Name: Purificación del S100A12 humano y sus oligomeros inducidos por iones para la estimulación celular inmune (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a purificar la proteína S100A12 humana y sus oligómeros inducidos por iones mediante cromatografía de exclusión molecular. Este método libre de endotoxinas permite estudios funcionales en monocitos para investigación inmunológica.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones del programa de investigación médica innovadora intramuros de la facultad de medicina de la Universidad de Muenster (KE121201 a C.K.) y la Fundación Alemana de Investigación (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).

NOTA: Consulte la Tabla Suplementaria 1 para la preparación de tampones y soluciones de stock.
1. Expresión de proteínas en E. coli
<ol><li>
Clonación
	<ol>
<li>Clonar sin etiquetas s100A12 (secuencia de referencia NCBI: NP_005612.1) en vector de expresión bacteriana pET11b. Para expresar la proteína, transforme la construcción en E. coli BL21(DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura
	<ol>
<li>Preparar un cultivo inicial inoculando una sola colonia en 5 ml de medio de crecimiento (caldo LB con ampicilina de 100 g/ml) en un tubo de fondo redondo de 14 ml. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 220 rpm. Transfiera 2 x 4 ml de cultivo nocturno a 400 ml de medio de crecimiento en un matraz Erlenmayer de 2 L e incubar el cultivo a 37 oC con agitación a 220 rpm. NOTA: La densidad inicial del cultivo principal debe ser la densidad óptica a 600 nm (OD600) a 0,1.</li>
		<li>Supervise el OD600 durante el crecimiento. Inducir la expresión de proteína mediante la adición de 1 M isopropyl-a-D-thiogalactopyranosid (IPTG) a una concentración final de 1 mM a OD600 a 0,5 x 0,6. Incubar a 37oC y 220 rpm por 4 h adicionales. NOTA: En general, se alcanzará una DoT600 de 0,6 después de 1,5 x 2,5 h a 37 oC.</li>
		<li>Preparar el tampón de sonicación de 50 ml disolviendo 50 mM Tris, 50 mM NaCl y 1 mM de ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) en 40 ml de agua desionizada. Ajuste el pH con HCl a 8,0 y haga hasta 50 ml. Añadir inhibidor de la proteasa (1 comprimido por solución de 50 ml) y equilibrar el tampón a 4 oC.</li>
		<li>Transfiera el cultivo bacteriano a botellas de centrífuga adecuadas y cosecha las células a 3.200 x g durante 30 min a 4 oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 25 ml de tampón de sonicación helada. A partir de ahora mantén las células en hielo. NOTA: Las celdas resuspendidas se pueden almacenar a -20 oC a corto plazo y a -80 oC a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonicación/lisis
	<ol>
<li>Sonicar las células durante 6 ciclos de 30 s en hielo. Después de cada ciclo, las células de reposo durante 30 a 60 s para proteger las células del sobrecalentamiento.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrifugación de alta velocidad pre-enfriado de 50 ml y centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 15.000 x g durante 30 min a 4 oC. Decantar el lisato transparente que contiene las proteínas citosólicas solubles en un tubo fresco de 50 ml y desechar el pellet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Purificación de proteínas
<ol><li>Cromatografía de intercambio de aniones
	<ol>
<li>Diálisis<ol>
<li>Preparar el tampón A de la cromatografía de intercambio de aniones (AIEX) mediante la disolución de 20 mM Tris, 1 mM EDTA y 1 mM de etilenglicol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'ácido tetraacético (EGTA) en agua desionizada y ajustar el pH a 8.5 con HCl. Para diálisis, prepare 2 x 5 L y para la cromatografía 2x 1 L del tampón AIEX A. NOTA: El volumen de dializado debe ser de aproximadamente 100 veces el volumen de la muestra. Todos los tampones utilizados para la cromatografía deben filtrarse (0,45 m o menos) y desgasificarse (por ejemplo, por baño ultrasónico o desgasificación al vacío).</li>
			<li>Corte el tubo de diálisis (corte del peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) en una longitud adecuada con espacio adicional para el aire para garantizar la flotabilidad de la muestra por encima de la barra de agitación giratoria. NOTA: El glicerol conserva la membrana y debe retirarse antes de su uso.</li>
			<li>Para reducir la viscosidad de la solución proteica aclarada del paso 1.3.2, diluya la solución con 25 ml de tampón AIEX A para facilitar su posterior aplicación a la columna de cromatografía. Fije el primer cierre en el tubo, cargue la muestra en la membrana y conecte el segundo cierre al menos 1 cm del extremo superior del tubo.</li>
			<li>Coloque el recipiente de 5 L con tampón AIEX A en una placa de agitación, agregue una barra de agitación y la membrana llena de solución proteica. Ajuste la velocidad para girar la muestra evitando interferencias con la barra de agitación giratoria. Dialyze para 12 x 24 h a 4 oC, luego reemplace el búfer de dializado (buffer AA A) por una preparación fresca preenfriada y continúe durante al menos 4 horas adicionales. Transfiera la solución de proteína dializada a un tubo de 50 ml y filtre a través de una unidad de filtro de 0,45 m. NOTA: Almacenamiento posible.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cromatografía</li>
		<li>Inicie el sistema de cromatografía líquida (FPLC) con mantenimiento general, conecte los búferes de columna AIEX A y AIEX B (búfer AIEX A con 1 M NaCl) y la resina de intercambio de aniones que contiene la columna. Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros cromatográficos generales. NOTA: Los búferes, la columna y los equipos FPLC deben equilibrarse a la misma temperatura antes de iniciar la ejecución (consulte los parámetros cromatográficos en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4y Tabla 5).</li>
		<li>Equilibrar la columna con el búfer AA, posteriormente cargar la muestra en la columna y eluir las proteínas con un gradiente lineal de 0% a 100% de búfer de alta sal (AIEX B). Refiera al cuadro 2 para un protocolo del método detallado.</li>
		<li>Recoger fracciones de 2 ml durante la elución y analizar 10 ml de cada fracción en una electroforesis de gel de dodecilo sódico 15% manchada de Coomassie (SDS-PAGE). Aunar las fracciones que contienen proteína S100A12 para diálisis. NOTA: El peso molecular de S100A12 es 10,575 Da.</li>
	</ol></li>
	<li>Cromatografía de interacción hidrofóbica dependiente del calcio (HIC)
	<ol>
<li>Diálisis<ol>
<li>Dialyze la solución proteica contra 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 siguiendo el procedimiento descrito en la sección 2.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cromatografía<ol>
<li>Preparar 1 L de tampón de cromatografía HIC A disolviendo 20 mM Tris, 140 mM NaCl y 25 mM CaCl2 en agua desionizada y ajustar el pH a 7.5. Para el buffer HIC B, disuelva 20 mM Tris, 140 mM NaCl y 50 mM EDTA. Ajuste el pH a 7.0 y filtre y desgasifique los buffers. Añadir CaCl2 a la muestra a una concentración final de 25 mM y filtrar a través de 0,45 m. Equilibrar los tampones HIC y la muestra a 4 oC (temperatura de columna).</li>
			<li>Inicie el sistema de cromatografía líquida con mantenimiento general, conecte los búferes de columna HIC A y B y la columna. Consulte la Tabla 3 para obtener más parámetros cromatográficos.</li>
			<li>Equilibrar la columna, cargue la muestra y extienda el bloque 'lavar la muestra sin enlazar' hasta que la señal UV alcance de nuevo el nivel basal. Luego comience la elución con un quelante de calcio que contenga tampón (EDTA). Refiera al cuadro 4 para un protocolo del método detallado. NOTA: Experimentos anteriores han demostrado que un exceso de calcio parece ser beneficioso para la unión de S100A12 a la resina de cromatografía.</li>
			<li>Recoger fracciones pico de 2 ml y analizar 10 l de cada fracción en un 15% de SDS-PAGE teñido de Coomassie. Piscina pura S100A12 fracciones y dializar contra solución salina con búfer Hepes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) como se describe en la sección 2.1.1. NOTA: El coeficiente de extinción de S100A12 monomérico es 2980 M-1 cm-1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Detección y eliminación de endotoxinas
<ol><li>
Detección de endotoxina
	<ol>
<li>Para determinar la contaminación por endotoxinas, mida las concentraciones de proteína diluida a partir del paso 2.2.2.4. (por ejemplo, 1:10 y 1:100 en HBS) utilizando un ensayo de detección de endotoxinas fluorescentes basado en enzimas (ELISA)(Tabla de materiales). Realice este ensayo siguiendo el protocolo del fabricante. NOTA: Utilice soluciones HBS recién preparadas disueltas en agua desionizada ultrapura para evitar (nuevas) contaminación por endotoxinas por el tampón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminación de endotoxina y concentración de proteína
	<ol>
<li>Cargue 15 ml de muestra en una unidad de filtro centrífugo de 50 kDa y centrífuga a 3.200 x g y 10 oC durante aproximadamente 10 minutos. Lave la membrana del filtro dos veces con HBS para recuperar tanta proteína como sea posible después de cada paso.</li>
		<li>Concentre el flujo que contiene el S100A12 utilizando un filtro centrífugo de 3 kDa hasta que el volumen se reduzca a una quinta parte hasta una décima parte del volumen de carga inicial (centrifugación a 3.200 x g,10 oC durante aproximadamente 30 minutos). Rellene el filtro tantas veces como sea necesario, enjuague la membrana y transfiera la solución concentrada a un tubo nuevo después de cada recarga. Deseche el flujo. Filtrar de nuevo a través de 50 kDa como se describió anteriormente. NOTA: Durante este procedimiento, la pérdida de proteína es notable (hasta un 50%), pero la preparación de proteína restante se agota completamente de LPS. Este método produce alrededor de 10 x 15 mg de proteína de cultivo de 400 ml.</li>
		<li>Ajuste la solución proteica a 1 mg/ml con HBS libre de endotoxinas y mida el contenido de LPS como se describe en el paso 3.1.1. En caso de que la solución proteica aún no se pruebe como libre de LPS (<0.1 EU/mL), elimine las contaminaciones remanentes mediante el uso de una resina de eliminación de endotoxinas. NOTA: Con una concentración proteica de 1 mg/ml, la contaminación de 0,1 LPS de la UE/ml equivale aproximadamente a 0,01 pg LPS/g de proteína.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Reticulación química y separación de oligómero
<ol><li>
Reticulación química
	<ol>
<li>Preparar soluciones de stock altamente puras (libres de endotoxinas) de 1 M CaCl2 y 100 mM ZnCl2 en agua desionizada ultrapura(Tabla de Materiales). Utilice este búfer, recién hecho, para el siguiente paso.</li>
		<li>Incubar 10 ml de S100A12 sin endotoxinas purificado (concentración 1 mg/ml en HBS) durante 30 min a temperatura ambiente (RT) con 25 mM de CaCl2 para dimeric/tetrameric, o 25 mM DeCl2 y 1 mM ZnCl2 para hexámeric/tetrameric S100A12 Oligómeros.</li>
		<li>Preparar el reticontinuaciónr disolviendo 8 mg de BS3 en 500 l de agua libre de endotoxinas directamente antes de su uso (8 mg de reticomaño para solución de proteína de iones de 10 ml equivale a una concentración final de 1,4 mM). Mezclar el reticulante y la muestra mediante pipeteo e incubar durante 30 minutos adicionales a RT. Quemuestre la reacción añadiendo 1 M Tris-HCl, pH 7,5 a una concentración final de 50 mM y filtre a través de 0,45 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cromatografía de exclusión de tamaño
	<ol>
<li>Equilibre la muestra reticulada a 12 oC (temperatura de columna) e inicie el sistema de cromatografía líquida con mantenimiento general. Conecte el búfer de columna (HBS) y la columna de exclusión de tamaño. Consulte el Cuadro 5 para obtener información detallada.</li>
		<li>Equilibrar la columna en HBS, cargar la muestra y recoger fracciones máximas (1 x 2 ml) durante la ejecución. Analice estas fracciones en un Gradiente 4-20% SDS-PAGE y fracciones de piscina con bandas principales del complejo proteico deseado. NOTA: La hidrólisis de reactivos de éster NHS como BS3 en soluciones acuosas da como resultado una fuerte absorbancia a 280 nm. Reticulante sin ataduras (peso molecular: 572 g/mol) eluyera al final de la carrera y da como resultado un pico fuerte.</li>
		<li>Concentre las soluciones utilizando unidades de filtro centrífugos con MWCOs de 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) o 50 kDa (hexamer). Determinar la contaminación por endotoxinas como se describe en la sección 3.1. Si es necesario, retire el LPS restante con una resina de eliminación de endotoxinas siguiendo las recomendaciones del fabricante(Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Pruebas funcionales sobre monocitos
<ol><li>Preparación de monocitos
	<ol>
<li>Aislar a los monocitos de las capas buffy humanas por centrifugación de gradiente de densidad y posterior enriquecimiento de monocitos mediante el uso de un kit de separación de perlas magnéticas(Tabla de materiales). NOTA: Este protocolo resultará en aproximadamente 5 x 7 x 107 monocitos (una capa buffy) con una pureza de 83-95%. Dado que el número, pero también la capacidad de respuesta de las células depende en gran medida del donante, el protocolo puede tener que ser escalado vertical (dependiendo del recuento de células requerido).</li>
		<li>Para la centrifugación de densidad, equilibre la solución de separación (densidad de 1,077 g/ml) a RT y transfiera 20 ml a tubos centrífugos de 50 ml (2 tubos por capa de color adelanto). Diluir la sangre de la capa de color humano con la solución salina tamponada de Hank (HBSS) a un volumen total de 60 ml y capa 30 mL de esta mezcla cuidadosamente en la parte superior del medio de separación. Centrífuga a 550 x g durante 35 minutos en RT. Desactive el freno de centrífuga.</li>
		<li>Después de la centrifugación, las células sanguíneas periféricas mononucleares (PPB) se encuentran directamente en la parte superior del medio de separación. Transfiera estas células en un tubo de centrífuga fresco de 50 ml, haga hasta 50 ml con HBSS y centrífuga a 170 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Llenar el tubo hasta 50 ml y centrifugar a 290 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante de nuevo, resuspender las células en HBSS (50 mL) y centrifugar a 170 x g durante 10 min. Cuente las células y resuspenderlas en el búfer de separación celular(Tabla de materiales< /c9>) a una concentración de 5 x 107 células/ml. NOTA: En lugar de HBSS, la solución salina con búfer de fosfato (PBS) se puede utilizar para lavar las células.</li>
		<li>Para el aislamiento de monocitos de los PMI, utilice un kit de aislamiento de células negativas magnéticas y siga el protocolo del fabricante. Contar monocitos y resuspender en medio de monocitos (RPMI 1640, 15% suero de becerro fetal inactivado por calor [FCS], 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina) a una concentración de 2 x 106 células/ml.</li>
		<li>Para cultivar monocitos, cubra platos de cultivo (por ejemplo, 100 mm) con una película hidrófoba permeable al gas, adecuada para células de suspensión (Tabla de materiales). Esterilice las placas utilizando luz UV durante aproximadamente 30 minutos. Transfiera las células a estas placas de cultivo y déjelas reposar durante la noche a 37 oC y 5% DECO2. NOTA: Utilice 15 x 25 ml de suspensión celular por plato recubierto.</li>
	</ol></li>
	<li>Estimulación de monocitos
	<ol>
<li>Estimulación con S100A12 (tipo salvaje) NOTA: Para distinguir el S100A12 no tratado (producto final de la sección 2.2.2) de la proteína reticulada, S100A12 en lo siguiente se denomina «tipo salvaje».<ol>
<li>Transfiera las células descansadas a un tubo centrífugo de 50 ml y centrífuga a 350 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en medio de estimulación (RPMI 1640, FCS activado por calor al 5%, 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/ estreptomicina) a una concentración de 2 x 106 células/ml.</li>
			<li>Para la estimulación, utilice 24 placas de suspensión de pozo y agregue 250 l de suspensión celular por pozo (0,5 x 106 células/pozo). Añadir 50 g/ml de polimyxina B a los pocillos previstos, seguido de LPS en diferentes concentraciones (25, 50, 100 y 200 pg/mL) o de tipo salvaje S100A12 (10, 20, 40, 60 g/ml). Además, aplicar la proteína ya sea sin tratar o desnaturalizada por calor (99 oC, 10 min) en diferentes concentraciones a las células. NOTA: Un tratamiento térmico corto desnaturaliza la proteína S100A12, pero tiene menos o ningún efecto sobre LPS.</li>
			<li>Incubar placas durante 4 h a 37oC y 5% CO2. Cosecha las células transfiriendo la suspensión celular de cada pozo a tubos de reacción de 1,5 ml. Centrífuga a 500 x g durante 10 minutos. Transfiera los sobrenatantes a tubos nuevos y mida la liberación de TNF en diferentes diluciones (por ejemplo, 1:2, 1:5, 1:10) con un kit ELISA TNF humano siguiendo las recomendaciones del fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Estimulación con oligómeros S100A12<ol>
<li>Preparar y sembrar monocitos en 24 placas de suspensión de pozos como se describió anteriormente. Estimular las células mediante la adición de oligómeros S100A12 desde el paso 4.2.3. en diferentes concentraciones molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM). NOTA: Con el fin de comparar las capacidades de los diferentes oligómeros para estimular los monocitos, los oligómeros se aplicaron a las células en concentraciones molares comparables.</li>
			<li>Incubar durante 4 h a 37oC y 5% deCO2,cosechar las células y medir la liberación de TNF en los sobrenatogros como se ha descrito anteriormente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, describimos la expresión bacteriana libre de etiquetas del S100A12 humano y su purificación, así como la separación en diferentes oligómeros inducidos por iones para la estimulación de células inmunitarias. En comparación con la literatura publicada sobre la purificación de proteínas S100A128,23,24, el uso de caCl2 alto (25 mM) en la cromatografía de interacción hidrofóbica es para nuestro conocimie...

S100A12 es una proteína de unión al calcio que es producida predominantemente por granulocitos humanos. La proteína se sobreexpresa durante la inflamación (sistémica) y sus niveles séricos, particularmente en enfermedades (auto)inflamatorias como la artritis idiopática juvenil sistémica (SJIA), la fiebre mediterránea familiar (FMF) o la enfermedad de Kawasaki (KD) pueden informar sobre actividad de la enfermedad y la respuesta a la terapia. Dependiendo de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como receptores similares a los peajes (TLR), el sistema inmunitario innato puede ser activado por patrones moleculares asociados a patógenos (PamP) como lipopolisacáridos (LPS) o patrones moleculares asociados al daño (DPP; también se denominan "alarmins"). Los DAPP son moléculas endógenas como proteínas celulares, lípidos o ácidos nucleicos1. Las funciones DAMP están bien descritas para los miembros de la familia de proteínas de calgranulina, S100A8/A9 y S100A122, que también se informa que funcionan como péptidos antimicrobianos de iones metálicos divalentes3,4, 5,6. Dependiendo de la resistencia iónica disponible S100A12 puede, al igual que otros miembros de la familia S100, organizarse en diferentes homomultimeros y hasta hace poco se desconocía el impacto del oligomerización S100A12 en la interacción PRR, particularmente TLR4.
La forma monomérica de la proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste en dos estructuras de hélice-bucle-hélice de mano EF conectadas por un vinculador flexible. El C-terminalEF-hand contiene el motivo clásico de unión Ca2+,mientras que el N-terminalEF-hand exhibe una estructura de bucle extendido específica de proteína S100 ('pseudo-EF-hand') y revela una reducción de Ca2+-afinidad. Ca2+-unión por S100A12 puede inducir un cambio de conformación importante en la proteína' C-terminus, que resulta en la exposición de un parche hidrófobo en cada monómero y forma la interfaz de dimerización. Así, en condiciones fisiológicas, la estructura cuaternaria más pequeña formada por S100A12 es un dímero no covalente (aproximadamente 21 kDa) en el que los monómeros individuales están en orientación antiparalela. Cuando se organiza como dimer, S100A12 se divulga para secuestrar Zn2+ así como otros iones de metal divalente, por ejemplo, Cu2+ con alta afinidad7. Estos iones están coordinados en la interfaz de dimer S100A12 por los aminoácidos H15 y D25 de una subunidad y H85, así como H89 de la subunidad antiparalela8,9,10. Mientras que estudios anteriores proponen que Zn2+-cargado S100A12 puede inducir la organización de la proteína en homo-tetrameros (44 kDa) y para dar lugar a un aumento de Ca2+-afinidad11,12, reciente valoración de metal estudios6 sugieren Ca2+-unión por S100A12 para aumentar la afinidad de la proteína a Zn2+. Una vez que las manos EF S100A12 están completamente ocupadas por Ca2+,se cree que Ca2+ adicional se une entre dimers, desencadenando la formación de hexamer (aproximadamente 63 kDa). La arquitectura de la estructura de los barrios hexamíricos es claramente diferente de la del tetrámero. Se propone que la interfaz de los tetrámeros se interrumpa para dar lugar a nuevas interfaces dimer-dimer que benefician la formación de hexamer10. S100A12 es expresado casi exclusivamente por granulocitos humanos donde constituye alrededor del 5% de toda la proteína citosólica13. En su función DAMP S100A12 fue históricamente descrito como agonista del receptor multi-ligand para productos finales de glicación avanzada (RAGE), luego denominado proteína de unión RAGE (EN-RAGE)14. Aunque anteriormente informamos bioquímico S100A12-unión a RAGE y TLR415, recientemente demostramos monocitos humanos para responder a la estimulación S100A12 de una manera dependiente de TLR416. Esto requiere la disposición de S100A12 en su Ca2+/Zn2+-inducida estructura de trimestral hexameric16.
Aquí describimos un procedimiento de purificación para el S100A12 humano recombinante y sus oligómeros inducidos por iones para estimulaciones celulares inmunes16,17. Esto se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que inicialmente incluye una columna de intercambio de aniones para aislar y concentrar la proteína y eliminar las contaminaciones a granel (por ejemplo, endotoxinas/lipopolisacáridos)18. Las resinas de cromatografía de intercambio iónico separan las proteínas sobre la base de diferentes cargas netas de superficie. Para proteínas ácidas como S100A12 (punto isoeléctrico de 5.81), un sistema tampón con un pH de 8.5 y una resina fuerte de intercambio de aniones conduce a una buena separación. Las proteínas enlazadas se eluyen con un gradiente de tampón de alta sal. Con un aumento de iones negativos de fuerza iónica en el tampón de elución competir con las proteínas para las cargas en la superficie de la resina. Las proteínas eluyen individualmente dependiendo de su carga neta y en consecuencia, los tampones descritos en este documento permiten aislar y concentrar la proteína S100A12 sobreexpresada. Debido a grupos cargados negativamente en lipopolisacáridos, estas moléculas también se unen a resinas de intercambio de aniones. Sin embargo, su mayor carga neta resulta en la elución posterior en el gradiente de alta sal aplicado. El segundo paso del procedimiento de purificación se ha introducido con fines de pulido. Esto hace uso de la capacidad de unión al calcio de S100A12 y elimina las impurezas restantes en una columna hidrofóbica-interacción. La unión al calcio de S100A12 conduce a un cambio de conformación y a una exposición de parches hidrófobos en la superficie de la proteína. En esa condición, S100A12 interactúa con la superficie hidrófoba de la resina. Al quelar el calcio por EDTA, esta interacción se invierte. En presencia de iones, especialmente calcio y zinc, S100A12 se organiza en oligómeros homoméricos. Para estudiar las relaciones estructura-función de los diferentes oligómeros, estabilizamos el recombinante dimerico, tetramírico y hexámero S100A12 con un retitulador químico y separamos los complejos en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Por último, para analizar la funcionalidad y la actividad biológica de la proteína purificada y sus oligómeros inducidos por iones, se puede comparar la liberación de citoquinas de S100A12 y lpS estimulado monocitos.
Hasta el momento se han descrito varios métodos para purificar S100A12. 19, por ejemplo, publicaron un protocolo con purificación a través de una columna de intercambio de aniones y una posterior cromatografía de exclusión de tamaño. El pulido de purificación en una columna de exclusión de tamaño da como resultado buenos resultados, pero, por ejemplo, debido a volúmenes de carga limitados, es menos flexible en escalabilidad. Un enfoque diferente, publicado por Kiss et al.20, describe la purificación de la proteína etiquetada a través de la columna de afinidad Ni2+ como el primer paso de purificación, seguido de escisión enzimática para eliminar la etiqueta y otros pasos de purificación. A diferencia de los estudios citados19,20, la proteína producida como se describe en este protocolo se determina para experimentos en células inmunitarias. Por lo tanto, la contaminación por endotoxinas remanentes del cultivo bacteriano es un desafío. Aunque hasta ahora se han descrito diferentes enfoques para la eliminación de endotoxinas, no existe un método uniforme que funcione igual de bien para cualquier solución proteicadada 21,22.
En resumen, nuestro protocolo combina las ventajas de una expresión libre de etiquetas en un sistema bacteriano con eliminación eficiente de endotoxinas y alto rendimiento de proteína pura.

<table><tbody><tr><td>vector pET11b</td><td>Novagen</td><td>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </td></tr><tr><td>BL21(DE3) competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>100x Aminoácidos no esenciales</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&menos; 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels BioRad</td><td></td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Sal sáldica de ampicilina</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis(sulfosuccinimidil)suberate) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio Dihidrato</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Solución Decolorante</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Solución de tinción BioRad</td><td></td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimiento de monocitos humanos</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>Kit de aislamiento de células negativas</td></tr><tr><td>magnéticas EDTA sal disódica dihidratada</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Detección de endotoxinas ensayo</td></tr><tr><td>Agua ultrapura sin endotoxinas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>Agua ultrapura para la preparación de tampones libres de endotoxinas</td></tr><tr><td>EndoTrap rojo</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>Resina de eliminación de endotoxinas</td></tr><tr><td>FBS (inactivada por calor)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (alta calidad, testeto de endotoxinas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-&szlig;-D-tiogalactopiranosido)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos de E. coli O55:B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, humano</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500 Solución de</td><td>separación (centrifugación en gradiente de densidad)</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>Fenil Sepharose de alto rendimiento</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>Resina para cromatografía de interacción hidrofóbica</td></tr><tr><td>Polymyxin B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inhibidores de la proteasa</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Resina para cromatografía de intercambio aniónico</td></tr><tr><td>Tampón RoboSep</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>Tampón de separación celular (sección 5.1.4)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de zinc</td><td>Carl Roth</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 y micro; m filtro de jeringa</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL tubos de fondo redondo</td><td>BD 352059</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matraz Erlenmyer de 2 L</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>Placas de suspensión de 24 pocillos</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de medición de 5 L</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO Merck 3 kDa</td><td></td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDa Plato de cultivo</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td></td></tr> (<tr><td>100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de tubos de diálisis</td><td>Spectrum</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Imán EasySep 'The Big</td> <td>Easy'Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos colectores de fracciones 5 mL</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Lumox film, 25 &; m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>Película para placas de cultivo de monocitos</td></tr><tr><td>Membrana de diálisis Spectra/Por (3,5 kDa)</td><td>Spectrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro Steritop</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Incubadora (con agitación)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Purificador KTA UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Sistema FPLC</td></tr><tr><td>Colector de fracciones</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (con rotor A-4-81)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>Lector de fluorescencia</td><td>Tecan</td><td>infinite M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación del s100a12 humano y sus oligomeros inducidos por iones para la estimulación celular inmune

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

En este protocolo, describimos un método para purificar la proteína humana de unión al calcio S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones del cultivo de Escherichia coli para estimulaciones de células inmunitarias. Este protocolo se basa en una estrategia de cromatografía de dos pasos, que comprende la pre-purificación de proteínas en una columna de cromatografía de intercambio de aniones y un paso de pulido posterior en una columna de interacción hidrofóbica. Esta estrategia produce proteína S100A12 de alta pureza y rendimiento a costos manejables. Para ensayos funcionales en células inmunitarias, la contaminación por endotoxinas remanentes requieren un control cuidadoso y más pasos de limpieza para obtener proteínalibre de endotoxinas. La mayoría de las contaminaciones por endotoxinas pueden excluirse mediante cromatografía de intercambio de aniones. Para agotar las contaminaciones residuales, este protocolo describe un paso de eliminación con filtros centrífugos. Dependiendo de la resistencia iónal disponible S100A12 puede organizarse en diferentes homomultimers. Para investigar la relación entre estructura y función, este protocolo describe además el tratamiento iónico de la proteína S100A12 seguido de la reticulación química para estabilizar los oligómeros S100A12 y su posterior separación por exclusión de tamaño Cromatografía. Por último, describimos un ensayo a base de células que confirma la actividad biológica de la proteína purificada y confirma la preparación libre de LPS.

Tras la pre-purificación en la columna AIEX(Figura 1A-C) y posterior HIC dependiente del calcio(Figura 2A,B),se obtuvo proteína altamente pura (Figura 2C). Además, las mediciones de endotoxina revelaron una eliminación exitosa de LPS. El contenido de LPS después de AIEX se midió en una dilución 1:10 por encima del límite de detección de ensayos, es decir, por encima de 500 EU/mL. Después de la prime...

Este protocolo describe un método de purificación para la proteína de unión al calcio sin etiquetas recombinante S100A12 y sus oligómeros inducidos por iones para ensayos de estimulación de monocitos humanos.

Purificación del S100A12 humano y sus oligomeros inducidos por iones para la estimulación celular inmune

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Este protocolo describe un procedimiento de purificación completo para la proteína de unión al calcio humano, S100A12, y en particular, para sus diferentes oligómeros inducidos por iones para implicaciones de investigación posteriores. Con esta técnica, somos capaces de mantener un alto rendimiento de proteínas muy puras y libres de endotoxinas. La reticulación química y la separación en la columna de cromatografía de exclusión de tamaño es un método convincente para generar proteínas homo-oligoméricas para otros ensayos funcionales.Nuestra técnica nos permite los aspectos mecanicistas de S100A12 como ligando del receptor de reconocimiento de patrones e información de arte para desarrollar idealmente nuevas intervenciones dirigidas y mejorar los ensayos diagnósticos. Además de ver este vídeo, recomendamos una lectura cuidadosa del protocolo, ya que describimos un procedimiento complejo de varios pasos. Para comenzar, corte un tubo de diálisis en una longitud adecuada, alrededor de 30 centímetros, con espacio adicional para el aire.Sumerja la membrana en agua desionizada durante 15 a 30 minutos para eliminar el glicerol. Para reducir la viscosidad de la solución proteica despejada, diluya la solución con 25 mililitros de Tampón A.Adjunte el primer cierre en el tubo. Cargue la muestra en la membrana y conecte el segundo cierre al menos un centímetro del extremo superior del tubo.En una habitación enfriada a cuatro grados centígrados, coloque el recipiente con Tampón A DEIEX en una placa de agitación, agregue una barra de agitación y la membrana llena de solución proteica. Ajuste la velocidad para girar la muestra de modo que no haya interferencias con la barra de agitación giratoria. Dialyze durante 12 a 24 horas a cuatro grados Centígrados luego reemplace el búfer dializado por el búfer A libre y continúe durante al menos cuatro horas adicionales.Transfiera la solución de proteína dializada del tubo a un tubo de 50 mililitros a través de una unidad de filtro de 0,45 micras. Inicie el FPLC con mantenimiento general. Conecte los búferes de columna AIEX A y AIEX B a las válvulas de almacenamiento intermedio y a la resina de intercambio de aniones que contiene la columna a los puertos de columna del FPLC.Ajuste los parámetros cromatográficos generales en consecuencia. Inicie el programa AIEX en el software FPLC y elija el volumen de equilibrio para el búfer A.Posteriormente, cargue la muestra en la columna y elula las proteínas con un gradiente lineal de 0%a 100% de alto tampón de sal. Recoger dos fracciones de mililitro durante la elución.Analice las fracciones eluidas después de finalizar la carrera. Para ello, cargue 10 microlitros de cada fracción en una página de Coomassie manchada 15%SDS e identifique fracciones que contengan S100A12. A la vez, a la venta de estas fracciones que contienen S100A12 para diálisis en solución salina con búfer TRIS.Para continuar la purificación de proteínas, después de la diálisis proteica, añadir un cloruro de calcio a la muestra a una concentración final de 25 milimolares, lo que facilitará la unión de S100A12 a la resina en el siguiente paso. A continuación, filtre la muestra a través de un filtro con un tamaño de vertido de 0,45 micras. Equilibrar los tampones HIC y las muestras a cuatro grados centígrados.A continuación, conecte los búferes de columna HIC A y B y la columna al sistema y ajuste los parámetros. Inicie el método para equilibrar la columna con volúmenes de una a dos columnas de búfer HIC A y cargue la muestra y el bloque de muestra sin enlazar de lavado con una señal UV alcance de nuevo el nivel de línea de base. A continuación, comience la elución con un quelante de calcio que contenga tampón EDTA.Recoger dos mililitros de fracciones pico durante la elución. Después de analizar 10 microlitros de cada fracción en una página de Coomassie manchada 15%SDS identificar fracciones S100A12 puras. Agrupa estas fracciones y dialyze contra HBS.En primer lugar, cargue 15 mililitros de muestra en una unidad de filtro centrífugo de 50 kilodalton. Centrifugar a 3200 veces g a 10 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos. Transfiera el flujo filtrado a través de un recipiente fresco, sobre hielo.Ahora, utilice un mililitro de HBS para enjuagar la membrana del filtro y para la dilución de la solución concentrada en la punta del filtro. Centrifugar de nuevo para recuperar tanta proteína como sea posible en el flujo a través. Para filtrar la solución, repita la carga y centrifugación de la muestra tantas veces como sea necesario.A continuación, para concentrar el S100A12 que contiene flujo a través, cárguelo en un filtro centrífugo de tres kilodalton y centrífuga a 3200 veces g, 10 grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos. Ahora el volumen se reduce a 1/5 hasta 1/10 del volumen de carga inicial. Transfiera la solución concentrada a un tubo nuevo.Repita el paso de concentración tantas veces como sea necesario. Después de la reticulación química, según el manuscrito, realizar cromatografía de exclusión de tamaño. Equilibre la columna en HBS, cargue la muestra y recoja fracciones máximas de uno a dos mililitros durante la ejecución.Después de analizar estas fracciones en una página SDS de cuatro a 20%gradiente, las fracciones de grupo con bandas principales del complejo proteico deseado. A continuación, concentre las soluciones como se hizo anteriormente. Para aislar los monocitos de las capas de puly humana por centrifugación de gradiente de densidad, primero equilibre la solución de separación a temperatura ambiente.Transfiera 20 mililitros en tubos centrífugos de 15 mililitros, dos tubos por capa de buffy. Diluir la sangre de la capa de buffy humana con HBSS a un volumen total de 60 mililitros y capa 30 mililitros de esta mezcla cuidadosamente en la parte superior del medio de separación. Centrifugar a 550 veces g durante 35 minutos a temperatura ambiente.Apague el freno de la centrífuga. Después de la centrifugación, las células sanguíneas periféricas mononucleares se encuentran directamente en la parte superior del medio de separación. Con una pipeta, transfiera estas células a un tubo de centrífuga fresco de 50 mililitros.Llene el tubo con HBSS a 50 mililitros y centrifugar a 170 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un pequeño volumen de HBSS por pipeteo. A continuación, llene el tubo hasta 50 mililitros y centrifuga a 290 veces g durante 10 minutos.Aspirar el sobrenadante de nuevo. Resuspender las células en 50 mililitros de HBSS y centrífuga a 170 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en un pequeño volumen de un mililitro de tampón de separación, contar las células y agregar buffer a una concentración de cinco veces 10 a las siete células por mililitro.Para el aislamiento de monocitos de las células sanguíneas periféricas mononucleares, utilice un kit de aislamiento magnético negativo de células y siga el protocolo del fabricante. Utilice un contador de células automatizado para contar los monocitos y resuspend en el medio de monocitos a una concentración de dos veces 10 a las seis células por mililitro. Para cultivar monocitos, establecer un plato de cultivo celular con una película permeable al gas hidrófobo adecuado para las células de suspensión.Coloque las placas debajo de la luz UV durante aproximadamente 30 minutos para la esterilización. Transfiera de 15 a 25 mililitros de la suspensión celular a estas placas de cultivo y déjelos reposar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Tras la pre-purificación en la columna AIEX y el posterior HIC dependiente del calcio, se obtuvo proteína altamente pura.Como control adicional, los monocitos humanos fueron estimulados con LPS y produjeron proteínas de tipo silvestre. La exposición proteica a diferentes iones da como resultado la disposición de diferentes oligómeros S100A12. El aumento de las concentraciones de zinc induce la disposición de S100A12 en tetrámeros y hexámeros tras la separación en la página de SDS teñida de cuatro a 20%Coomassie.Cuando se aplicó un exceso de iones antes de la reticulación, indujo un cambio pronunciado del equilibrio del oligómero. S100A12 se retició en presencia de 25 mililitros de calcio o 25 milimolares de calcio y un zinc milimolar. Después de la reticulación en tampón HBS con cloruro de calcio 25 milimolar y un cloruro de zinc milimolar, se separaron hexámeros y tetrámeros.El tetrámero y el dimer se separaron en tampón HBS con cloruro de calcio de 25 milimolares. Un ejemplo de oligómeros agrupados y concentrados después de la separación en una página SDS de cuatro a 15% de gradiente de Coomassie muestra dimer, tetrámero y hexámero. La estimulación monocito con S100A12 hexamérico dio como resultado una liberación alfa TNF pronunciada.Después de la eliminación de la endotoxina, es importante no reintroducir la contaminación en las muestras durante la posterior generación y purificación de los oligómeros. El análisis descendente de cualquier proceso relacionado con la oligomerización S100A12 es concebible. Del mismo modo, se pueden analizar aminoácidos y condiciones iónicas que afectan al propio proceso de oligomerización.Actualmente estamos usando oligómeros S100A12 separados según el protocolo descrito para desarrollar ligandos de péptidos específicos y anticuerpos para bloquear la señalización de la proteína a través de TLF4 y para desarrollar y mejorar los ensayos de diagnóstico.

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Investigación

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Immunology and Infection

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