Name: Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende el ensayo ATPase acoplado a NADH para cribado semi-alto rendimiento de inhibidores de miosina en formato de 384 pocillos. Este método optimizado evita artefactos comunes y no requiere materiales peligrosos.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares y el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas NS096833 (CAM).

1. Preparación de soluciones de stock y reactivos
<ol><li>Preparar la solución de material de ditilothreitol (TDT) disolviendo la TDT cristalina en agua destilada a una concentración final de 1000 mM. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Prepare la solución de stock ATP disolviendo ATP cristalino en agua destilada a una concentración final de 100 mM. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Preparar 10x nadh tampón que contenga 70 mM 3-(N-morpholino)ácido propanesulfónico (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mM etilenglicol-bis (éter de aminoetilo)-N,N,N,N,N-tetraacético ácido (EGTA), y 3 mM NaN3. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Conservar a 4oC.</li>
	<li>Prepare 1 búfer de miosina que contenga 10 mM MOPS y 0,1 mM EGTA. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Conservar a 4oC. Añadir albúmina sérica bovina (BSA) y TDT a una concentración final de 0,1% (p/v%) y 1 mM, respectivamente, antes de su uso.</li>
	<li>Prepare 1 tampón de actina que contenga 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2y 3 mM NaN3. Ajuste el pH a 7.0 con 1 M de solución NaOH. Conservar a 4oC. Añadir BSA y TDT a una concentración final de 0,1% (p/v%) y 1 mM, respectivamente, antes de su uso.</li>
	<li>Prepare la solución de stock NADH disolviendo NADH cristalino en un búfer NADH de 10x a una concentración final de 5,5 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Prepare la solución de stock PEP disolviendo PEP cristalino en búfer NADH 10x a una concentración final de 50 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Preparar la solución de material LDH disolviendo polvo LDH liofilizado en una mezcla de glicerol y tampón NADH 10x (50%:50%) a una concentración final de 2000 U/mL. Centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína no disuelta presente (7.197 x g, 20 oC, 10 min). Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio con cuidado. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Preparar la solución de stock PK mediante la disolución de polvo PK liofilizado en una mezcla de glicerol y 10x buffer NADH (50%:50%) a una concentración final de 10000 U/ml. Centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína no disuelta presente (7.197 x g, 20 oC, 10 min). Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio con cuidado. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Reconstituir las muestras de miosina ii cardiaca y esquelética liofilizada añadiendo 100 l de agua destilada para obtener soluciones de stock de 10 mg/ml correspondientes a concentraciones de miosina (monoméricas) de 37,9 m y 40,8 m (monoméricas), respectivamente. Para obtener más información, consulte las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Preparar F-actin a partir de polvo de acetona muscular conejo como se describe por Pardee y Spudich25.</li>
</ol>2. Medición de las actividades de ATPase y los efectos inhibitorios de los inhibidores de moléculas pequeñas
<ol><li>Prepare la placa compuesta.<ol>
<li>Disolver compuestos de interés en dimetilsulfóxido de alta calidad (DMSO).</li>
		<li>Cree diluciones seriales 1:2 de quince pasos a partir de una concentración compuesta de 10 mM en DMSO.</li>
		<li>Transfiera las muestras a una placa de polipropileno de 384 pocillos en triplicados (12,5 l cada una) utilizando una pipeta multicanal. Utilice dos filas en la placa compuesta para un compuesto (en lugar de tres columnas) para minimizar el número de pozos potencialmente afectados por los efectos de borde. Utilice los últimos tres pozos de la segunda fila para cada compuesto como control negativo (solo DMSO). No utilice la primera y la última fila de la placa para diluciones compuestas.</li>
		<li>Transfiera DMSO puro a los pozos de la primera fila (reservado para la calibración NADH).</li>
		<li>Utilice la última fila para el control positivo. NOTA: Para-aminoblebbistatin a 4 mM de concentración en DMSO se utilizó aquí.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar 4500 ml de solución de actina diluida de 20 m para cada placa de ensayo (microplaca de poliestireno de pared negra de 384 pocillos) diluyendo la solución de material de actina en tampón de actina. Mezcle bien la solución pipeteando 30 veces arriba y abajo utilizando una pipeta de 5 ml para reducir la viscosidad y la heterogeneidad rompiendo filamentos de actina. Centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína precipitada presente (7.197 x g, 20oC, 10 min). Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.</li>
	<li>Preparar la mezcla maestra que contiene enzimas LDH y PK ("mezcla de enzimas"). Para cada placa de ensayo, combine 171,4 l de solución de LDH, 171,4 l de solución PK y 3189,3 l o 3252,9 l de tampón de miosina para ensayos que involucren miosina muscular cardiaca o esquelética II, respectivamente, en un tubo centrífugo cónico de 15 ml. No agregue miosina en este punto para evitar la agregación y la precipitación.</li>
	<li>Preparar la mezcla maestra que contiene todos los sustratos ("mezcla de sustratos"). Para cada placa, combine 162,1 l de ATP, 162,1 ml de PEP y 324,1 l de solución de NADH en un tubo centrífugo cónico de 15 ml. No agregue actina en este punto para evitar la agregación y la precipitación.</li>
	<li>Cree diluciones seriales 1:2 de siete pasos de NADH para calibración a partir de 250 m.<ol>
<li>Mezclar 12,3 l de solución de nadh con 257,7 l de tampón de miosina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Alícuota 135 l de tampón de miosina en siete tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Transfiera 135 ml de solución desde el primer tubo al segundo y mezcle mediante pipeteo. Repita el proceso hasta llegar altubo 7.</li>
		<li>Utilice el último tubo como control no-NADH (solo búfer).</li>
	</ol></li>
	<li>Mediante una pipeta de 8 canales, transfiera 20 ml de las soluciones de calibración NADH a la primera fila de la placa de ensayo en triplicados.</li>
	<li>Añadir 68 ml de cardiaco o 4,2 ml de miosina muscular esquelética II a la mezcla enzimática. Vórtice brevemente.</li>
	<li>Excepto la primera fila, dispensar 8,4 ml de la mezcla de miosina-enzima preparada en cada pocificador de la placa de ensayo utilizando un dispensador automatizado.</li>
	<li>Transfiera 100 nL de soluciones de la placa compuesta a la placa de ensayo que contiene la mezcla enzimática utilizando un sistema automatizado de manipulación de líquidos equipado con un cabezal de herramienta de pasador de 100 nL.</li>
	<li>Agitar la placa de ensayo durante 1 min a temperatura ambiente a 1200 rpm utilizando una coctelera de microplaca.</li>
	<li>Añadir 4.052 ml de la solución de actina centrifugada a la mezcla de sustrato. Vórtice brevemente.</li>
	<li>Dispensar 11,6 ml de mezcla de actina-sustrato en cada pocelo de la placa de ensayo (excepto primera fila) para iniciar la reacción enzimática utilizando un dispensador automatizado.</li>
	<li>Agitar la placa de ensayo durante 1 min a temperatura ambiente a 1200 rpm utilizando una coctelera de microplaca.</li>
	<li>Centrifugar la placa de ensayo a 101 x g durante 30 s.</li>
	<li>Asegúrese de que la temperatura interior del lector de placas se ha estabilizado a 25 oC. Cargue el plato y agite durante otros 30 s. Este paso de agitación es necesario para que la forma de la superficie líquida sea similar en cada pocil y permite tiempo para que la placa alcance la temperatura de medición.</li>
	<li>Registre la fluorescencia NADH durante 30 minutos escaneando la placa en intervalos de 45 s. Utilice un filtro de excitación de ancho de banda de 380 nm y 10 nm y un filtro de emisión de ancho de banda de 470 nm y 24 nm junto con un espejo dicroico de corte de 425 nm. Ejecute la medición en modo de alta concentración. Optimice el número de destellos, la ganancia del detector, las dimensiones de la placa y la altura de medición antes de ejecutar los ensayos. NOTA: Las condiciones finales del ensayo son 300 nM cardiaca/20 nM de miosina muscular esquelética II, 10 M de actina, 40 U/ml LDH, 200 U/mL PK, 220 M NADH, 1 mM de PEP, 1 mM de ATP en un tampón que contiene 10 mM MOPS (pH a 7,0), 2 mM MCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO y 1 mM de TDT. El volumen total es de 20 l/bueno. La concentración de compuesto final más alta es de 50 M. 20 m para-aminoblebbistatin en 0.5% DMSO sirve como el control positivo y 0.5% DMSO solo es el control negativo. Todas las mediciones se realizan en triplicados.</li>
</ol>3. Análisis de datos
<ol><li>Trazar la intensidad de fluorescencia observada contra el tiempo para cada pocal.</li>
	<li>Realice una regresión lineal simple para determinar la pendiente y la interceptación de las respuestas de fluorescencia para cada poca. La pendiente es proporcional a la tasa de consumo de ATP (NADH), mientras que la intercepción es proporcional a la concentración de NADH al principio de la medición (t a 0 s).</li>
	<li>Construir una curva de calibración para NADH trazando las interceptaciones obtenidas para la primera fila de la placa contra la concentración de NADH. Asegúrese de que las interceptaciones dependen linealmente de la concentración de NADH. NOTA: Las interceptaciones estiman las intensidades reales de fluorescencia en t a 0 s con mucha más confianza que la media de la intensidad de fluorescencia bruta que se lee en t a 0 s.</li>
	<li>Realice una regresión lineal simple para obtener la pendiente y la interceptación de la línea de calibración NADH. NOTA: La interceptación describe la señal de fondo de fluorescencia (sin NADH presente), mientras que la pendiente corresponde a la intensidad de fluorescencia extrapolada/teórica de una solución NADH de 1 M en ese experimento en particular.</li>
	<li>Divida la pendiente de la respuesta de fluorescencia obtenida para el resto de los pozos por la pendiente de la línea de calibración NADH para convertir los cambios de fluorescencia en tasas de consumo de ATP.</li>
	<li>Trazar las tasas de consumo de ATP contra la concentración del inhibidor.</li>
	<li>Para determinar las constantes inhibitorias, utilice el software estadístico adecuado para ajustar los datos de dosis-respuesta a la siguiente ecuación cuadrática correspondiente a un modelo de equilibrio vinculante simple uno a uno: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;"> donde Y es la tasa de consumo de ATP, Ymin es la tasa de consumo de ATP int la ausencia de inhibidor, Ymax es la tasa de consumo de ATP teórica en 100% inhibición, KI es la constante inhibitoria , [E]t y [I]t son la concentración total de la enzima (miosina) e inhibidor, respectivamente.</li>
</ol>

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<li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li>
<li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li>
<li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li>
<li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIFC1%3A+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li>
<li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li>
<li>Datta, A., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pasos críticos en el protocolo
Optimice el diseño de la placa ejecutando varias placas con control negativo solamente (reacción ATPase sin inhibidor). Inspeccione los resultados cuidadosamente en busca de patrones en las tasas de reacción. Por ejemplo, estos pueden surgir de efectos de borde y / o imperfecciones en el recubrimiento de superficie hidrófila de placas "no vinculantes". Si se observa un patrón, cambie el tipo de placa y/o el diseño de placa para minimizar los arte...

Las miosinas son transductores de energía mecanoquímicos que hidrolizan trifosfato de adenosina (ATP) para generar movimientodireccional a lo largo de los filamentos del citoesqueleto de actina en eucariotas 1,2. Se han adaptado tanto estructural como cinéticamente a sus diversas funciones intracelulares, como el transporte deorgánulos, la contracción muscular o la generación de tensión citoesquelética 1,2. La superfamilia de miosina está representada por genes de miosina de 40 euros pertenecientes a 12 clases distintas de miosina en el genoma humano3,4. Los miembros de las clases de miosina desempeñan diversos papeles en un conjunto muy diverso de trastornos, como varios tipos de cáncer, trastornos neurológicos, miopatías esqueléticas y cardiomiopatía hipertrófica5,6. Dado el gran número de funciones fisiológicas y patológicas de estos motores moleculares, no es de extrañar que se estén volviendo cada vez más reconocidos como objetivos farmacológicos para una variedad de condiciones7. Recientemente se han realizado progresos significativos en el descubrimiento de nuevos inhibidores de la miosina8,9,10 y activadores11,y para mejorar las propiedades de los existentes12, 13 , 14 , 15.
El ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha utilizado durante mucho tiempo para medir la actividad ATPase de varias enzimas, como la bomba sarcoplasmática reticulum Ca2+ ATPase16, la reparación de ADN ATPase Rad5417, la AAA+ ATPase p9718 o la quinesina motora microtúbula19. El ensayo emplea un ciclo de regeneración ATP. El difosfato de adenosina (ADP) generado por la ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK), que transforma una molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH). Eso, a su vez, oxida una molécula de NADH a NAD. Por lo tanto, la disminución en la concentración de NADH en función del tiempo es igual a la tasa de hidrólisis ATP. El ciclo de regeneración de ATP mantiene la concentración de ATP casi constante y la concentración de ADP baja siempre y cuando PEP esté disponible. Esto da como resultado cursos de tiempo lineales, por lo que es fácil determinar las tasas de reacción inicial y ayuda a evitar la inhibición del producto por ADP19. Aunque el ensayo ATPase acoplado a NADH ya se ha adaptado a un formato de 96 pozos20,los altos volúmenes de reacción (-150 l) lo hacen relativamente caro debido a la alta demanda de reactivos, lo que lo hace menos apto para un cribado rápido de grandes Compuestos. Los métodos alternativos, como el ensayo verde de malaquita19,21, que se basa en la detección del fosfato producido por la enzima ATPase, se demostraron más adecuados para la miniaturización y el cribado de alto rendimiento22 , 23 , 24. Sin embargo, es más probable que un ensayo de punto final se vea afectado por varios artefactos (que se describen a continuación), que pueden permanecer sin descubrir se descubierta en ausencia de cursos de tiempo completo.
Aquí, el ensayo ATPase acoplado a NADH se ha optimizado para la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores de moléculas pequeñas. La miosina muscular esquelética y cardíaca II y los inhibidores de la miosina blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 y para-nitroblebbistatin12 se utilizan para demostrar el poder del ensayo, que se basa en NADH fluorescencia como una lectura. Este protocolo es susceptible de cribado de proyectos centrados en cualquier enzima que produzca ADP.

<table><tbody><tr><td>384 pocillos de brida baja Poliestireno negro de fondo plano Microplaca NBS</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina 5&prime;-trifosfato hidrato de sal disódica)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Aurora FRD-IB Dispensador Aurora</td><td>Discovery, Inc.</td><td></td><td></td>00017425</tr><tr><td>Biomek NXP Estación de trabajo de automatización de laboratorio multicanal</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Síntesis personalizada</td></tr><tr><td>BSA (Albúmina sérica bovina, libre de proteasa)</td><td>Akron Biotech</td><td>AK1391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430 R, refrigerada, con rotor FA-35-6-30</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430, no refrigerada, con rotor A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>TDT (DL-Ditiothreitol)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 Pipeta multicanal ClipTip; formato 384;</td><td>Pipeta multicanal Thermo Scientific</td><td>4672010</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip de 8 canales; formato 96; Thermo</td><td>Scientific</td><td>4672080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA de 8 canales (etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetraacético)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 Lector de placas multietiqueta</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH (L-Lactic Deshidrogenasa del músculo de conejo)</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (cloruro de magnesio hexahidratado)</td><td>&nbsp; Agitador</td> de microplacas Sigma <td>M2670</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>&nbsp; 12620-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, 384 pocillos, PP, Pequeño volumen, Pocillo profundo,</td><td>Greiner Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>trapeadores naturales (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Proteína motora de miosina (longitud completa) (músculo cardíaco bovino)</td><td>Citoesqueleto&nbsp;</td><td>MY03</td><td></td></tr><tr><td>Proteína motora de miosina (longitud completa) (músculo esquelético de conejo)Citoesqueleto</td><td>&nbsp;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH (&beta;-Dinucleótido de nicotinamida y adenina, hidrato de sal disódica reducido)</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (Azida sódica)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (hidróxido de sodio)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Filtro óptico CFP 470/24nm (Emisión)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>Código de barras 240</td></tr><tr><td>Filtro óptico Fura2 380/10nm (Excitación)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>Código de barras 112</td></tr><tr><td>Módulo óptico: Beta Lactamasa</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270</td><td>Código de barras 418</td></tr><tr><td>OriginPro 2017 software</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>para-Aminoblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Síntesis personalizada</td></tr><tr><td>para-Nitroblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>Síntesis personalizada</td></tr><tr><td>PEP (Sal monopotásica de ácido fosfo(enol)Pyruvic Acid)</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK (Piruvato quinasa del músculo de conejo)</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Muscle Acetona Powder Pel</td><td> Congelados Biológicos</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo atpase acoplado a nadh para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Las enzimas ATPase utilizan la energía libre almacenada en el trifosfato de adenosina para catalizar una amplia variedad de procesos bioquímicos endergónicos in vivo que no ocurrirían espontáneamente. Estas proteínas son cruciales para esencialmente todos los aspectos de la vida celular, incluyendo el metabolismo, división celular, respuestas a los cambios ambientales y movimiento. El protocolo presentado aquí describe un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) que se ha adaptado a la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores ATPase de moléculas pequeñas. El ensayo se ha aplicado a la miosina cardiaca y esquelética de miosina II, dos ATPases de motor molecular a base de actina, como prueba de principio. La hidrólisis de ATP se acopla a la oxidación de NADH por reacciones enzimáticas en el ensayo. En primer lugar, el ADP generado por el ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK). PK cataliza la transición de fosfoenolpiruvato (PEP) al piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH), que cataliza la oxidación de NADH en paralelo. Por lo tanto, la disminución de la concentración de ATP está directamente correlacionada con la disminución de la concentración de NADH, que es seguida por el cambio a la fluorescencia intrínseca de NADH. Mientras la PEP esté disponible en el sistema de reacción, la concentración de ADP sigue siendo muy baja, evitando la inhibición de la enzima ATPase por su propio producto. Además, la concentración de ATP se mantiene casi constante, produciendo cursos de tiempo lineales. La fluorescencia se monitorea continuamente, lo que permite una fácil estimación de la calidad de los datos y ayuda a filtrar los artefactos potenciales (por ejemplo, derivados de precipitaciones compuestas o cambios térmicos).

El mapa de diseño de placa típico utilizado para los experimentos de cribado se muestra en la Figura1. La primera y la última fila están reservadas para la calibración de NADH y el control positivo (20 m para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respectivamente. Las filas restantes (B a O) se utilizan para probar la actividad inhibitoria de los compuestos. Aquí, las diluciones seriales 1:2 de quince pasos a partir de una concentración compuesta de 10 mM en...

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Este protocolo es aplicable a una amplia gama de proyectos de cribado destinados al desarrollo de inhibidores de ATPasa, ya sea como sondas para la investigación básica o para posibles compuestos clínicos. Este método se ha optimizado para aplicaciones de cribado de rendimiento semi-alto. También ha sido diseñado para evitar varios artefactos comunes y no requiere el manejo de materiales peligrosos.En nuestro laboratorio hemos estado utilizando este ensayo para desarrollar nuevos y específicos inhibidores de la miosina II no muscular para el tratamiento del trastorno del uso de metanfetaminas. En teoría, este método se puede aplicar fácilmente a cualquier enzima que produzca ATP. La demostración visual ayuda a aclarar todos los detalles técnicos importantes.Para empezar, prepare 4.500 microlitros de 20 micromolares diluidos de actina por cada microplaca de poliestireno negro de 384 pocillos diluyendo la solución concentrada de actina en tampón de actina. Mezclar bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 30 veces para romper los filamentos de actina para reducir la viscosidad y la heterogeneidad. A continuación, centrifugar la solución para eliminar cualquier proteína precipitada presente.Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Preparar la mezcla de enzimas maestras en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros para cada placa de ensayo combinando 3, 252,9 microlitros de tampón de miosina para el ensayo que involucra miosina muscular esquelética II, 171,4 microlitros de solución LDH y 171,4 microlitros de solución PK. Prepare la mezcla de sustrato maestro en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros para cada placa combinando 162,1 microlitros de ATP, 162,1 microlitros de PEP y 324,1 microlitros de solución NADH.No agregue actina en este punto para evitar la agregación y la precipitación. Para crear diluciones seriales de uno a dos pasos de NADH para calibración, prepare ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mezclar 12,3 microlitros de solución de material DE NADH con 257,7 microlitros de tamampón de miosina en el primer tubo para hacer una solución de 250 micromolares.A continuación, aliquot 135 microlitros de tamampón de miosina en cada uno de los siete tubos restantes. Transfiera 135 microlitros de la solución desde el primer tubo al segundo y mezcle por pipeteo. Repita hasta llegar al séptimo tubo.Utilice el último tubo como control sin NADH con solamente buffer. Incluya siempre controles positivos y negativos en placas compuestas y diluciones NADH para calibración en placas de ensayo. Estos controles son extremadamente importantes para identificar artefactos durante el análisis de datos.Con una pipeta de ocho canales, transfiera 20 microlitros de las soluciones de calibración NADH a la primera fila en triplicados en una placa de ensayo. Ahora agregue 4.2 microlitros de miosina del músculo esquelético II a la mezcla enzimática. Vórtice brevemente.Añadir miosina a la mezcla enzimática justo antes de dispensar. La incubación prolongada de soluciones de miosina diluida puede resultar en la pérdida de actividad debido a la precipitación, y la unión inespecífico a las superficies de plástico. Cargue la mezcla de enzimas de miosina preparadas en uno de los recipientes de muestra de un dispensador automático.En la placa, a excepción de la primera fila, dispensar 8,4 microlitros de la mezcla de enzimas de miosina en cada pote de ensayo. A continuación, coloque la placa de ensayo y la placa compuesta en los posicionadores de material de laboratorio de un sistema automatizado de manipulación de líquidos que está equipado con un cabezal de herramienta de 100 nanter. A continuación, ejecute el método adecuado en el software para transferir 100 nanolitros de soluciones desde la placa compuesta preparada a la placa de ensayo.A continuación, coloque la placa de ensayo en una coctelera de microplacas para agitar durante un minuto a temperatura ambiente a 1.200 rpm. Añadir 4.052 microlitros de la solución de actina centrifugada a la mezcla de sustrato y al vórtice brevemente. Para iniciar la reacción enzimática, dispensar 11,6 microlitros de mezcla de sustrato de actina en cada pozo de la placa de ensayo utilizando un dispensador automático, excepto la primera fila.En un agitador de microplacas, agitar la placa de ensayo durante un minuto a temperatura ambiente a 1.200 rpm. Centrifugar la placa de ensayo a 101 g durante 30 segundos. Utilice un filtro de excitación de ancho de banda de 380 nanómetros y ancho de banda de 10 nanómetros y un filtro de emisión de ancho de banda de 470 nanómetros junto con el espejo dicroico de corte de 425 nanómetros para los ensayos.Optimice el número de destellos, la ganancia del detector, las dimensiones de la placa y la altura de medición antes de ejecutar los ensayos. Ejecute la medición en modo de alta concentración. Asegúrese de que la temperatura interior del lector de placas se haya estabilizado a 25 grados centígrados.Cargue la placa en el lector de placas y agite durante otros 30 segundos para hacer que la forma de la superficie líquida sea similar en cada pozo y permitir que la placa alcance la temperatura de medición. Escanee la placa en intervalos de 45 segundos y registre la fluorescencia NADH durante 30 minutos. Con los datos exportados, trazar la intensidad de fluorescencia observada contra el tiempo para cada pozo.Realice una regresión lineal simple para determinar la pendiente y la interceptación de las respuestas de fluorescencia para cada pozo. La pendiente es proporcional a la tasa de consumo de NADH que se puede utilizar como una muy buena aproximación de la tasa de consumo de ATP. La interceptación es proporcional a la concentración de NADH al principio de la medición.A continuación, construya una curva de calibración para NADH trazando las interceptaciones obtenidas para la primera fila de la placa contra la concentración de NADH. Las interceptaciones estiman las intensidades reales de fluorescencia al principio con mucha más confianza que el promedio de la intensidad de fluorescencia cruda se lee al principio. Realice una regresión lineal simple para obtener la pendiente y la interceptación de la línea de calibración NADH.Aquí, las interceptaciones describen la señal de fondo de fluorescencia sin NADH presente, mientras que la pendiente corresponde a la intensidad teórica extrapolada de fluorescencia de una solución NADH de un molar. Para convertir los cambios de fluorescencia en las tasas de consumo de ATP, divida la pendiente de la respuesta de fluorescencia obtenida para el resto de los pozos por la pendiente de la línea de calibración NADH. A continuación, trazar las tasas de consumo de ATP contra la concentración del inhibidor.Para determinar las constantes inhibitorias, utilice cualquier software estadístico adecuado capaz de ajustar la curva no lineal, como Origin 2017. Seleccione el ajuste de curva no lineal para ajustar los datos de dosis-respuesta a una ecuación cuadrática correspondiente a un modelo de equilibrio de unión simple uno a uno. Y es la tasa de consumo de ATP.Mínimo Y es la tasa de consumo de ATP en ausencia de inhibidor. Y-máximo es la tasa teórica de consumo de ATP en 100%inhibición. t y t son la concentración total de la enzima e inhibidor de la miosina, respectivamente.KI es la constante inhibitorio. En este estudio, las reacciones de miosina II de miosina esquelética y cardiaca ATPasa mostraron trazas lineales de intensidad de fluorescencia independientemente de la miosina utilizada o la presencia de inhibidores. Las tasas de ATPasa basales y activadas por actina mostraron dependencia lineal de la concentración de miosina de cribado esquelética o cardiaca II.A o factor Z de 0,78 indicaron un ensayo fiable con controles positivos y negativos muy bien separados.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin, y para-Nitroblebbistatin mostraron curvas regulares de dosis-respuesta en o por debajo de sus valores de solubilidad reportados. Las constantes inhibidoras para los IIs de miosina cardiaca y esquelética se determinaron ajustando una ecuación cuadrática que representa un modelo de unión de equilibrio simple a los datos. Los rastros de intensidad de fluorescencia para la blebbistatina obtenida en un ensayo de ATPase utilizando miosina muscular esquelética II mostraron una señal normal de disminución lineal dependiendo de la cantidad de inhibidor presente.Sin embargo, por encima de la solubilidad de la blebbistatina se observó un aumento inesperado de la señal probablemente debido a la formación de cristales de blebbistatina brillantemente florescente. En el caso de para-Nitroblebbistatina con trazas normales de intensidad de fluorescencia cruda, las tasas de reacción obtenidas por encima de la solubilidad se desviaron de la curva de dosis-respuesta determinada debido a la precipitación. Mediante el uso de este método, hemos desarrollado nuevos, potentes, y selectivos inhibidores de la miosina que podrían ser utilizados como herramientas científicas en la investigación básica o como candidatos directos en el futuro.Siempre se recomienda utilizar un ATPase diferente u otro ensayo funcional específico de la enzima de interés para distinguir entre golpes positivos reales y falsos. Todas las proteínas unen superficies plásticas. Este problema puede afectar altamente a los resultados, especialmente si la proteína está presente a bajas concentraciones.Evite siempre el manejo innecesario de líquidos y utilice tubos que no sean de unión. Los ensayos alternativos de ATPasa generalmente requieren el manejo de ácido sulfúrico, sustancias tóxicas o materiales radiactivos. Por el contrario, el ensayo ATPase vinculado a NADH requiere reactivos con poca toxicidad o muy baja.

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Investigación

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Bioquímica

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

Kinesins se caracterizan por la interacción dependiente de nucleótidos con los microtúbulos: un ciclo de recambio de ATP acoplada a un ciclo de la interacción de los microtúbulos. A continuación, describimos los protocolos para analizar la cinética de las transiciones de nucleótidos individuales en el ciclo de recambio de ATP de un kinesina utilizando nucleótidos marcados con fluorescencia y fluorescencia de flujo detenido.

El uso de nucleótidos Stopped-Flow Fluorescencia y etiquetadas para Analizar el Ciclo de Facturación ATP de Kinesins

La interacción entre los canales HCN y su subunidad auxiliar ha sido identificado como un objetivo terapéutico en el trastorno depresivo mayor. Aquí, un método basado en la polarización de fluorescencia para identificar inhibidores de molécula pequeña de esta interacción proteína-proteína, se presenta.

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. Se proporcionan protocolos para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de dilución de salto y ensayos en células enteras de E. coli.

Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

SAMHD1 es una trifosfofosfato trifosfohidrolasa desoxinucleósido con funciones críticas en la salud y la enfermedad humanas. Aquí presentamos un ensayo versátil de actividad de SAMHD1 acoplado a enzimas, desplegado en un formato de microplaca de 384 pocillos, que permite la evaluación de moléculas pequeñas y análogos de nucleótidos como sustratos, activadores e inhibidores de SAMHD1.

Un ensayo de actividad acoplada a enzimas de alto rendimiento para sondear la interacción de moléculas pequeñas con la dNTPasa SAMHD1

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Este protocolo describe un ensayo bioquímico de cambio de gel para medir la actividad de FEN1 (endonucleasa 1 de colgajo) y el desarrollo de inhibidores.

Detección basada en fluorescencia de la actividad de la nucleasa FEN1 y cribado de inhibidores de moléculas pequeñas

Aprende el ensayo ATPase acoplado a NADH para cribado semi-alto rendimiento de inhibidores de miosina en formato de 384 pocillos. Este método optimizado evita artefactos comunes y no requiere materiales peligrosos.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas (Video) | JoVE Journal

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

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