Name: Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a estudiar el crecimiento de neuritas en neuronas corticales de rata mediante cotransfección con EGFP. Este protocolo mejora la eficiencia de transfección y permite identificar dianas terapéuticas para neurodegeneración.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), el esquema de subvenciones directas CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust.

Todos los procedimientos seguidos se ajustaron a las normas éticas del comité de ética de experimentación animal de la Universidad China de Hong Kong.
1. Preparación de Coverslips
<ol><li>Coloque un cubreobjetos circular escorazado de 18 mm en cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.</li>
	<li>Cubra el cubreobjetos con una solución de poli-D-lisina de 5 g/ml en una incubadora humidificada de 37 oC durante al menos 1 h.</li>
	<li>Aspirar la solución de poli-D-lisina de la placa de cultivo de tejido y enjuagar los cubrecubiertas recubiertos una vez con agua estéril.</li>
</ol>2. Disección de neuronas embrionarias de rata
<ol><li>Sacrificar una rata Sprague-Dawley embarazada embarazada a una edad gestacional de 18 días (E18) por luxación cervical o asfixia porCO2. NOTA: Consulte la normativa local para el sacrificio de ratas embarazadas.</li>
	<li>Abra la cavidad abdominal de la rata embarazada con tijeras disalizantes y transfiera el útero a un plato Petri de 10 cm.</li>
	<li>Abra el útero y el saco amniótico cuidadosamente con pequeñas tijeras disembrantes y retire la placenta del embrión de rata usando tijeras disecantes pequeñas. Transfiera todo el embrión a una placa Petri de 10 cm con solución salina tamponada de fosfato preenfriado suplementada con glucosa (PBS-glucosa, fosfatos sódicos de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro sódico de 140 mM y glucosa de 3 g/L) utilizando un par de pequeños fórceps.</li>
	<li>Corta a lo largo de la sutura sagital del cráneo y ábrela cuidadosamente con un par de tijeras disecuentes pequeñas. Transfiera el cerebro embrionario con una pequeña espátula plana a una placa Petri de 10 cm con PBS-glucosa helada.</li>
	<li>Separe los dos hemisferios cerebrales del cerebelo y el tallo cerebral usando dos pinzas #5 bajo un microscopio de disección. NOTA: Consulte la referencia12 para la estructura del cerebro de la rata.</li>
	<li>Retire las meninges con las pinzas #5.</li>
	<li>Aísle la corteza de los hemisferios cerebrales con dos pinzas rectas #5.</li>
	<li>Transfiera la corteza aislada a PBS-glucosa helada en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
</ol>3. Cultivo primario de neuronas corticales
NOTA: Todos los procedimientos de los pasos 3 y 4 se realizan dentro de un gabinete de Bioseguridad Clase II.
<ol><li>Asentar la corteza aislada por gravedad a 4 oC durante 5 min y aspirar la PBS-glucosa.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 0,05% de trippsina-EDTA a la corteza aislada y mezclar suavemente tocando e incubar el tejido en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos para permitir la digestión enzimática. Toque suavemente el tubo para mezclar cada 2 minutos.</li>
	<li>Añadir 4 ml de medio de mantenimiento (p. ej., medio neurobasal) a la mezcla de tejido/trippsina. NOTA: Todo el medio de mantenimiento utilizado en este protocolo se complementa con Penicilina-Streptomicina y suplemento B-2713.</li>
	<li>Disociar el tejido suavemente mediante la trituración utilizando una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Pellet las células disociadas por centrifugación a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Repita los pasos 3.5 a 3.7 dos veces.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de mantenimiento.</li>
	<li>Añadir 10 l de solución de Trypan Blue al 00 l de suspensión celular para el recuento de células viables por un hemocitómetro.</li>
	<li>Placa las neuronas a una densidad de 65,000/cm2 (células viables) en 1 ml de medio de mantenimiento por pozo en una placa de 12 pocillos.</li>
</ol>4. Transfección y fijación celular
<ol><li>A los 2 días in vitro (DIV2), transfecto 0,5 g de construcción de EGFP (pEGFP-C1) a neuronas junto con o sin 0,5 g de PDI mediante el uso de 1 l de reactivo de transfección (p. ej., Lipofectamine 2000). Siga las instrucciones del fabricante. NOTA: Las construcciones de expresión de mamíferos se prepararon utilizando un kit de preparación de plásmido libre de endotoxinas. El tratamiento con productos químicos/moléculas (en este manuscrito se utilizaron citoclasina D (Cito D) y factor de crecimiento nervioso (NGF)) a las 6 h después de la transfección.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo 24 h después de la transfección y lavar las células transfectótas una vez con PBS de 37 oC (10 mM de fosfatos sódicos, 2,68 mM de cloruro de potasio, 140 mM de cloruro sódico).</li>
	<li>Fijar las células con 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las células fijas tres veces con PBS.</li>
	<li>Agregue una cantidad mínima de medio de montaje de fluorescencia en una diapositiva de vidrio del microscopio. Transfiera cuidadosamente el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos al medio de montaje con la muestra mirando hacia el portaobjetos de vidrio. NOTA: Selle el borde de la cubierta con esmalte de uñas si se utiliza un medio de montaje acuoso.</li>
</ol>5. Medición del crecimiento de Neurita
<ol><li>Utilice un objetivo de 40x para capturar imágenes utilizando un microscopio epifluorescente.</li>
	<li>Captura imágenes de al menos 40 neuronas intactas con señal EGFP por transfección.</li>
	<li>Abra la imagen capturada en el software ImageJ con el plugin NeuronJ11 para medir la longitud de la neurita más larga, desde el cuerpo celular hasta la punta del cono de crecimiento, de cada neurona con imagen.</li>
	<li>Analizar los datos obtenidos con el software para determinar el efecto de las proteínas objetivo en el crecimiento de neurita.</li>
</ol>

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<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Como se ha dicho antes, PC12 y sus subclones son ampliamente empleados para el estudio de la extensión de neurita porque tienen una excelente eficiencia de transfección2,3. Por el contrario, las neuronas primarias tienen una baja tasa de transfección, que es un obstáculo importante para el estudio de los reguladores de crecimiento de neurita por transfección7. Aquí, describimos un protocolo conveniente para cuantificar el crecimiento de ne...

Los neuritas, incluyendo axones y dendritas, son las proyecciones de las neuronas implicadas en el establecimiento de las redes neuronales. El crecimiento dinámico de los neurótesis es esencial para el neurodesarrollo. Sin embargo, los mecanismos reglamentarios subyacentes que hay debajo siguen sin estar claros. En particular, el daño de neurita se observa a menudo en varias enfermedades neurodegenerativas y después de lesiones cerebrales1. Por lo tanto, la investigación de los roles de las moléculas putativas en varias vías reguladoras de crecimiento de neurita mejoraría nuestra comprensión del proceso. Por otra parte, puede revelar nuevas dianas terapéuticas para diversos trastornos neurológicos. Las líneas celulares neuronales son modelos valiosos para estudiar los procesos neuronales, incluido el crecimiento de neurita, ya que son fáciles de manipular y transfectar2,3. Sin embargo, se ha informado que la deriva genética ocurre en algunas líneas celulares de uso común, lo que podría conducir a variaciones en sus respuestas fisiológicas4. Además, se ha demostrado la expresión diferencial de proteínas entre las líneas celulares neuronales y las neuronas primarias. Por ejemplo, PC12, una línea celular neuronal derivada de la glándula suprarrenal de rata que se utiliza ampliamente para el estudio de crecimiento de neurita2,3, no expresa los receptores NMDA5. Además, se ha propuesto que la menor capacidad de respuesta de la línea de neuroblastoma de ratón neuro-2a a las neurotoxinas en comparación con las neuronas primarias se debe a la falta de expresión de ciertos receptores de membrana y canales iónicos6. Por lo tanto, las neuronas primarias son un modelo más deseable y representativo para la investigación del crecimiento de neurita. Sin embargo, el uso de neuronas primarias se ve obstaculizado por su baja eficiencia de transfección7.
Aquí, describimos un método que implica la co-transfección de la proteína de interés (POI) y EGFP a las neuronas corticales de rata primarias. El EGFP actúa como un marcador morfológico para la identificación de las neuronas transpiradas con éxito y permite la medición de neurítos. Validamos este método mediante el uso de compuestos/moléculas que se han informado para modular el crecimiento de neurita. Además, FE65, una proteína adaptadora neuronal que se ha demostrado para estimular el crecimiento de neurita, se utilizó para ilustrar este enfoque8,9. Este protocolo implica (1) el aislamiento de las neuronas corticales primarias de embriones embrionarios embrionarios embrionarios embrionarios del día 18 (E18), (2) la co-transfección de neuronas con EGFP y el PDI (FE65 en este estudio) y (3) la toma de imágenes y el análisis de las neuronas mediante el procesamiento de imágenes software ImageJ con el plugin NeuronJ10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 pinzas</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cubrecírculos Desliza</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Invitrogen PHZ1063</td><td></td><td>Disuelto en DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección, 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección, 12,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plásmido Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de fluorescencia</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfección Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Proteína de ratón nativa</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Pinzas utilitarias, 10 mm, punta recta</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>Consulte las referencias 8 y 15</td></tr><tr><td>PBS Tabletas</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), fenol </td><td>Gibco</td><td>rojo 25300062</td><td></td></tr><tr><td>solución azul de tripano, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

El crecimiento de neurita es un evento fundamental en la formación de los circuitos neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso. El daño grave a la neurita y la disfunción sináptica ocurren en diversas enfermedades neurodegenerativas y en la degeneración relacionada con la edad. La investigación de los mecanismos que regulan el crecimiento de las neuritas no sólo arrojaría una valiosa luz sobre los procesos de desarrollo cerebral, sino también sobre estos trastornos neurológicos. Debido a la baja eficiencia de transfección, actualmente es difícil estudiar el efecto de una proteína específica en el crecimiento de neurita en las neuronas primarias de mamíferos. Aquí, describimos un método simple para la investigación del crecimiento de neurita por la co-transfección de neuronas corticales de rata primaria con EGFP y una proteína de interés (POI). Este método permite la identificación de las neuronas transfectó el PDI a través de la señal EGFP, y por lo tanto el efecto del PDI en el crecimiento de neurita se puede determinar con precisión. Este ensayo basado en el EGFP proporciona un enfoque conveniente para la investigación de vías que regulan el crecimiento de las neuritas.

Para probar esta metodología, utilizamos Cyto D y factor de crecimiento nervioso NGF, que se ha demostrado para inhibir y estimular el crecimiento de neurita respectivamente14,15,16. La longitud de neurita de las neuronas transtrófilos o infectadas por la EFP se midió después del tratamiento con Cito D o NGF. La eficiencia de transfección de EGFP a las neuronas fue del 2,7% (1.068 neuronas contad...

En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.

Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

La baja eficiencia de la transfección es un obstáculo importante para determinar cómo la proteína reactiva el crecimiento de la neurita en las neuronas primarias. Nuestro protocolo supera este problema mediante la correfección conjunta de EGFP para identificar con éxito las células trans infectadas. La alta tasa de co-transfección de EGFP y las proteínas de interés aseguran la exactitud del ensayo.Y en consecuencia, ahora se requiere tinción de inmunofluorescencia. Como el crecimiento de la neurita ocurre durante la regeneración neuronal, este método se puede aplicar a la identificación de nuevos objetivos para restaurar la red neuronal dañada en trauma cerebral o enfermedades neurodegenerativas. Antes de comenzar el procedimiento, coloque un cubreobjetos circulares estéril de 18 milímetros en cada pocódito de una placa de cultivo de tejido de 12 pozos y cubra cada cubrelobjetos con cinco microgramos por milímetro de solución de poli-D-lisina en una incubadora humecida de 37 grados Centígrados durante al menos una hora.Al final de la incubación, aspirar la solución de poli-D-lisina y enjuagar los cubreobjetos con agua estéril. En el día embrionario 18, coloque el útero cosechado de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de la proteína verde fluorescente (GFP) de etiquetado proteínas en células cultivadas. Se examinaron las fracciones móviles / inmóviles de la GFP mediante el análisis del porcentaje de recuperación después de fluorescencia photobleaching. En este estudio, FRAP llevó a cabo en las espinas de las neuronas del hipocampo.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

En este video, describimos un método basado en luminiscencia para evaluar la neurotoxicidad de los compuestos de moléculas pequeñas promotores del crecimiento de neuritas en la viabilidad de las neuronas derivadas de hNPC. El ensayo mide el nivel de ATP intracelular, un indicador de la viabilidad celular, para evaluar la neurotoxicidad después del tratamiento con compuestos de ensayo.

Ensayo basado en luminiscencia para evaluar la neurotoxicidad de los compuestos de ensayo en las neuronas

En este video, demostramos un ensayo de inmunofluorescencia basado en EGFP para identificar la eficacia de las proteínas diana en el crecimiento de neuritas de las neuronas corticales primarias. Las neuronas primarias se transfectan con una proteína fluorescente, EGFP, y una proteína diana, y luego se realiza un inmunoensayo para investigar el efecto de la proteína diana en el crecimiento de las neuritas.

Ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el efecto de las proteínas diana en el crecimiento de neuritas

Morfogénesis neuronal y la migración son eventos cruciales que subyacen el desarrollo adecuado del cerebro. Aquí se describen los métodos para manipular genéticamente las neuronas granulares de cerebelo en cultivo y el cerebelo en desarrollo para la evaluación de la morfología y las características migratorias de las neuronas.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.

Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

Aprende a estudiar el crecimiento de neuritas en neuronas corticales de rata mediante cotransfección con EGFP. Este protocolo mejora la eficiencia de transfección y permite identificar dianas terapéuticas para neurodegeneración.

Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias (Video) | JoVE Journal

Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

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