Name: Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a generar modificaciones genómicas definidas con CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas. Este método permite crear líneas isogénicas con mutaciones heterocigotas o homocigotas específicas para estudiar funciones génicas y enfermedades.

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Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (NHLBI), Institutos Nacionales de Salud a través de subvenciones U01HL099656 (P.G. y D.L.F.) y U01HL134696 (P.G. y D.L.F.).

1. Diseño y construcción de ARN guía (gRNA)
NOTA: Cada gRNA se compone de dos oligonucleótidos de 60 pares base (bp) que se recocidos para generar un oligonucleótido de doble cadena (ds) de 100 bp(figura 1A-C). La cronología para el diseño, la generación y la eficiencia de corte de gRNA es de aproximadamente 2 semanas(Figura 2).
<ol><li>Seleccione la región de ADN de interés que se va a editar en el genoma e identifique las secuencias de 3-4 23 bp que se ajusten al formato, 5'-G(N19)NGG-3'. Estas secuencias deben ubicarse dentro de 20 bp de la región de interés. NOTA: La segmentación se puede realizar en el hilo de sentido o anti-sentido.</li>
	<li>Evalúe las secuencias de gRNA para la redundancia genómica y la probabilidad fuera de destino utilizando un recurso como CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Incorporar la secuencia objetivo de 20 bp (excluyendo el motivo adyacente protoespacial o PAM) en dos oligonucleótidos de 60 mer como se muestra (las secuencias son de 5' a 3' y el rojo y el verde son complementos inversos como se muestra en la Figura 1C).</li>
	<li>Ordene los dos oligonucleótidos de 60 bp del proveedor de elección. Una vez recibidos los oligonucleótidos, resuspender cada uno a una concentración final de 100 m en ddH2O. Hacer un stock de trabajo de 10 m.</li>
	<li>Recocido los dos oligonucleótidos y generar un fragmento de 100 bp dsDNA utilizando ADN polimerasa (Tabla de Materiales). Combinar 5 ml de oligonucleótido hacia delante de 10 oM y 5 ml de oligonucleótido inverso de 10 m en un tubo de banda de reacción en cadena de polimerasa (PCR) e incubar a 95 oC durante 5 min. Enfríe la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Configure el PCR como se describe en el Cuadro 1. Realice la amplificación de PCR en un ciclor térmico utilizando los parámetros descritos en el Cuadro 2.</li>
	<li>Visualice los productos de PCR en un bromuro de etidio del 1,5% (p/v) (EtBr) electroforoesed a 80-100 V durante 40 min. kit de extracción(Tabla de Materiales).</li>
</ol>2. Diseño de imprimaciones PCR para cribado
<ol><li>Realizar pruebas de detección del ADN editado utilizando imprimaciones PCR delanteras y inversas diseñadas específicamente para amplificar una región de 400-500 bp del gen de interés (Tabla 2). Utilice ADN aislado de cualquier línea iPSC de control para confirmar un amplificador limpio al realizar el cribado de PCR.</li>
	<li>Visualice los productos de PCR en un gel del 1,5% (p/v) después de la electroforesis a 80-100 V durante 1 h. NOTA: La secuenciación de clones editados se realiza utilizando una imprimación anidada diseñada después de la confirmación del conjunto de imprimación de cribado. Las muestras se envían a una fuente comercial para la secuenciación.</li>
</ol>3. Preparación del plásmido vectorial gRNA_cloning
<ol><li>Para linealizar el vector de clonación, tome un tubo de centrífuga de 1,5 ml y agregue 1-5 g de ADN del vector gRNA_cloning junto con 4 l del tampón de enzima de restricción AflII y 1,5 ml de enzima de restricción AflII. Traiga la reacción a 24 sl de ddH2O. Mezcle la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar a 37oC durante la noche (O/N).</li>
	<li>Electroforesa en un gel de agarosa del 1% a 80-100 V para 1 h y bandas de impuestos especiales (tamaño esperado de la banda es de 3519 bp).</li>
	<li>Extraiga y puriifíque como en el paso 1.6.</li>
</ol>4. Montaje del vector gRNA
<ol><li>Configure reacciones y ensamble fragmentos de ADN utilizando el kit de montaje(Tabla de materiales) en las relaciones 1:5 del vector de clonación de ARNg digerido AflII a un inserto purificado de gel de 100 bp, como se describe en la Tabla 3.</li>
	<li>Incubar la reacción a 50 oC durante 15 min. Diluir la reacción 1:3 en ddH2O y utilizar 3 l para la transformación bacteriana, según las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales). Células de placa en placas de kanamicina LB/agar.</li>
	<li>Escoge de 3 a 5 colonias por rRUB. Inocular cada colonia en 4 ml de LB y cultivar O/N a 37 oC en una incubadora de temblor orbital.</li>
	<li>Purificar el ADN plásmido usando un kit de aislamiento de plásmido miniprep, y secuencia cada ARNm usando las siguientes imprimaciones para asegurar la clonación exitosa: Adelante: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Reverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>5. Prueba de la eficiencia de corte del RNR
<ol><li>Placa hESCs en fibroblastos embrionarios murinos irradiados (MEF) en una placa de 6 pocillos, como se describió anteriormente21. Cuando las células alcancen una confluencia del 70-80%, prepare la mezcla maestra de transfección descrita en la Tabla 4.</li>
	<li>Mezclar con pipeteo e incubar a RT durante 15 min. Añadir gota a las células e incubar a 37 oC durante 48 h (con un cambio de medio después de 24 h).</li>
	<li>Células de cosecha para clasificación después de 48 h.<ol>
<li>Retire los MEF enzimáticamente(Tabla de Materiales)con una incubación RT de 3 min.</li>
		<li>Enjuague las células 1x con el medio hESC (Tabla 5) y raspa en medio hESC + 10 M Y-27632 dihidrocloruro(Tabla de Materiales).</li>
		<li>Células de pelet a 300 x g durante 3 min y resuspenden en 0,5 ml de medio hESC + 10 m y dihidrocloruro.</li>
		<li>Filtrar en un tubo de 5 ml a través de una tapa de colador de celda de 35 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), la compuerta en las células vivas y ordenar las células positivas de la proteína fluorescente verde (GFP).</li>
	<li>Transfiera un máximo de 1,5 x 104 células ordenadas directamente a una placa de 10 cm2 recubierta con matriz de membrana de sótano 1:3(Tabla de materiales)y MEF irradiados en medio hESC(Tabla 5) que contiene dihidrocloruro Y-27632.</li>
	<li>Cambie el medio diariamente utilizando el medio hESC(Tabla 5) sin dihidrocloruro Y-27632 y recoja manualmente los clones después de 10-15 días, cuando las colonias tienen un diámetro de 1 mm.<ol>
<li>Con una pipeta P200 y un microscopio, raspe cuidadosamente un solo clon y extraiga células en la pipeta.</li>
		<li>Disperse las células pipeteando suavemente 3-4x en una placa de 96 pocillos en el medio elaborado con la colonia.</li>
		<li>Dispensar en tubos de tiras de PCR para cribado y peletizar las células por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min. Recoger 20 colonias por rARREGLO.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Examen de clones
<ol><li>Aislar el ADN mediante la incubación de gránulos celulares en 20 ml de tampón de proteína K(Tabla 5) (1 h a 55 oC y 10 min a 95 oC) y vórtice vigorosamente. Centrífuga a 10.000 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante.</li>
	<li>Realizar el cribado de PCR (sección 2) en un volumen total de 20 l utilizando una mezcla maestra que incluya imprimaciones diseñadas para amplificar la región de interés y 5 l de la digerida K de la proteinasa. Utilice ADN genómico aislado de la línea celular que fue editado como un control.</li>
	<li>Evaluar los cambios de tamaño de los productos de PCR después de 1 h de electroforesis a 70-90 V en un gel de agarosa del 2,5% (p/v)(Figura 3B,C). Cualquier diferencia de tamaño es indicativa de escote.</li>
</ol>7. Edición precisa del genoma en células madre pluripotentes utilizando ADN de oligo de una sola hebra (ssODN)
<ol><li>Diseño 100 bp ssODNs centrados en la secuencia de ARNm más eficiente determinada para tener la mejor eficiencia de corte.</li>
	<li>Evitar el re-escote de la ODN recombinada mediante la introducción de mutaciones silenciosas en la secuencia del ARNR. Una sola mutación silenciosa en la secuencia de PAM es suficiente, pero si no es posible, 3-4 mutaciones silenciosas funcionarán. NOTA: Para facilitar el cribado de clones específicos, la introducción de un sitio de restricción dentro de 20 bp de la secuencia de ARNm es ideal.</li>
	<li>Diseñe un ODN con los cambios de base deseados para crear la mutación de interés y un ODN sin los cambios base. NOTA: Estos cambios no deben ser superiores a 20 bp del sitio de corte CRISPR/CAS9 previsto, ya que la recombinación disminuye considerablemente a mayores distancias.</li>
	<li>Pida los dos ssODN del proveedor de elección y resuspenda en agua para hacer existencias de 1 g/L. Almacene las existencias a -20 oC.</li>
</ol>8. Configuración de transfección
<ol><li>Para transfectar el ssODN y los plásmidos CRISPR-CAS9, placar la línea celular objetivo en una placa de 6 pocillos en MEF irradiados para alcanzar 70-80% de confluencia después de una incubación de O/N.</li>
	<li>Configure la reacción de transfección como se describe en la Tabla 6. Mezclar la reacción pipeteando e incubar durante 15 minutos en RT. Añadir la mezcla de reacción de transfección gota a las células.</li>
	<li>Después de 48 h, prepare las celdas para la clasificación celular como se describe en la sección 5.3.</li>
	<li>Recoger colonias 10 días después de enchapar células individuales usando una pipeta de 200 ml. Transfiera 100 l de células a un pozo de una placa de 24 o 48 pocillos previamente recubierto con gelatina e MEF irradiados en medio hESC con dihidrocloruro Y-27632. Utilice los 100 s restantes para el aislamiento del ADN como se describe en la sección 6.</li>
</ol>9. Comprobación de mutaciones en colonias individuales
<ol><li>Para comprobar la integración correcta del ssODN, tome 5 ml de ADN aislado de cada colonia para realizar la PCR utilizando las imprimaciones de cribado diseñadas en la sección 2. Purificar los productos PCR(Tabla de Materiales)y preparar la digestión enzimática de restricción utilizando el sitio de enzimas único creado en el ssODN. NOTA: Esta digestión también incluye el tampón de enzimas de restricción y la concentración recomendada por el fabricante de enzimas de restricción en un volumen de 40 l.</li>
	<li>Mezclar la reacción pipeteando e incubar a la temperatura recomendada por el fabricante durante 1-3 h.</li>
	<li>Visualice los productos de PCR digeridos en un gel de agarosa EtBr del 1,5% (p/v) electroforoesed a 80-100 V durante 40 min. Si se ha producido una integración correcta del ssODN, secuencia mutaciones específicas mediante una imprimación anidada.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm%2C+Development+of+the+Pancreas%2C+and+Functionality+of+Pancreatic+%CE%B2+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li>
<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, se demuestra el uso de CRISPR-CAS9 junto con dos plantillas de reparación ssODN para generar cambios específicos del genoma heterocigoto u homocigoto en células madre pluripotentes humanas. Este método dio lugar a la generación exitosa de líneas celulares isogénicas que expresan cambios genómicos heterocigotos con una eficiencia cercana al 10%. Este protocolo ha sido optimizado tanto para ESC seres humanos como para iPSC cultivados en MEF irradiados que apoyan el crecimiento celular y la supervivencia ...

Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son herramientas valiosas para modelar enfermedades humanas debido a su capacidad de renovación, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de generar tipos celulares de diferentes linajes1,2 ,3,4. Estos modelos abren la posibilidad de interrogar la función génica, y entender cómo las mutaciones y fenotipos específicos están relacionados con diversas enfermedades5,6. Sin embargo, para entender cómo una alteración específica está vinculada a un fenotipo particular, el uso de un control isogénico emparejado y líneas celulares mutantes es importante controlar para la variabilidad de línea a línea7,8. Las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción (TALENs) y las nucleasas de dedos de zinc se han utilizado para generar mutaciones de inserción o deleción (indels) en diversos modelos genéticos, incluidas las células primarias; pero estas nucleasas pueden ser engorrosas de usar y caras9,10,11,12,13,14. El descubrimiento de la nuclearo de repetición palindrómica corta (CRISPR)-CAS9, regularmente interespaciada, ha revolucionado el campo debido a la eficiencia en la formación de indel en prácticamente cualquier región del genoma, la simplicidad de uso y la reducción del costo15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Un desafío en el uso de la tecnología de edición del genoma basada en CRISPR-CAS9 ha sido la generación o corrección de mutaciones específicas en un alelo sin crear una mutación indel en el segundo alelo20. El objetivo principal de este protocolo es superar este desafío mediante el uso de dos plantillas de reparación de oligonucleótidos de una sola cadena (ssODN) para reducir la formación de indel en el segundo alelo. Ambos ssODN están diseñados para contener mutaciones silenciosas para evitar el re-corte por la nucleasa CAS9, pero sólo uno contiene la alteración del interés. Este método aumenta la eficiencia de generar una modificación genética heterocigota específica sin inducir la formación de indel en el segundo alelo. Usando este protocolo, los experimentos de edición de genes en seis ubicaciones genómicas independientes demuestran la introducción precisa del cambio genómico deseado en un alelo sin formación indel en el segundo alelo y se produce con una eficiencia general del 10 %. El protocolo descrito ha sido adaptado de Maguire et al.21.

<table><tbody><tr><td>Tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo con tapón de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de poliestireno de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasa de restricción AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Aparato</td><td></td><td></td><td></td>clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS)</tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Kit de montaje</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB placas de agar que contienen 50 &mu; g/ml Kanamicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de tallo de lipofectamina</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionarios murinos (MEFs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza de PCR y extracción en gel de nucleospina</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vector pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>tubos de tira de PCR EE</td><td>. UU. Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad y 5&times; Tampón de phusión</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Kit de minipreparación de plásmido rápido</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM células de Escherichia coli electrocompetentes</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>medio SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 inhibidor de diclorhidrato/ROCK (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de modificaciones genómicas definidas utilizando crispr-cas9 en células madre pluripotentes humanas

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Las células madre pluripotentes humanas ofrecen un potente sistema para estudiar la función génica y modelar mutaciones específicas relevantes para la enfermedad. La generación de modificaciones genéticas heterocigotos precisas es difícil debido a la formación de indel mediada por CRISPR-CAS9 en el segundo alelo. Aquí, demostramos un protocolo para ayudar a superar esta dificultad mediante el uso de dos plantillas de reparación en las que sólo una expresa el cambio de secuencia deseado, mientras que ambas plantillas contienen mutaciones silenciosas para evitar el re-corte y la formación de indel. Esta metodología es más ventajosa para que las regiones de codificación de genes del ADN generen control isogénico y líneas de células madre humanas mutantes para el estudio de enfermedades humanas y biología. Además, se han realizado metodologías de optimización de la transfección y el cribado para reducir el trabajo de parto y el costo de un experimento de edición de genes. En general, este protocolo es ampliamente aplicable a muchos proyectos de edición del genoma que utilizan el modelo de células madre pluripotentes humanas.

Generación de gRNAs y cribado para indels
Cada gRNA se clonará en un vector plásmido y se expresará utilizando el promotor U6. La enzima de restricción AflII se utiliza para linealizar el plásmido (adigeno #41824) y se encuentra después del promotor U6. La banda de 100 bp generada después de recocido los dos oligos de 60 bp se clona en el vector de expresión gRNA utilizando el ensamblaje de ADN. Una vez que se generan los plásmidos del ARNG, se transinfectan en hESC o...

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

El estudio de la función genética y la enfermedad se ven obstaculizados por la naturaleza de la raza de la población humana. Los diferentes antecedentes genéticos de las líneas celulares iPS específicas del paciente y del control pueden afectar la eficiencia de la diferenciación y los fenotipos que se encuentran en un ensayo funcional determinado. El uso de líneas genéticamente idénticas o isogénicas donde la única diferencia es la mutación particular de interés es fundamental para superar estos problemas.Muchas enfermedades humanas son causadas por mutaciones heterocigotas, que pueden ser difíciles de generar con el sistema CRISPR-Cas9. Esto se debe a la generación de mutaciones indel en el alelo no dirigido que pueden ocurrir a muy alta frecuencia. Nuestra técnica supera este problema mediante el uso de dos plantillas de reparación de las cuales sólo uno alberga la mutación de interés.Cualquier investigador que intente esta técnica debe ser experto en el cultivo de células madre pluripotentes humanas. La demostración en vídeo de la recolección de colonias será útil para mostrar el tamaño y la morfología correctos, así como la técnica utilizada para la recolección y el cribado. Demostrar este procedimiento será Leo Cárdenas.Para empezar, placa ESCs humanos en MEF irradiados en una placa de 6 pozos. Prepare la mezcla maestra de transfección. Mezclar en pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.Cuando las células alcanzan 70 a 80% de confluencia, entonces, agregue la mezcla maestra de transfección gota sabia a cada pozo con las células y la incubación a 37 grados Celsius durante 48 horas. Cambie los medios cada 24 horas. Para cosechar las células, primero, incubar las células con Triple E durante tres minutos a temperatura ambiente para eliminar los MEF enzimáticamente.Añadir 0,5 mililitros de medio HESC con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Células de pellets a 300 veces g durante tres minutos y re-suspender en 0,5 mililitros de medio ESC humano con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Filtre la suspensión celular en un tubo de cinco mililitros a través de una tapa de colador celular de 35 micras.Usando la clasificación celular activada por fluorescencia, atenuse en las células vivas y clasifique las células positivas de proteína fluorescente verde. A continuación, transfiera un máximo de 1,5 veces 10 a las cuatro células ordenadas directamente en un plato de 10 centímetros recubierto con una a tres matrices de membrana de sótano y MEF irradiado y un medio ESC humano que contiene inhibidor de ROCK. Cambie el medio diario utilizando el medio ESC humano sin inhibidor de ROCK.Después de 10 a 15 días, las colonias tienen aproximadamente de uno a dos milímetros de diámetro. Bajo un microscopio, utilice una pipeta P200 para raspar cuidadosamente un solo clon y dibujar células en la pipeta. Dispersar las células en un pozo de una placa de 96 pozos pipeteando suavemente de tres a cuatro veces en el medio elaborado con la colonia.A continuación, escoja 20 colonias para cada ARN guía y prescinda en tubos de tira de PCR para su cribado. Pele las células por centrifugación a 10.000 veces G durante cinco minutos. Ahora, incubar gránulos celulares en 20 microlitros de proteinasa K tamponado para aislar el ADN y el vórtice vigorosamente.Centrifugar a 10.000 veces G durante cinco minutos. A continuación, realice la detección de PCR del ADN editado. Añadir en los tubos 20 microlitros de una mezcla maestra, incluyendo imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, diseñadas para amplificar la región de interés, así como cinco microlitros del digesto Proteinase K.Utilice ADN genómico aislado de la línea iPSC de control para confirmar un amplicon limpio al realizar la PCR de cribado. Evaluar los cambios de tamaño de los productos de PCR después de una hora de electroforesis a 70 a 90 voltios en un 2,5% de peso en gel de agarosa de volumen. Cualquier diferencia de tamaño es indicativa de escote.Para transfecar el ADN oligo de una sola hebra y los plásmidos CRISPR-Cas9, plancha la línea celular diana en un plato de 6 pocillos en MEF irradiados para alcanzar el 70 a 80% de confluencia después de una incubación durante la noche. Configure la reacción de transfección como se describe. Mezclar la reacción por pipeteo e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.Luego, agregue la mezcla de reacción de transfección gota sabia a las células. Después de 48 horas, prepare las celdas para la clasificación celular como anteriormente. Aproximadamente 10 días después de enchapar células individuales, utilice una pipeta de 200 microlitros para recoger colonias en tubos de tira de PCR y en un pozo de una placa de 12 pozos pre-recubierta con gelatina y MEF.Transfiera 100 microlitros de las células a cada pozo de una placa de 24 o 48 pozos, previamente recubierta con gelatina y MEF irradiado en medio ESC humano con inhibidor de ROCK. Utilice las 100 microlitros restantes para el aislamiento del ADN. Para comprobar la integración exitosa del ADN oligo de una sola cadena, tome cinco microlitros de ADN aislados de cada colonia para realizar pcR utilizando las imprimaciones de cribado previamente diseñadas.Purificar los productos de PCR y preparar los 40 microlitros de la digestión de enzimas de restricción utilizando el sitio enzimático único creado en el ADN oligo de una sola hebra. Mezclar la reacción por pipeteo e incubar a la temperatura recomendada por el fabricante durante una a tres horas. A continuación, visualice los productos de PCR digeridos añadidos con un tinte de carga en un gel de agarosa de bromuro de etidio por volumen de 1,5% de peso, electroforese a 80 a 100 voltios durante 40 minutos.Si se ha producido una integración exitosa del ADN oligo de una sola hebra, secuenciar mutaciones específicas utilizando una imprimación anidada. En este estudio, para la construcción de ARN guía, una banda de 100 pares base fue extirpada de un gel de agarosa del 1,5%. Después de la transfección celular, se visualizó la validación del corte de ARN guía utilizando un gel de agarosa del 2,5%.Un producto PCR de par base 180 mostró un control sin cortar y diferentes clones con turnos de banda que indican la formación de indel. Diferentes ARN guía tenían diferentes eficiencias de corte. Para evitar el re-corte CRISPR-Cas9 de los alelos editados, la secuencia PAM se modificó utilizando una mutación silenciosa de G a A.Una mutación silenciosa en la secuencia PAM generó un sitio de restricción único, que ayuda a detectar una integración exitosa en uno o dos alelos. Las líneas de células madre editadas por el genoma se pueden utilizar en diferencias posteriores y ensayos funcionales para estudiar el efecto de una mutación dada en el desarrollo humano y la enfermedad. Esta metodología permite la generación de líneas celulares isogénicas con mutaciones heterocigotas o homocigotas específicas, implicadas en una amplia variedad de enfermedades humanas.Estos modelos de enfermedades allanan el camino para el desarrollo de nuevas terapias celulares, así como ofrecen plataformas para el descubrimiento de fármacos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video demuestra una técnica de edición del genoma basada en nucleasas de dedos de zinc en células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Dado que las hPSC pueden diferenciarse potencialmente en varios tipos de células, esta tecnología es útil para estudios patológicos y farmacológicos in vitro de manera específica para cada paciente.

Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

Las herramientas de edición del genoma, como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), han mejorado en gran medida la eficiencia de la selección de genes en células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Este manuscrito describe un protocolo para generar un indicador de hiPSC específico del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas.

Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

El protocolo describe los métodos para la edición del epigenoma basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) en líneas celulares humanas mediante la transfección de ADN plasmídico y la nucleofección de ARNm.

Edición del epigenoma CRISPR en células humanas mediante transfección de ADN plasmídico y administración de nucleofección de ARNm

Aprende a generar modificaciones genómicas definidas con CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas. Este método permite crear líneas isogénicas con mutaciones heterocigotas o homocigotas específicas para estudiar funciones génicas y enfermedades.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

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