% a 85% de la confluencia como se describió anteriormente8.</li>
		<li>Enjuague las celdas con 5 ml de RT 1x DPBS sin Ca2+/Mg2+ y retire el búfer.</li>
		<li>Añadir 5 ml de reactivo de disociación celular 1x (Tablade Materiales)a las células y permitir la disociación celular incubando células a 37 oC durante 6-8 min. NOTA: Para detener la reacción, examine el desprendimiento celular bajo el microscopio. Las células deben separarse parcialmente de la placa. Extienda la incubación durante 1-2 min adicional si se requiere más tiempo.</li>
		<li>Detenga la reacción retirando el reactivo de disociación celular y agregue 5 ml de medio mTeSR1 fresco complementado con inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) de 10 M a las células. Disociar las células canalizando hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una punta de pipeta P1000.</li>
		<li>Cuente las células viables usando un hemocitómetro y una exclusión de tinción azul trypan. Después de esto, prepare la suspensión celular en la concentración requerida.</li>
		<li>Calcule el número total de celdas necesarias. Para la diferenciación de la hepalosfera 3D, semilla 3.84 x 105 células por microplaca de agarosa para generar esferoides con 100-150 m de diámetro.</li>
		<li>Transfiera el número deseado de células a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml o 50 ml y centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 minutos a RT para peletizar las células.</li>
		<li>Aspirar y desechar las células sobrenadant y resuspender en mTeSR1 medio más 10 m inhibidor de ROCK Y27632. Diluir el pellet celular en el volumen apropiado de medio a una concentración final de 2,1 x 106 células/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sembrar las células a las microplacas de agarosa preparadas NOTA: Si utiliza microplacas de agarosa almacenadas en el refrigerador, colóquelas en la incubadora de células a 37 oC durante al menos una hora antes de su uso y aspirar el 1x DPBS del pozo antes de la sembración de la célula.<ol>
<li>Añadir 190 s de la suspensión celular en el micropozo de agarosa.</li>
		<li>Después de la sembrada, devuelva las placas a la incubadora de células a 37 oC y 5% de CO2 durante 2 h para permitir que las células se asienten.</li>
		<li>Después de 2 h, añadir 1 mL de medio mTeSR1 fresco y cálido complementado con 10 m de inhibidor de ROCK Y27632 a cada poca.</li>
		<li>Devolver las placas a la incubadora de células a 37oC y 5% de CO2 durante 24 h y examinar la formación de esferas al día siguiente para permitir que las células se adhieran.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Diferenciar hPSCs a 3D Hepatospheres en Agarose Microwells
<ol><li>Preparación de polos recubiertos de poli 2-hidroxietilo (poli-HEMA)
	<ol>
<li>Disolver 2 g de poli-HEMA en 100 ml de etanol al 95%. Revuelva la solución durante la noche con una placa caliente a 55 oC. Añadir 250 ml de solución de poli-HEMA por pozo de una placa de 24 pocillos y secar durante la noche a 60 oC con un horno.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del medio de diferenciación
	<ol>
<li>Preparar una solución de 1.000x de actividad humana A mediante la disolución de la activina humana Una proteína liofilizada en albúmina sérica estéril 0,2% bovina (BSA)/DPBS a una concentración final de 100 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Usar a 1:1.000.</li>
		<li>Preparar una solución de stock de 1.000x de Wnt3a mediante la disolución del ratón Wnt3a proteína liofilizada en estéril 0.2% BSA/DPBS a una concentración final de 10 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Utilícelo a la 1:200.</li>
		<li>Preparar una solución de 1.000x de crecimiento de hepatocitos humanos (HGF) mediante la disolución de proteína liofilizada HGF humana en estéril 0.2% BSA/DPBS a una concentración final de 10 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Usar a 1:1.000.</li>
		<li>Preparar una solución de stock de 1.000x de oncostatin M (OSM) disolviendo OSM en BSA/DPBS estéril 0.2% a una concentración final de 20 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Usar a 1:1.000.</li>
		<li>Preparar una solución de 1000x en stock de factor de crecimiento epitelial (EGF) disolviendo la proteína liofilizada en estéril 0,2% BSA/DPBS a una concentración final de 10 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Usar a 1:1.000.</li>
		<li>Preparar una solución de 1.000x de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) disolviendo la proteína liofilizada en estéril 0.2% BSA/DPBS a una concentración final de 10 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Usar a 1:1.000.</li>
		<li>Preparar una solución de 1.000x de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) disolviendo la proteína liofilizada en 0.2% BSA/DPBS a una concentración final de 10 g/ml. Conservar a -20oC en pequeñas alícuotas. Usar a 1:1.000.</li>
		<li>Hacer medio de diferenciación de endoderm consistente en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medio basal complementado con 2% de suplemento B27 (50x, sin insulina), y 1% penicilina/estreptomicina (concentraciones finales: 100 UI/ml y 100 g/ml, respectivamente). A menos que se indique, en cada cambio medio, complementar el volumen requerido con Wnt3a y activina A a una concentración final de 50 ng/mL y 100 ng/mL, respectivamente. NOTA: Conservar a 4oC y utilizarlos en un plazo de dos semanas.</li>
		<li>Hacer medio de diferenciación de hepatoblast que consiste en el medio Eagle modificado de Dulbecco (KO-DMEM) con un 20% de reemplazo sérico de knockout (KOSR) y complementado con 0.5% de un suplemento alternativo a L-glutamina, 1% aminoácidos no esenciales (NEAA), 0,1 mM de beta-mercaptoetanol, 1% de sulfóxido de dimetil (DMSO) y 1% de penicilina/estreptomicina (concentraciones finales a 100 UI/ml y 100 g/ml, respectivamente). Filtrar al vacío. NOTA: Conservar a 4oC y utilizarlos en un plazo de dos semanas.</li>
		<li>Hacer medio de maduración de hepatocitos consistente en medio de hepatocito complementado con 1% de un suplemento alternativo a L-glutamina, hidrocortisona de 10 M 21-hemisuccinato sal sódica (HCC), 1% penicilina/estreptomicina (concentraciones finales a 100 UI/ml y 100 g/ml, respectivamente). Para cada cambio medio, complemente el volumen requerido con OSM y HGF (concentraciones finales a 20 ng/ml y 10 ng/mL, respectivamente). NOTA: Almacene el stock a 4oC y utilícelo en un plazo de dos semanas.</li>
		<li>Hacer medio de mantenimiento de hepatocitos que consista en el medio de William's E complementado con un reemplazo sérico de 10% knockout, que consiste en 1% de un suplemento alternativo a L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina (concentraciones finales a 100 UI/ml y 100 g/ml, respectivamente). Para cada cambio medio, complementar el volumen requerido con HGF, EGF, bFGF y VEGF (concentración final de cada factor de crecimiento a 10 ng/ml). NOTA: Almacene el stock a 4oC y utilícelo en un plazo de dos semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Compruebe la formación de la hepatósfera 24 h después de la sembración e inicie la diferenciación de hepatocitos. Retire cuidadosamente el medio mTeSR1 y reemplácelo por 1 ml de medio de diferenciación de endoderm fresco complementado con 100 ng/mL activin A y 50 ng/mL Wnt3a.</li>
	<li>Cambiar el medio de cebado de endoderm suplementado cada 24 h durante 3 días para los HEC. Cuando trabaje con hiPSCs, extienda esta etapa durante otros 2 días complementando los medios con activina A (100ng/ml) solo.</li>
	<li>Después de la inducción definitiva del endoderm, cambie al medio de diferenciación de hepatoblasto para la especificación de hepatoblasto durante 5 días reemplazando el medio cada 2 días y realice el último cambio en el último día de la especificación de hepatoblasto.</li>
	<li>Transfiera las hepatosferas a los pozos recubiertos de poli-HEMA.
	<ol>
<li>Lavar las células una vez con medio de maduración de hepatocitos sin suplementos después de eliminar el medio KSR/DMSO y añadir 1 ml de medio de maduración de hepatocitos complementado con 10 ng/mL HGF y 20 ng/mL OSM.</li>
		<li>Usando una pipeta P1000, levante las hepatósferas de la microplaca de agarosa pipeteando la solución varias veces.</li>
		<li>Transfiera el medio que contiene las hepatóferas a un pozo recubierto de poli-HEMA.</li>
		<li>Lavar la microplaca de agarosa con 1 ml de medio de maduración de hepatocitos complementado con 10 ng/ml de HGF y 20 ng/mL OSM y transferir el medio al pocaculo recubierto de poli-HEMA.</li>
		<li>Repita el paso 3.6.4 tantas veces como sea posible para transferir todas las hepatóferas de la microplaca de agarosa. NOTA: Es fundamental pipetear cuidadosamente la solución que contiene las hepatóferas para evitar dañarlas.</li>
	</ol></li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el exceso de medios sin eliminar las hepatosferas mediante el uso de una pipeta P100 hasta que 1 ml de medio que contenga las hepatosferas permanezca en el pozo recubierto de poli-HEMA.</li>
	<li>Cambiar el medio cada 48 h durante 12 días.</li>
	<li>En el día 20 cuando trabaje con hESCs o el día 22 si trabaja con hiPSCs, cambie el medio a medio de mantenimiento de hepatocitos.
	<ol>
<li>Retire el medio de maduración de hepatocitos y lave las células una vez con el medio de mantenimiento de hepatocitos sin los suplementos. Añadir 1 ml de medio de mantenimiento de hepatocitos complementado con 10 ng/ml de HGF, EGF, FGF y VEGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambie el medio para el medio de mantenimiento de hepatocitos frescos cada 48 h.</li>
</ol>4. Análisis funcional de las heferas 3D cultivadas a largo plazo
<ol><li>Cambiar al medio de maduración de hepatocitos complementado con 10 M de HCC, L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina (concentraciones finales a 100 UI/ml y 100 g/ml, respectivamente) y 10 ng/ml HGF 48 h antes de realizar análisis funcionales.</li>
	<li>
Analizar la función metabólica de los hepatocitos utilizando ensayos del citocromo (CYP) P450.
	<ol>
<li>Reemplazar el medio con 1 ml de medio de maduración de hepatocitos frescos complementado con sustrato de 50 m de luciferina-6'-pentafluoro-éter bencilo (luciferin-PFBE) para detectar la actividad basal del CYP3A o 100 éM de éter luciferina-metil (luciferin-ME) para detectar CYP1A2 actividad basal (número de réplicas n.o 3). Utilice los medios de cultivo de tejidos como un control negativo. NOTA: Con el fin de evitar la reactividad cruzada, se recomienda no utilizar los mismos pozos que contienen hepatisferas 3D para probar diferentes actividades CYP P450, sino para realizarlas en pozos individuales.</li>
		<li>Incubar células durante 24 h a 37oC.</li>
		<li>Recoja los sobrenatantes con una punta de pipeta P100 y lleve a cabo el ensayo según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Mida los niveles relativos de actividad basal y normalice la proteína por mg según lo determinado por el ensayo de ácido bicincino (BCA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pruebe la producción de proteínas séricas mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
	<ol>
<li>Sustituya el medio por 1 ml de medio de maduración de hepatocitos frescos complementado con 10 ng/ml de HGF y 20 ng/ml de OSM (número de réplicas n.o 3). Utilice los medios de cultivo de tejidos como un control negativo.</li>
		<li>Incubar células durante 24 h a 37oC.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante usando una punta de pipeta P100 y mida los niveles relativos de producción de proteínas séricas según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Normalizar a por proteína mg según lo determinado por el ensayo BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Inmunocitoquímica
<ol><li>
Preparación de secciones de parafina que contengan hepatosferas.
	<ol>
<li>Lave las hepatóferas tres veces con 1x DPBS.</li>
		<li>Arreglar las hepatóferas con metanol helado durante 30 min.</li>
		<li>Lavar tres veces con 1x DPBS.</li>
		<li>Incrustar las hepatosferas en 300 l de una solución templada de 2% de agarosa disuelta en H2O utilizando un pozo vacío de una placa de 24 pocillos como un molde y dejar que se solidifique durante 30 minutos.</li>
		<li>Incrustar la agarosa que contiene hepatoesferas en parafina.</li>
		<li>Secciona el bloque de parafina que contiene hepatosferas fijas en secciones de 4 m de espesor utilizando un microtome.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desceración y rehidratación de las secciones. NOTA: Utilice soluciones nuevas siempre que sea posible. No utilice soluciones que hayan estado en la cubeta de tinción durante más de una semana.<ol>
<li>Coloque las secciones en un portaobjetos.</li>
		<li>Sumerja el portaobjetos que contiene secciones en una canal de tinción que contenga 300 ml de xileno durante 5 min.</li>
		<li>Repita el paso 5.2.2.</li>
		<li>Sumergir en etanol absoluto durante 20 s.</li>
		<li>Sumergir en etanol al 95% durante 20 s.</li>
		<li>Sumergir en etanol al 90% durante 20 s.</li>
		<li>Sumergir en etanol al 80% durante 20 s.</li>
		<li>Sumergir en 70% etanol durante 20 s.</li>
		<li>Rehidrata las secciones con agua durante 5 min. NOTA: Mantenga las diapositivas en el mismo portaobjetos y muévalas de una vaguada de tinción a la siguiente. El volumen utilizado (generalmente 300 ml) depende del tamaño de la canal de tinción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperación de antígenos de secciones de parafina que contienen hepatoesferas.
	<ol>
<li>Secciones termoenceradas y rehidratadas en 1 solución tampón Tris-EDTA (TE) pH 9.0 durante 15 min en microondas a 800 W.</li>
		<li>Enfríe las muestras sumergiéndolas en agua del grifo durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining.
	<ol>
<li>Incubar diapositivas con solución de bloqueo hecha de PBS con 0.1% polisorbato 20 (PBS/T)/10% BSA durante 1 h a RT.</li>
		<li>Sustituya la solución de bloqueo por el anticuerpo primario adecuado diluido en PBS/T/1% BSA e incubar a 4oC con una agitación suave durante la noche.</li>
		<li>Lave las células con PBS/T durante 5 min y repita tres veces.</li>
		<li>Incubar con el anticuerpo secundario adecuado diluido en PBS/T/1% BSA e incubar en la oscuridad a RT durante 1 h con agitación suave. NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios optimizados se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
		<li>Lave las células con PBS/T durante 5 min y repita tres veces.</li>
		<li>Añadir 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante y colocar un cubreobjetos de vidrio suavemente para reducir las burbujas de aire. Mantenga las células fijas a 4 oC en la oscuridad. Observe la tinción bajo un microscopio con el filtro adecuado y la lámpara fluorescente. NOTA: Almacene las placas a 4 oC en la oscuridad hasta la toma de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

David C. Hay es cofundador y accionista de Stemnovate Ltd y HigherSteaks Ltd. El resto de los autores certifican que no tienen conflictos de intereses en el tema o materiales discutidos en este artículo.

El desarrollo de sistemas definidos y libres de xeno para producir hepatoesferas humanas en 3D es necesario tanto para los esfuerzos in vitro como in vivo. En la actualidad, la mayoría de los enfoques de diferenciación de hepatocitos de células madre pluripotentes humanas se realizan en cultivos adherentes bidimensionales. Estos ambientes carecen de muchas de las señales ambientales involucradas en la génesis de tejidos y homeostasis que incluyen; interacciones celulares heterotípicas, producción y remodelación de matrices, lo que resulta en una mala traducción a la biología in vivo18,19.
Como resultado, la investigación se ha centrado en enfoques alternativos para generar hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes. Varios estudios 3D han avanzado en el campo, pero éstos dependen de productos animales20,22,24 para proporcionar apoyo y / o requieren el uso de tejido humano21,22 que complica escalatecnológica y compromete la reproducibilidad experimental y la aplicación.
El procedimiento descrito en nuestro artículo (Figura1) es definido, eficiente, altamente reproducible y rentable, permitiendo la producción de esferas hepáticas funcionales, que permanecen funcionales durante un año in vitro y proporcionan apoyo hepático crítico en vivo14. Es importante destacar que esta plataforma permite al usuario controlar el tamaño de las esferas hepáticas 3D, limitando la formación de centros necróticos densos y la pérdida de fenotipo.
La transferencia de las hepatóferas 3D a las placas recubiertas de poli-HEMA representa un paso crítico en este protocolo. Es importante pipetear suavemente en esta etapa del procedimiento para evitar dañar la esfera. Además, los cambios de medios deben realizarse cuidadosamente para evitar la tensión de cizallamiento y la distorsión de la estructura de la esfera.
En estos estudios, las hepatóferas 3D mostraron una estructura organizada (Figura2 y Figura3), función del citocromo P450 (Figura4)y proteínas hepáticas secretadas, incluida la albúmina y la alfa-fetoproteína (Figura5). Este procedimiento se ha realizado con éxito en cuatro líneas de células madre pluripotentes con resultados comparables. De cara al futuro, esta tecnología podría emplearse como plataforma para desarrollar más tejidos endodérmicos y mesenquimales con arquitecturas complejas.

La capacidad de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) para autorenovarse, conservando al mismo tiempo la pluripotencia, brinda la oportunidad de producir tipos de células humanas y tejidos bajo demanda. hPSCs se han diferenciado eficientemente en células similares a hepatocitos (HHL) utilizando sistemas de cultivo adherente bidimensionales (2D)1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Estos sistemas se han utilizado para modelar con éxito la enfermedad monogénica, el ciclo de vida del virus, la lesión hepática inducida por medicamentos (DILI), la exposición fetal a toxinas y la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Sin embargo, estos modelos poseen algunos inconvenientes, que limitan su uso rutinario. Estos incluyen la expresión del marcador fetal, el fenotipo inestable y la mala arquitectura tisular16,17,18,19, que también podría limitar la extrapolación a la función del órgano in vivo.
Para superar estas limitaciones, se han desarrollado plataformas de diferenciación tridimensionales (3D) para imitar la arquitectura de tejido in vivo. Aunque permiten, esos enfoques se basan en el uso de productos y matrices derivados de animales para impulsar la génesis de los tejidos20,21,22, limitando el escalado y la aplicación generalizada.
Aquí, detallamos procedimientos para generar grandes cantidades de hepatósferas 3D a partir de hPSCs utilizando materiales definidos y autoensamblaje celular. En particular, el tejido generado por nuestro procedimiento permanece funcional durante más de un año en el cultivo celular y es capaz de apoyar la función hepática in vivo23.
En resumen, nuestro enfoque de diferenciación definido permite la generación de hepatosferas humanas estables tanto a partir de células madre embrionarias humanas (HESC) como de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Creemos que el procedimiento descrito representa un avance significativo en la generación de hepatoesferas 3D para la investigación científica básica y aplicada.

<table><tbody><tr><td><Cultivo celular fuerte>y ensayos funcionales</Suplemento ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fisher</td><td>Bioreactivos</td><td>10766834</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>DPBS con ThermoFisher de Calcio y Magnesio</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>Reactivo suave para la disociación celular</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Tecnologías de vida&nbsp;</td><td>&nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Activina Humana A&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Fetoproteína Humana ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Factor de Crecimiento Básico Humano Fibrobaslt</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Factor Epitelial Humano</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de hepatocitos humanos</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina Humana M&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Laminina Recombinante Humana 521&nbsp;</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento vascular humano</td><td>Bio-techne</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Reemplazo de suero knockout&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Micro-moldes esferoides&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z764000</tr><tr><td>mTeSR1 medio&nbsp;</td><td>Tecnologías STEMCELL&nbsp;</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Sistema de ensayo y cribado</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Sistema de ensayo y cribado</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>poli-HEMA (poli 2-hidorraxietilo metacrilato)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante Wnt3a&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr>microondas <tr><td>Microtomo</td><td>Bosch</td><td></td> Leika RM2125RT <td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>Termocientífico</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><fuerte>Anticuerpos primarios</fuerte><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6684&nbsp;</td><td>1:100 (ratón)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>Universidad de Dundee</td><td>Universidad de Dundee</td><td>1:200 (ovejas)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (ratón)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:100 (conejo)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td>1:100 (oveja)</td></tr></tbody></table>

producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

El desarrollo de fuentes renovables de tejido hepático es necesario para mejorar el modelado basado en células, y desarrollar tejido humano para el trasplante. Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC) representan fuentes prometedoras de esferas hepáticas humanas. Hemos desarrollado un método de diferenciación celular libre de suero y definido para generar esferas hepáticas humanas tridimensionales formadas a partir de células madre pluripotentes humanas. Una limitación potencial de la tecnología es la producción de esferas densas con material muerto en su interior. Para evitar esto, hemos empleado la tecnología de micropozo de agarosa en densidades celulares definidas para controlar el tamaño de las esferas 3D, evitando la generación de núcleos apoptoticos y/o necróticos.  En particular, las esferas generadas por nuestro enfoque muestran la función hepática y el fenotipo estable, representando un recurso valioso para la investigación científica básica y aplicada. Creemos que nuestro enfoque podría utilizarse como una tecnología de plataforma para desarrollar más tejidos para modelar y tratar enfermedades humanas y en el futuro puede permitir la generación de tejido humano con arquitectura compleja de tejidos.

Los agregados tridimensionales de la línea de células madre embrionarias (H9) o de la línea de células madre pluripotentes inducidas (P106) se diferenciaron hacia el linaje de hepatocitos utilizando nuestro procedimiento definido (Figura1). Las células madre pluripotentes se prepararon primero hacia el endodermo definitivo antes de la especificación de hepatoblast. Después de esto, los hepatoblastos fueron madurados en hepatoesferas 3D que podrían mantenerse en cultivo hasta por un año23.
Para estudiar la estructura de las esferas 3D, se fijaron, seccionaron y mancharon esferas derivadas de hESC o iPSC de 30 días de edad para detectar la presencia de proteínas expresadas en hepatocitos y células mesenquimales. Se emplearon el factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4) y la vimentina de marcador esmequimal, revelando la presencia de una capa externa compuesta de hepatocitos como células que rodean un núcleo de células mesenquimales (Figura2). Seguimos estos experimentos analizando la expresión de proteínas expresadas en hepatocitos: albúmina, CYP3A y E-cadherina. La inmunomancha reveló que la expresión de estas proteínas estabarestringida a la capa externa de las esferas (Figura 3).
Los análisis funcionales de las hepatóferas se realizaron en los cultivos del día 30. CYP1A2 y CYP3A son enzimas importantes dentro de los hepatocitos funcionales. Su actividad fue evaluada mediante ensayos establecidos. Las hepatósferas derivadas de H9 mostraron una actividad del CYP3A de 220.375 a 74514 proteínas de RLU/mL/mg y una actividad de CYP1A2 de 732.440 a 33.330 RLU/mL/mg (Figura4A). La actividad del CYP3A en las hepatóferas derivadas de P106 fue de 132117 a 43.391 proteínas de RLU/mL/mg y la actividad del CYP1A2 fue de 409.907 a 121.723 rlu/mL/mg (figura4B). En comparación con dos lotes de hepatocitos primarios humanos, las esferas hepáticas 3D mostraron niveles respetables de actividad del CYP10.
El análisis de la síntesis y la secreción de albúmina y alfa-fetoproteína (AFP) reveló que las hepatósferas derivadas de H9 secretaban 683,9 a 84 y 159 a 20 ng/mL/24 h/mg de proteína de albúmina y alfa-fetoproteína, respectivamente (Figura 5A). Considerando que las hepatosferas derivadas de P106 secretan 497 a 41 y 756 a 24 ng/mL/24 h/mg de proteína de albúmina y alfa-fetoproteína, respectivamente (Figura5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> Figura 1 : Procedimiento de diferenciación escalonada para generar hepatoesferas 3D a partir de HESC. Los corchetes azules representan días de diferenciación para los hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> Figura 2 : Reorganización estructural de las hepatosferas 3D. Imágenes representativas de la expresión del factor nuclear de hepatocitos 4 alfa (HNF4 - verde) y vimentina (rojo) en (A) heferas 3D derivadas de H9 y (B) heferas 3D derivadas de P106 y sus correspondientes controles de inmunoglobulina G (IgG) y sus correspondientes controles de inmunoglobulina G (IgG) . Las barras de escala representan 60 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> Figura 3 : Evaluación de la expresión de marcadores hepáticos en hepatósferas 3D. Imágenes representativas de la expresión de marcadores de hepatocitos - albúmina, CYP3A, E-cadherin y sus correspondientes controles igG en (A) H9- y (B) Hepatoesferas 3D derivadas de P106. Barras de escala a 60 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> Figura 4 : Función citocromo P450 en hepatoesferas 3D. Medición de la actividad del citocromo P450 1A2 y 3A en(A) hepatosferas 3D derivadas de H9 y (B) hepatosferas 3D derivadas de P106. Los datos representan la media de tres réplicas biológicas, y las barras de error representan la desviación estándar (SD). La actividad se cita como unidades de luz relativa (RLU) por ml por mg de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> Figura 5 : Análisis de la secreción de proteínas hepatosfera. La secreción de albúmina y alfa-fetoproteína(AFP) se analizó en (A ) hepatosferas 3D derivadas de H9 y (B ) hepatosferas 3D derivadas de P106. Los datos son representativos de tres réplicas biológicas, y las barras de error representan la Proteína SD. Secreted se cita como nanogramos de proteína por ml por 24 h por mg de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Esta metogenética gran cantidad de hepatosferas 3D de células madre pluripotentes humanas utilizando los materiales finos y células de montaje. El principal avance de esta técnica es que permite controlar el tamaño de las esferas hepáticas 3D, limitando la formación de centros necróticos y la pérdida de fenotipo. Demostrando el procedimiento conmigo estará Yu Wang, un post-doctorado en nuestro laboratorio.Prepárese para presentar moldes de agarosa disolviendo dos gramos de agarosa a baja temperatura de fusión en 100 mililitros de agua destilada esterilizada. Caliente cuidadosamente la mezcla en el microondas con agitación de intervalo para disolver completamente la agarosa. Añadir 520 microlitros de la agarosa derretida a un molde de formato 256 y permitir que se solidifique.A continuación, transfiera cada microplaca de agarosa a un solo pozo de una placa de 12 pozos. Añadir 1,5 mililitros de DPBS con calcio y magnesio a cada pozo y pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar las burbujas. Para preparar la suspensión celular, comience aspirando el medio a partir de un cultivo indiferenciado de células madre pluripotentes humanas, o HPSC.Enjuague las células añadiendo cinco mililitros de DPBS a temperatura ambiente, libre de calcio o magnesio y luego retire el tampón. Añadir cinco mililitros de reactivo de disociación celular a las células e incubar a 37 grados centígrados durante seis a ocho minutos. Observe el desprendimiento celular bajo un microscopio y extienda la incubación durante uno o dos minutos adicionales si es necesario.Detenga la reacción eliminando el reactivo de disociación celular y añadiendo cinco mililitros de MT fresco sirven un medio complementado con 10 inhibidores de roca micromolar, Y27632. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar las células. Cuente las células viables con el hemocitociómetro y la tinción azul tripano para calcular el número total de células necesarias.Transfiera el número deseado de células a un tubo de centrífuga estéril de 15 o 50 mililitros y centrífuga a 200 veces G durante cinco minutos para peletizar las células. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en MT servir un medio con 10 inhibidores de roca micromolar para una concentración final de 2,1 millones de células por mililitro. A continuación, salve las células añadiendo 190 microlitros de suspensión celular preparada por micro pozo de agarosa e incubando las micro placas de agarosa a 37 grados centígrados en cinco por ciento de dióxido de carbono durante dos horas.Después de la incubación, añadir un mililitro de T-serve fresco, cálido, un medio con inhibidor de la roca a cada pocillo. Devuelva las placas a la incubadora y déjelas allí durante 24 horas. Al día siguiente, examine la esfera de la formación.Preparar poli-dos hidroxietilo metacrilato o poli-hema recubiertos de pozos disueltos disolviendo dos gramos de poli-hema en 100 mililitros de 95% etanol y agitando la solución durante la noche en una placa caliente de 55 grados Celsius. Al día siguiente, añadir 250 microlitros de la solución a cada pozo de una placa de 24 pozos y secar la placa durante la noche en un horno de 60 grados Centígrados. Iniciar la diferenciación de hepatocitos eliminando cuidadosamente el MT servir un medio de las células previamente sembradas y reemplazándolo por un mililitro de medio de diferenciación de endoderm fresco.Para las células madre embrionarias humanas, refresque el medio cada 24 horas durante tres días. Es importante iniciar la diferenciación de hepatocitos 24 horas después de la siembra para evitar la diferenciación celular espontánea. Después de la inducción definitiva del endodermo, cambie el medio a medio de diferenciación de hepatoblastos durante cinco días.Reemplace el medio cada dos días, realizando el último cambio en el último día de especificación de hepatoblasto. Para transferir las hepatosferas a los pozos recubiertos de poli-hema preparado, lave las células con medio de maduración de hepatocitos y luego agregue un mililitro del medio complementado con 10 nanogramos por mililitro de HGF y 20 nanogramos por mililitro OSM. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo varias veces para levantar las hepatosferas de la micro placa de agarosa y transferirlas a un pozo recubierto de poli-hema.Lavar la microplaca de agarosa con un mililitro del medio de maduración de hepatocitos suplementado y transferir el medio al poli-hema recubierto bien. Usando una pipeta P-100, aspira cuidadosamente el exceso de medio sin eliminar las hepatosferas hasta que quede alrededor de un mililitro de medio en el pozo. Refresque el medio cada 48 horas durante 12 días.Si trabaja con células madre embrionarias, cambie el medio de mantenimiento de hepatocitos en el día 20 eliminando el medio de maduración, lavando las células con medio de mantenimiento y luego agregando un mililitro de medio de mantenimiento suplementado. Después de esto, actualice el medio cada 48 horas. Los cambios inmediatos deben realizarse cuidadosamente para evitar el estrés grave y la distorsión de esta estructura esférica.La tinción de hepatocitos en marcadores mesenquimales se deleita en que las hepatosferas formadas utilizando esta técnica se componen de células hepatocitos que rodean un núcleo de células mesenquimales. Otras proteínas típicamente expresadas en hepatocitos también se encuentran en la capa externa de las esferas. El análisis funcional de las enzimas del citocromo P450 o CYP en cultivos de hepatosfera de 30 días mostró que las esferas 3D muestran niveles respetables de actividad CYP en comparación con los hepatocitos primarios humanos.Además, se puede demostrar que las hepatosferas secretan proteínas hepáticas como la albúmina y la alfa-fetoproteína. Lo más importante a recordar para este protocolo es pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo la solución que contiene hepatosferas 3D al transferirlas a la placa recubierta de poli-hema. Esto ayuda a evitar dañarlos.Una vez dominada, esta metodología permite la generación de esferas hepáticas 3D que permanecen funcionales durante un año in vitro con múltiples aplicaciones en el modelado de fallecidos y la detección de drogas. De cara al futuro, esta tecnología podría emplearse como una plataforma para desarrollar más tejidos entodérmicos y mesenquimales con arquitecturas complejas.

serum-free-production-three-dimensional-human-hepatospheres-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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