Name: Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar proteínas SUMOiladas en cáncer de hígado usando entidades de unión SUMO (SUBEs). Este método permite identificar el proteoma SUMO en células de hepatoma humano y tumores hepáticos de ratón.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Institut National du Cancer, FRANCE, la beca INCa PLBIO16-251 (PLBIO16-251), la beca CONACyT-SRE (México) 0280365 y el programa REPERE de Occitanie, Francia (M.S.R.). Asimismo, NIH (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (a M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el Plan de Estado Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (Fundación Vasca para la Innovación y la Investigación Sanitaria): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciador con Fondos FEDER (a M.L.M.-C), Asociación Española contra el Cáncer (T.C.D, M.L.M-C), premio Daniel Alagille de EASL (T.C.D), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cáncer (Fundación Científica AECC) Llamadas Raras Tumorales 2017 (a M.L.M), Programa de la Fundación La Caixa (a M.L.M). Agradecemos a MINECO la Acreditación Severo Ochoa Excellence a CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).

Todos los experimentos fueron aprobados por los comités institucionales de CIC bioGUNE para el cuidado y manejo de animales. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de animales utilizados. Se utilizaron glicinasin glicina masculina de 3 meses de edad(Gnmt) deficiente (Gnmt)y sus littermates de tipo salvaje (Gnmt+/+).
1. Preparación celular y lisis
NOTA: En este documento, se utilizaron Huh-7 (línea celular de hepatoma humano) y THLE2 (línea celular hepática humana).
<ol><li>Mantener las células en placas P100 en medios de crecimiento estándar a 37 oC en una atmósfera humidificada de 5% CO2-95% de humedad.</li>
	<li>Cultivar las células en placas P100 a una densidad de 1.2–1.5 x 106 células por plato contando las células usando una cámara de conteo de hemocitometría Neubauer.<ol>
<li>Cultivo Huh-7 en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-anfotericina B (PSA) y 1% de glutamina.</li>
		<li>Cultivo thLE2 células en platos de cultivo pre-recubiertos con 0.01 mg/ml de fibronectina, 0.01 mg/ml albúmina sérica bovina (BSA) y 0.03 mg/ml colágeno tipo I disuelto en medio de crecimiento que consiste en el medio basal de crecimiento de células epiteliales bronquiales (BEGM) complementado con suplemento con suplemento con factores de crecimiento (0,4% de BPE, 0,1% de insulina, 0,1% de hidrocortisona, 0,1% de ácido retinoico, 0,1% transferrina, 0,1% triiodotironina, así como 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/ml factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 70 ng/ml fosfooetanolamina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En el punto final del experimento, aspirar el medio de las placas y células de lavado con 5 ml de solución salina estéril 1x con fosfato (PBS). Células de Lyse directamente en la placa colocadas en hielo usando 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% de nontídete P-40 (NP40), complementado con cóctel completo de inhibidor de proteasa libre de EDTA y 50 M PR-619 para cada plato P100. Usando un rascador de celdas, raspe suavemente las células de la parte inferior de la placa en el medio de Lisis. NOTA: Compruebe que todas las células se han desprendido de la placa inspeccionando visualmente la base de la placa después del tratamiento.</li>
	<li>Alternativamente, cosechar células por trippsinización por aspirar medios celulares y agregar 1 mL de 1x (0.05%) trippsin-EDTA a la placa, suficiente para cubrir las células y colocar la placa en la incubadora a 37 oC, 5% CO2y 95% de humedad durante 5 minutos asegurando que todas las células se hayan separado de la placa. Añadir 2 ml de medio de crecimiento precalentado para detener la trippsinización. Centrífuga a 150 g durante 10 min y aspirar al sobrenadante. Lavar con 1PBS y centrifugar a 150 x g durante 10 min. Después de aspirar el sobrenadante, añadir 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, complementado con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo y 50 M PR-619 para cada plato P100. NOTA: La adición del PR-619 es crítica.</li>
	<li>Centrífuga a 15.500 x g y 4oC durante 10 min. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y deseche el pellet. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se almacenan a -80 oC hasta su posterior análisis.</li>
</ol>2. Preparación de tejidos y lisis
<ol><li>Tras el sacrificio animal, recoger los hígados de ratón, lavar con PBS frío, y congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Almacene las muestras a 80 oC hasta su posterior análisis.</li>
	<li>Homogeneizar 75 mg de hígados congelados/o frescos en 1 ml de tampón de lisis helada (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, complementado con cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo y 50 M PR-619). Ejecute el homogeneizador a 6500 x rpm, 2 x 60 s cada uno, con una pausa de 30 s (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Centrifugar las muestras en un microfófugo a 15, 500 x g y 4 oC durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y deseche el pellet.</li>
	<li>Alternativamente, triturar 75 mg de tejidos congelados en nitrógeno líquido. A continuación, recuperar el tejido en 1 ml de tampón de lisis.</li>
	<li>Centrifugar la muestra en un microfófugo a 15, 500 x g y 4 oC durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo y deseche el pellet. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se almacenan a -80 oC hasta su posterior análisis.</li>
</ol>3. Encuadernación de GST-SUBEs o control GST a glutatión-agarosa Abalorios
NOTA: La síntesis del control GST-SUBE o GST está fuera del alcance de este manuscrito y puede ser revisada en la literatura publicada anteriormente20. Alternativamente, los SUBE de GST y Control están disponibles comercialmente (por ejemplo, SignalChem).
<ol><li>Preparación de cuentas de glutatión<ol>
<li>Añadir 1 ml de agua desionizada a 70 mg de cuentas liofilizadas de glutatión-agarosa. Reconstituir las perlas durante la noche a 4oC (o durante al menos 30 min a temperatura ambiente).</li>
		<li>Lavar las perlas a fondo después de la hinchazón (para eliminar la lactosa y el etanol que generalmente están presentes en las cuentas de agarosa en polvo liofilizado). Para ello, primero lave con 10 ml de agua desionizada o PBS seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Realice esto tres veces.</li>
		<li>Después de 3 lavados, resuspenda las perlas en 1 ml de PBS para obtener una suspensión del 50% (v/v). NOTA: Este volumen es adecuado para el análisis de 10 muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cada muestra, añada 100 g de Control GST-SUBEs o GST (ver referencia20) a 100 l de la suspensión de perlas de glutatión y 500 l de PBS. NOTA: La abundancia relativa de las proteínas SUMOylated de interés determina la cantidad de GST-SUBEs utilizados para los pull-downs. Para cada nuevo modelo experimental, analice la condición antes del experimento real por la hinchada occidental el material de entrada, uncuado y flujo (FT) utilizando anticuerpos anti-SUMO2/3 o contra proteínas de interés (Kinasa hepática B1 (LKB1).</li>
	<li>Incubar todos los GST-SUBEs o control GST con perlas preparadas en 3.2., girando lentamente en rotador o mini rodillo (ver Tabla de Materiales)a 4oC durante al menos 2 h (reacción de unión lenta). NOTA: La adición de ditiothreitol de 1 mM (TDT) mejora la unión GST a las perlas de glutatión.</li>
	<li>Recuperar las perlas de agarosa por centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Al final, resuspendió las perlas en PBS para obtener una suspensión del 50% (v/v). NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y las muestras se almacenan a -80 oC hasta su posterior análisis.</li>
</ol>4. Ensayo GST Pull Down
<ol><li>Después del paso 1.5, 2.3 o 2.5, tomar 1/10 del volumen total (por ejemplo, 50 l) y diluir en el mismo volumen de tampón de ebullición 3x (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 500 mM -mercaptoetanol, 50% glicerol, 10% SDS, azul bromofenol). Esta fracción se considera como INPUT.</li>
	<li>Añadir 450 l de lisato clarificado a partir de los pasos 1.5, 2.3 o 2.5 a 100 l de perlas de glutatión. Incubar el lisado con cuentas, girando lentamente a 4oC durante al menos 2 h. NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar 100-200 g de proteína total a partir de los pasos 1.5, 2.3 o 2.5 (cuantificado con el ensayo Bradford) en un volumen total de 450 l.</li>
	<li>Gire las cuentas en un microfófugo a 300 x g durante 5 min y recoja el sobrenadante para el análisis. Transfiera 1/10 del volumen total (p. ej., 50 l) en un tubo separado y diluya en un volumen igual de tampón de ebullición 3x. Esta fracción es la fracción de flujo a través (FT).</li>
	<li>Lave la muestra restante tres veces con PBS helado de 1 ml, 0,05% Tween 20, gire hacia abajo a 4 oC y 300 x g durante 1 min. Aspirar cuidadosamente asegurando que no quede líquido. Las perlas corresponden a la fracción SUBEs BOUND (SB).</li>
	<li>Elule la muestra con 15 s l de tampón hirviendo 3x y 15 l del tampón de lisis. Esto se llama la fracción BOUND.</li>
</ol>5. Identificación y caracterización de objetivos SUMO por análisis de Western Blot
<ol><li>Realizar análisis de manchas occidentales utilizando un anticuerpo anti-SUMO2/3 o cualquier otro anticuerpo específico de elección como se describió anteriormente22.</li>
</ol>6. Identificación y caracterización del Proteome SUMAYlado por Espectrometría de Masas
NOTA: En el caso del análisis de espectrometría de masas (MS), las muestras se procesaron utilizando el método de preparación de muestras asistida por filtro (FASP) descrito por Wisniewski et al.23.
<ol><li>Desallos los péptidos utilizando microcolumnas C18 de punta de etapa y resuspenderlos en 0.1% ácido fórmico (FA) antes del análisis de la EP.</li>
	<li>Cargue las muestras en un sistema LC-MS (ver Tabla de Materiales)y analícelas en triplicado (replicaciones técnicas) (Figura 2b).</li>
	<li>Continúe con la identificación de proteínas y el cálculo de la abundancia mediante el uso de un software asociado.</li>
	<li>Para el análisis estadístico y la generación de mapas de calor, cargue los datos en la plataforma Perseus (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Aplique una prueba t corregida por la tasa de detección falsa (FDR) basada en permutación para la comparación de las abundancias. Las proteínas con una relación q < 0.05 y una relación SUBEs/GST mayor que 2 se consideraron enriquecidascomo 24. NOTA: Las proteínas identificadas con al menos dos péptidos diferentes se consideran en el análisis final.</li>
</ol>

<ol><li>Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 379 (9822), 1245-1255 (2012).</li>
<li>Gerbes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+roundtable+meeting+paper%3A+selected+recent+advances+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma.</a> Gut. , (2017).</li>
<li>Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+therapies+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">New therapies for hepatocellular carcinoma.</a> Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).</li>
<li>Grotenbreg, G., Ploegh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology%3A+dressed-up+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical biology: dressed-up proteins.</a> Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).</li>
<li>Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+compilation+of+SUMO+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive compilation of SUMO proteomics.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).</li>
<li>Seeler, J. S., Dejean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+the+robustness+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">SUMO and the robustness of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (3), 184-197 (2017).</li>
<li>Tomasi, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-adenosyl+methionine+regulates+ubiquitin-conjugating+enzyme+9+protein+expression+and+sumoylation+in+murine+liver+and+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers.</a> Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).</li>
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<li>Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+its+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Internationa+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO and its role in human diseases.</a> Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).</li>
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<li>Liang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO5%2C+a+Novel+Poly-SUMO+Isoform%2C+Regulates+PML+Nuclear+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies.</a> Science Reports. 6, 26509(2016).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+ubiquitin-related+modifier+%28SUMO%29-specific+proteases%3A+profiling+the+specificities+and+activities+of+human+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biologucal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs.</a> Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).</li>
<li>Hilgarth, R. S., Sarge, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+sumoylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of sumoylated proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 301, 329-338 (2005).</li>
<li>Vertegaal, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomic+study+of+SUMO-2+target+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A proteomic study of SUMO-2 target proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).</li>
<li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+identification+of+endogenous+polySUMO+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates.</a> EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).</li>
<li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+endogenous+SUMO+targets+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues.</a> Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).</li>
<li>Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+endogenous+SUMO1+and+SUMO2%2F3+targets+in+mammalian+cells+and+tissues+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies.</a> Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).</li>
<li>Hendriks, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+characterization+of+endogenous+SUMOylation+across+species+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs.</a> Nature Communications. 9 (1), 2456(2018).</li>
<li>Da Silva-Ferrada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SUMOylated+proteins+using+SUMO-traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps.</a> Science Reports. 3, 1690(2013).</li>
<li>Hjerpe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+protection+and+isolation+of+ubiquitylated+proteins+using+tandem+ubiquitin-binding+entities%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities.</a> EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).</li>
<li>Embade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+double+minute+2+regulates+Hu+antigen+R+stability+in+human+liver+and+colon+cancer+through+NEDDylation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation.</a> Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+Parallel+Accumulation-Serial+Fragmentation+%28PASEF%29+with+a+Novel+Trapped+Ion+Mobility+Mass+Spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li>
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<li>Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Biotinylated+SUMO-Traps+to+Analyze+SUMOylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).</li>
<li>Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Surface+Plasmon+Resonance+%28SPR%29+for+the+Analysis+of+Interactions+Between+SUMO+Traps+and+Mono-+or+PolySUMO+Moieties%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties.</a> Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).</li>
</ol>

El Dr. Martínez-Chantar asesora a Mitotherapeutix LLC.

En este documento, hemos proporcionado una descripción completa y detallada de la metodología que informa del uso de SUBEs para el enriquecimiento, aislamiento e identificación y caracterización de las proteínas SUMOylated en modelos in vivo de cáncer de hígado. Tanto en tumores hepáticos de ratón como en células hepatoma humanas, pudimos aislar e identificar correctamente las proteínas SUPILAdas de interés y realizar una caracterización de alto rendimiento del proteoma e interactoma SUMAylated. A pesar de que la síntesis de SUBE está fuera del alcance de este manuscrito, para más información se deben mirar las siguientes referencias a26. El protocolo descrito es rápido y muy sensible y el paso crítico del protocolo incluye el uso de inhibidores de SENPs (PR-619). Alternativamente, se pueden utilizar inhibidores químicos de la isopeptidasa como NEM (N-Etilmaleimida) e IAA (2-Iodoacetamida) en el tampón de lisis, sin embargo, informes anteriores han demostrado que para el protocolo SUBE, el uso de PR-619 es ventajoso como el otro inhibidores interfieren con la unión gST a las cuentas de glutatión20.
Los SUBE son proteínas recombinantes que comprenden repeticiones en tándem de SIS, reconociendo así las moléculas SUMO en proteínas modificadas con un aumento en la afinidad general por los sustratos SUMO. Debido a su alta especificidad y sensibilidad, el uso de SUBE para el aislamiento del proteome SUMOylated es ventajoso en relación con otros enfoques en la literatura, como la detección por western-blot de proteínas ESPECÍFICAs DE SUMA la proteína de interés o la cromatografía de níquel utilizando las diferentes versiones etiquetadas con histidina de las moléculas SUMO. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, dado que el protocolo SUBEs se realiza en condiciones no desnaturalizantes, se mantiene la interacción entre las proteínas SUDOiladas y otras proteínas que interactúan. Por lo tanto, obtenemos información sobre el interactome SUMO en lugar de sólo una lista de proteínas diana SUMOylated. Por lo tanto, se realizan más experimentos para confirmar si la proteína identificada es un objetivo SUMO o un factor de interacción. Otra limitación de los SUBE es el hecho de que las trampas GST de control utilizadas son capaces de capturar muchas proteínas de fondo relacionadas con el estrés oxidativo. Este problema es especialmente relevante durante el análisis de la EP debido a la alta sensibilidad de la técnica. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado trampas SUMO biotinyladas (bioSUBEs)26. Otra limitación de los SUBE reside en el hecho de que sólo somos capaces de capturar proteínas modificadas por SUMO 2 y SUMO 3, mientras que las proteínas SUMO 1 modificadas no se pueden aislar.
Otra preocupación por el uso de SUBE está relacionada con la cantidad de material de partida necesaria para el procedimiento. El material de partida utilizado para capturar proteínas SULOiladas debe tener en cuenta las diferentes condiciones experimentales exploradas. Mientras que la SUMOylation basal se ha divulgado en varios contextos celulares, SUMOylation es un proceso que es fuertemente inducido después de múltiples condiciones de estrés / estímulos. Si se comparan muestras no tratadas con muestras tratadas, hay que asegurarse de que la columna no está saturada, y se pueden observar diferencias entre esas condiciones. En el caso de los fenotipos de ratón que estamos analizando, no se han utilizado tratamientos y los niveles basales de SUMAylación son bajos. Por esta razón, se utilizaron altas cantidades de proteínas. El nivel de fondo debe controlarse mediante gST y si el enlace no específico es alto, se debe reducir la cantidad de material de partida o el tiempo de enlace. El análisis de la fracción FT puede ser indicativo de la eficiencia de captura incluso si estas trampas prefieren proteínas polisuculadas y no se debe esperar un agotamiento total, una reducción de la SUMOylation total se observa en general Óptima.
Por último, otras aplicaciones de la tecnología SUBEs incluyen la combinación de la tecnología SUBEs con la Resonancia de Plasmón de Superficie en Tiempo Real (SPR) permitiendo las interacciones en tiempo real con proteínas SUMOiladas a partir de extractos celulares27. También, más recientemente, se han desarrollado trampas SUMO biotinicadas (bioSUBEs) con la ventaja de reducir el fondo asociado a etiquetas más grandes, por ejemplo, durante el análisis de espectrometría de masas26. Además, la versión bioSUBE se puede utilizar para detectar proteínas SUGAladas en células vivas por fluorescencia mediante el uso de estreptavidina con tintes fluorescentes distintos aprovechando la unión de estreptavidina a la biotina. Asimismo, se pueden considerar métodos de detección y cuantificación de proteínas SUGAladas con versiones GST y bioSUBEs como se hizo con las entidades de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)21.
En general, el uso de SUBE para el aislamiento y caracterización del proteome SUMOylated relevante en el cáncer de hígado es un método rápido y sensible que proporciona vasta información sobre el papel todavía bastante desconocido de la vía de LA SUMOylation en el cáncer de hígado.

El cáncer de hígado es el sexto cáncer más común en todo el mundo y la segunda causa de muertes asociadas al cáncer1. El carcinoma hepatocelular (HCC) es la forma más predominante de cáncer de hígado primario. Históricamente, los factores de riesgo comunes para el desarrollo de HCC incluyeron la infección crónica por hepatitis B o C y el consumo abusivo de alcohol. En las últimas décadas, el síndrome metabólico, diabetes tipo 2 enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) ha surgido como factores de riesgo para el desarrollo de HCC2. El HCC es muy heterogéneo, tanto fenotípicamente como genéticamente, en el que se interrumpe una compleja red de vías de señalización. En los últimos años, a pesar de que ha habido un aumento en nuestro conocimiento sobre las vías moleculares implicadas en la patogénesis del HCC, todavía no hay enfoques terapéuticos eficaces para el manejo del HCC. Muchas vías se activan en HCC e inhibir una generalmente impulsa la compensación por otras vías3. Esta ha sido una de las principales dificultades al tratar el HCC. Por lo tanto, un enfoque más global puede proporcionar un enfoque terapéutico potencial para el manejo clínico del cáncer de hígado, por ejemplo, dirigido a modificaciones post-traduccionales (PTM), ya que múltiples vías de señalización pueden ser reguladas simultáneamente por LOS PTM de proteínas.
Las modificaciones post-traduccionales se consideran como mecanismos clave que regulan la homeostasis proteica y las funciones4. Los cambios estructurales y funcionales son introducidos por los PTM, aumentando así la diversidad del proteome. Los MPT más comunes incluyen fosforilación, metilación, acetilación, glicosilación, ubiquitinación y conjugación de proteínas similares a la ubiquitina (UbL). Entre todos los UbLs, la modificación de proteínas por SUMO (Pequeño MOdifier de Ubiquitina) ha atraído la atención en asociación con su papel crítico en una variedad de procesos celulares, incluyendo transcripción, localización celular, reparación del ADN y progresión del ciclo celular 5. Recientemente, sumaylación se ha demostrado que está alterado en el cáncer de hígado6,7,8,9, y los cambios en la SUMA ylasiación de proteínas específicas se ha descrito para desempeñar un papel en la progresión de enfermedades relacionadas con el cáncer9.
En los mamíferos, hay cinco paraólogos SUMO, SUMO-1 a SUMO-5. Hasta la fecha, no se dispone de pruebas experimentales sobre la existencia de reacciones endógenas de conjugación SUMO-4 y SUMO-5 endógenas en el nivel de proteína10,11,12. La SUMA en mamíferos se lleva a cabo por una cascada enzimática de tiol-éster que implica tres enzimas, la enzima activadora SUMO heterodimérica (SAE1/SAE2) o E1, la enzima conjugada SUMO (Ubc9) o E2 y una SUMO-E3-ligasa específica para cada proteína diana. La acción de varias familias de SUMO E3s parece estar en un equilibrio dinámico con proteasas específicas de SUMO (SUSPs o SENPs)13 haciendo que la reacción de SUMOylation sea altamente reversible. Además, sólo una pequeña fracción de la proteína SULOilada frente a la proteína total no SUMOylated está presente. De este lado, aislar las proteínas ENDógenas SULOiladas in vivo es bastante difícil13.
LA SUMOylation in vivo fue estudiada inicialmente por western blot utilizando anticuerpos contra la proteína de interés14. La inmunoprecipitación de la proteína se realizó con anticuerpos específicos y luego PAGE-western blot se llevó a cabo con anticuerpos anti-SUMO. El principal problema con esta estrategia es que los anticuerpos generados contra una proteína recombinante no modificada no siempre son capaces de inmunopreciar la forma SUPILAda de una proteína. Alternativamente, la cromatografía de níquel después de la expresión transitoria de las versiones etiquetadas con histidina (His6) de las moléculas SUMO y la proteína de interés se ha utilizado para estudiar la SUMOylation en las células. Sobre esta base, será más conveniente detectar formas modificadas SUMO de células que expresan establemente His6-SUMO15. Para los estudios in vivo, se demostró un enriquecimiento basado en motivos interactuadores en tándem-SUMO (SIM) para la purificación de conjugados de poliSUMO16. Otros grupos han estado utilizando enfoques SUMO de anticuerpos etiquetados con epítopos que proporcionan una herramienta factible para investigar la SUMOylación endógena en células primarias, tejidos y órganos17,18. Y más recientemente, Nielsen y sus colegas han utilizado el enriquecimiento basado en anticuerpos para identificar SUMO endógeno y específico del sitio en células y tejidos19.
Con el fin de proporcionar información complementaria sobre el papel de la SUMOylation in vivo, se desarrollaron entidades vinculantes SUMO (SUBE), también conocidas como trampas SUMO,20. De relevancia, las entidades de unión a ubiquitinas en tándem (TUBEs) se consideran precursoras conceptuales de las SUBE y son herramientas disponibles comercialmente para la detección y aislamiento de proteínas poliubiquiladas21. Los SUBE son proteínas recombinantes que comprenden repeticiones en tándem de SIS, reconociendo así las moléculas SUMO en proteínas modificadas con un aumento en la afinidad general por los sustratos SUMO. Las trampas SUMO se diseñaron mediante la introducción de un e3 ubiquitina-proteína ligasa RNF4 y SIM3 motivos en tándem, en un vector que contiene glutatión S-transferasa (GST), una proteína portadora heteróloga20. Aunque los SUBE no se pueden utilizar correctamente para identificar proteínas diana monoSUMOylated, este método proporciona una herramienta para facilitar la purificación e identificación de proteínas diana poli-SUMO in vivo. Aquí, describimos la aplicación de SUBE para aislar proteínas SULOiladas tanto en células hepatomas humanas como en biopsias de hígado de ratón, una herramienta importante para el estudio del cáncer de hígado. En la Figura 1se muestra un esquema general del protocolo descrito en este manuscrito.

<table><tbody><tr><td>(Gnmt&minus;/&minus;)/ (Gnmt+/+) ratones</td><td>CIC bioGUNE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>BEBM</td><td>Lonza/Clonetics Corporation</td><td>cc-3171</td><td></td></tr><tr><td>BEGM Bullet Kit</td><td>Lonza/Clonetics Corporation</td><td>CC3170</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Microcolumnas C18</td><td>Millipore</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo I</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-136157</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos completos sin EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14431-01</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>e9644</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Life Technologies</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión perlas de agarosa</td><td>Sigma</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GST-Control</td><td>SignalChem</td><td>G52-30H</td><td></td></tr><tr><td>GST-SUBEs</td><td>SignalChem</td><td>S291-340G</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>CLS (Servicio de líneas celulares)</td><td>300156</td><td>https://clsgmbh.de/</td></tr> <tr><td>IAA (2-yodoacetamida)</td><td>Merck</td><td>L58046844</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo LKB1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32245</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller Rotator</td><td>LABNET</td><td>H5500</td><td>https://www.labnetinternational.com</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404041000</td><td></td></tr><tr><td>nanoElute</td><td>BRUKER</td><td></td><td>https://www.bruker.com/</td></tr> <tr><td>NEM (N-Ethylmaleimida)</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Fluka</td><td></td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Peaks software</td><td>Bioinformática Soluciones S.A.</td><td></td><td>http://www.bioinfor.com/</td></tr> <tr><td>Fosfoetanolamina</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Solución Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>PR-619</td><td>Merck</td><td>662141</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>Bertin Technologies</td><td>P000669-PR240-A</td><td></td></tr><tr><td>PSA</td><td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>PSG</td><td>Life Tecnologías</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>SUMO2/3 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>Ab3742</td><td></td></tr><tr><td>THLE-2</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2706</td><td>http://www.lgcstandards-atcc.org</td></tr><tr><td>timsTOF Pro con espectrómetro de masas</td><td>PASEF BRUKER</td><td></td><td>https://www.bruker.com/</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

entidades de unión sumo (sube) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome sumo en cáncer de hígado

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

La modificación post-traduccional es un mecanismo clave que regula la homeostasis proteica y la función en las células eucariotas. Entre todas las proteínas similares a la ubiquitina en el cáncer de hígado, la modificación por SUMO (Pequeño MOcificador de Ubiquitina) ha recibido la mayor atención. El aislamiento de proteínas ENDógenas SUPILAdas in vivo es un reto debido a la presencia de proteasas activas específicas de SUMO. Los estudios iniciales de SUMOylation in vivo se basaron en la detección molecular de proteínas SUCULadas específicas (por ejemplo, por mancha occidental). Sin embargo, en muchos casos, los anticuerpos, generalmente hechos con proteína recombinante no modificada, no inmunopreciaban las formas SULOtiladas de la proteína de interés. La cromatografía de níquel ha sido el otro enfoque para estudiar la SUMOylation mediante la captura de versiones etiquetadas con histidina de moléculas SUMO. Este enfoque se utiliza principalmente en células que se expresan de forma estable o se transcuran transitoriamente con moléculas His-SUMO. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron entidades de unión SUMO (SUBE) para aislar proteínas ENDógenas SUTIladas. En este documento, describimos todos los pasos necesarios para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de sustratos SUMarioados a partir de células de hepatoma humano y tejidos hepáticos de un modelo de ratón de cáncer de hígado mediante el uso de SUBE. En primer lugar, describimos los métodos involucrados en la preparación y lisis de las células de hepatoma humano y muestras de tejido tumoral hepático. A continuación, se detalla una explicación detallada de la preparación de los SUBE y los controles junto con el protocolo para los ensayos desplegables de proteínas. Por último, se proporcionan algunos ejemplos con respecto a las opciones disponibles para la identificación y caracterización del proteoma SUMAlado, a saber, el uso de análisis de western-blot para la detección de un sustrato específico de SUMOylated a partir de tumores hepáticos o el uso proteómica por espectrometría de masas para la caracterización de alto rendimiento del proteoma y el interactoma SUMAylados en células de hepatoma.

Identificación de un sustrato específico de SUMAylación en biopsias de tumores hepáticos por Western Blot Analysis
La quinasación hepática B1 (LKB1) SUMOylation ha demostrado recientemente ser un importante factor oncogénico en el cáncer de hígado9,25. Los ratones deficientes en glicina N-metiltransferasa (Gnmt),a menudo conocido como Gnmt,es un modelo que desarrolla espontáneamente carcinoma hepatocelular (HCC), el tipo más común de cáncer de hígado primario. Los SUBE se utilizaron para enriquecer y aislar las proteínas SUMIladas tanto en ratones Gnmt/o con ratones con cáncer de hígado como en sus "littermates de tipo salvaje" (Gnmt+/+). En la Figura 2a, se incluyen la tinción de Ponceau S de las tres fracciones diferentes (entrada, FT y BOUND) obtenidas en el ensayo desplegable SUBE. Una mancha de Ponceau S es útil para controlar un posible efecto nocivo en la carga de proteínas manchadas para ser evaluadas por las manchas occidentales. En la Figura 2b se muestra un análisis de lKB1 de LKB1 mediante subE para capturar LKB1 endógeno. Los niveles de LKB1 SUMOylation se incrementan en tumores hepáticos. En el caso del análisis de manchas occidentales, se observaron cargas iguales y proteínas transferidas por la tinción Ponceau de la fracción de entrada y no se modificaron significativamente después de lavados (flujo a través de fracción). La cantidad de proteína capturada con SUBE fue significativamente mayor, particularmente en los tumores. Alternativamente, la tinción de un gel duplicado con Azul Coomassie puede proporcionar información similar. Las proteínas pegajosas como las formas p53 o SUMOylated de algunas proteínas pueden unirse al control del GST. Para eliminar el fondo, utilice perlas de agarosa de baja densidad, realice un recubrimiento con BSA o incorpore lavados adicionales. Sin embargo, esto podría afectar a aplicaciones como la espectrometría de masas y podría resultar en la pérdida de proteínas que interactúan con baja afinidad.
Caracterización del Interactome SUMO en Células de Hema Humana por Análisis de Espectrometría de Masas
Para investigar la capacidad de la trampa SUMO para interactuar con proteínas NATURALmente SUpiladas, se utilizaron las líneas celulares THLE2 epitéliales epitéliales hepáticos no transformados. El primer paso es la visualización del material total capturado con SUBEs y el uso de GST como un control negativo. Para ello, podemos utilizar protocolos convencionales de tinción de proteínas como se muestra en la Figura 3a. Luego, realizamos análisis de espectrometría de masas. Se identificaron un promedio de 2268 proteínas en las muestras de Huh7 GST (2339, 2297 y 2168 para cada carga, respectivamente), mientras que 2812 proteínas se identificaron de media en la muestra de SubEs Huh7 (2815, 2817 y 2806). Después de la resta, 742 proteínas se enriquecieron en los SUBE. Por otro lado, se identificó un promedio de 2497 proteínas en las muestras THLE2 GST (2476, 2520 y 2495, respectivamente) y 2763 en las SUBE (2823, 2783 y 2684). De ellos, 577 se consideraron enriquecidos en las muestras de SUBE. El análisis de réplicas técnicas recupera el mapa de calor que se muestra en la Figura 3b,que se calculó utilizando la configuración predeterminada disponible (distancia euclidiana, vinculación media y preprocesado con k-means). El mapa de calor representa la distribución de las 100 proteínas más significativas y exclusivamente enriquecidas en cada línea celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático del diagrama de flujo de protocolo utilizado para el enriquecimiento, aislamiento e identificación y caracterización del proteome in vivo con SUMOylated para el estudio del cáncer de hígado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig02.jpg"> Figura 2: Modificación de LKB1 por SUMO-2 en modelos de ratón de Carcinoma Hepatocelular. (a ) Tinción de Ponceau S de las tres fracciones diferentes (entrada, flujo a través de (FT) y BOUND) obtenidas en el ensayo desplegable SUBE. (b) Análisis de la mancha occidental de LKB1 mediante entidades de enlace SUMO (SUBE) para capturar SUMOylated ENDógeno LKB1; GAPDH se utiliza como control de carga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig03.jpg"> Figura 3: Diferencias entre el proteome CONsumión entre las líneas celulares humanas tumoralEs Huh-7 y THLE2 epitelial hepática no transformada. (a) Tinción sypro del material proteico capturado, con GST (control negativo) y SUBEs. (c) Mapa de calor que representa las proteínas enriquecidas diferencialmente en las muestras de HUH-7 y THLE2 SUBE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer, aislar, identificar y caracterizar proteínas modificadas por SUMO in vivo tanto de células de hepatoma humanos como de tumores hepáticos obtenidos a partir de modelos de ratón de carcinoma hepatocelular mediante el uso de entidades de unión SUMO (SUBE).

Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Las entidades de unión a SUMO permiten aislar proteínas SUMOiladas endógenas in vivo. Esto es bastante difícil debido a la presencia de proteasa activa específica de SUMO y las bajas fracciones de proteínas SUMOylated in vivo. El aislamiento del proteome SUMOylated mediante el uso de entidades de unión SUMO es ventajoso, ya que aplaza un aumento en la afinidad general por sustratos SUMO.Esto se debe al hecho de que los SUBEs son comunes en proteínas que comprenden repeticiones en tándem de SIM, reconociendo así específicamente moléculas SUMO en proteínas modificadas. El uso de entidades de unión SUMO para el aislamiento y caracterización del proteomo SUMOylated en el cáncer de hígado es un método rápido y sensible. Proporciona información pasada sobre el papel bastante desconocido de la vía de suma en el cáncer de hígado en un enfoque terapéutico potencial.Las entidades de unión SUMO se pueden utilizar para aislar y caracterizar el proteomo SUMOylated en otros tejidos además del hígado, tanto de muestras humanas como de modelos animales, así como en varios modelos celulares. Aunque esta técnica es fácil de realizar, se debe tener cuidado al analizar varias muestras en el mismo tipo. más frío a los varios pasos involucrados.Por lo tanto, recomendamos una nivelación cuidadosa de los tubos antes de iniciar este experimento. La demostración visual del uso de entidades vinculantes SUMO facilita la revolución de este protocolo especialmente debido a las dificultades de manejo de los bits y la pérdida de material durante el protocolo. Las células de hepatoma humanas se han preparado previamente mediante el recubrimiento de células en placas P100 a una densidad de 1,2 a 1,5 millones de células por plato y las mantienen en medios de crecimiento estándar a 37 grados centígrados.Cuando esté listo para usar las células, aspire el medio de las placas y lávelos con cinco milímetros de PBS estéril. Coloque la placa sobre hielo y agregue 500 microlitros de tampón de lelisis complementados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego usa un rascador de células para raspar suavemente las células de la parte inferior de la placa en el medio de la lysis.Alternativamente, cosecha las células por tripsinización y agrega un mililitro de trippsina-EDTA a la placa asegurándote de que las células estén cubiertas. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante cinco minutos para permitir que se desprendan de la placa, luego agregue dos mililitros de medio de crecimiento precalentó para detener la trippsinación. Centrifugar las células a 150 veces G durante 10 minutos y aspirar el sobrenadante.Luego lave las células con PBS y centrifugar durante otros 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y añadir 500 microlitros de tampón de lelisis. Centrifugar las células de la lese a 15000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos, luego transfiera los sobrenadantes a un tubo fresco y deseche el pellet.Cuando esté listo para usar los hígados de ratón cosechados, homogeneice 75 miligramos de fragmentos congelados frescos o es ajustados en un mililitro de tampón de lysis helada. Ejecute el homogeneizador de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Después de la homogeneización del tejido, centrifugar las muestras a 15000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y deseche el pellet. Preparar cuentas de glutatión añadiendo un mililitro de agua desimaso a 70 miligramos de cuentas y reconstituyéndolas durante la noche en cuatro grados Celsius. Después de la hinchazón, lave las cuentas tres veces con 10 mililitros de agua desimasoonizada o PBS, centrifugando a 300 veces G durante cinco minutos después de cada lavado.Después de los lavados, resuspender las perlas en un mililitro de PBS para obtener una suspensión del 50% para cada muestra a 100 microgramos de GST-SUBEs o control GST a 100 microlitros de la lodo de perlas de glutatión y 500 microlitros de PBS. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas mientras gira, luego recuperar las perlas por centrifugación a 300 veces G durante cinco minutos y resuspend las resuspender en PBS. Tome el 10% del lisato celular previamente preparado y diluya en un volumen igual de tampón de ebullición 3X.Añadir 450 microlitros del licato clarificado a 100 microlitros de la suspensión de perlas de glutatión. Incubar el izado con las perlas a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas mientras gira lentamente. Después de la incubación, gire hacia abajo las cuentas a 300 veces G durante cinco minutos y recoja el sobrenadante para su análisis.Transfiera el 10% del volumen total a un tubo separado y añada un volumen igual de tampón de ebullición 3X. Lave la muestra restante tres veces añadiendo un mililitro de PBS helado con 05%Tween 20 y girando hacia abajo a 300 veces G y cuatro grados centígrados durante un minuto. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante asegurándose de que no quede líquido.A continuación, eluda la muestra con 15 microlitros de tampón de ebullición 3X y 15 microlitros de tampón de lisis. Ejecute un análisis de manchas occidentales de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Si realiza la espectrometría de masas, desalte los péptidos utilizando microcolumnas C18 de punta de etapa y resusppend en ácido fórmico del 0,1% antes del análisis.Cargue las muestras en un sistema LC-MS y analícelas por triplicado. Continúe con la identificación de proteínas y el cálculo de la abundancia utilizando el software asociado. Realice análisis estadísticos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Este protocolo se ha utilizado para aislar las proteínas SUMOylated en ratones con deficiencia de glicina N-metiltransferasa que causa el desarrollo espontáneo del cáncer de hígado y sus littermatos de tipo salvaje. La tinción de Ponceau S se realizó en las fracciones de entrada, flujo y BOUND del ensayo desplegable SUBEs. El análisis de LKB1 de LKB1 capturado con SUBEs muestra que los niveles de SUMA DE LKB1 se incrementan en tumores hepáticos.Las células hepatoma humanas y las células epiteliales hepáticas no transformadas se utilizaron para investigar la capacidad de la trampa SUMO para interactuar con proteínas SUMOylated naturalmente. En primer lugar, se utilizó la tinción de proteínas convencional para visualizar el material total capturado con LOS SUBEs. Entonces la espectrometría de masas mostró que 742 proteínas se enriquecieron en la muestra de SUBEs de células de hepatoma y 577 se enriquecieron en la muestra de SUBEs de células epiteliales no transformadas del hígado.Al realizar experimentos con SUBEs, es importante mantener las células y tejidos en el hielo y añadir mililitros específicos al tampón de la leliación para mantener la pureza de SUMOylated. Después de la visualización del proteome SUMOylated con SUBEs, podemos encontrar la caracterización utilizando el análisis de manchas occidentales o la espectrometría de masas. La aplicación de los SUBEs para aislar y caracterizar el proteoma SUMOylated en los tejidos del cáncer hepático y las células del hepatoma está allanando el camino para explorar el papel de las modificaciones post-traduccionales del SUMO en el cáncer de hígado que pueden proporcionar un mecanismo terapéutico potencial.

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video demuestra el método in vitro para la SUMOilación de proteínas de sustrato utilizando una cascada de enzimas secuencial. Además, el estado SUMOilado de la proteína se identifica mediante la técnica de electroforesis e inmunotransferencia.

Ensayo de SUMOilación: una técnica in vitro para detectar el estado de SUMOilación de proteínas sustrato mediante inmunotransferencia

Los análisis en profundidad de los proteomas de las células cancerosas facilitan la identificación de nuevas dianas farmacológicas y biomarcadores de diagnóstico. Describimos un flujo de trabajo experimental para el análisis cuantitativo de (fosfo-)proteomas en subpoblaciones de células cancerosas derivadas de tumores líquidos y sólidos. Esto se logra combinando estrategias de enriquecimiento celular con espectrometría de masas cuantitativa basada en Super-SILAC.

Misa cuantitativa espectrometría de perfiles de los proteomas de células del cáncer derivados de líquidos y tumores sólidos

Proteínas familiares pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) se conjugan para los residuos de lisina de las proteínas diana para regular diversos procesos celulares. Este papel describe un protocolo para la detección de la proteína retinoblastoma (Rb) la sumoilación condiciones endógenas y exógenas en células humanas.

En Vivo Detección y análisis de la sumoilación de la proteína Rb en células humanas

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .

In Vitro Ensayo de la sumoilación estudiar SUMO E3 ligasa actividad

Algoritmos existentes generan una solución para un conjunto de datos de detección de biomarcadores. Este protocolo demuestra la existencia de varias soluciones igualmente eficaces y presenta un software fácil de usar para ayudar a los investigadores biomédicos a investigar sus conjuntos de datos para el reto propuesto. Científicos de la computación también pueden proporcionar esta característica en sus biomarcadores algoritmos de detección.

Selección de varios subconjuntos de biomarcadores con semejantemente eficaz clasificación binaria actuaciones

El SUMO es una proteína modificadora de ubiquitina, esencial y muy conservada. En este protocolo Describimos el uso de una proteína de captura de SUMO recombinante con tolerancia al estrés (kmUTAG) para visualizar conjugados de SUMO nativos, sin etiquetar y su localización en una variedad de tipos de células.

Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Aprende a aislar y caracterizar proteínas SUMOiladas en cáncer de hígado usando entidades de unión SUMO (SUBEs). Este método permite identificar el proteoma SUMO en células de hepatoma humano y tumores hepáticos de ratón.

Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado (Video) | JoVE Journal

Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado

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