Name: Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprende a analizar N-glicanos de IgG mediante cromatografía líquida ultra-performance (UPLC). Este método sensible y reproducible permite separar isómeros glicánicos con aplicaciones en diagnóstico médico y estudios de glicobiología.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Natural Science Foundation of China (81673247 y 81872682) y Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

Todos los temas incluidos en el protocolo han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad Médica Capital, Beijing, China12. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada tema al comienzo del estudio.
1. Aislamiento IgG
<ol><li>Preparar los productos químicos incluyendo tampón de unión (sina tamponada de fosfato, PBS): 1x PBS (pH a 7,4), tampón neutralizante: 10x PBS (pH a 6,6-6,8), eluyente: 0,1 M de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyente: 1 M de bimonio de amonio, tampón de carbonato almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M de bimonio de amonio, tampán almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M de bimonio de amonio, tampán almacenado: 20% de ácido fórmico etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH a 7,4), solución limpiadora para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol. NOTA: El nivel de pH es crítico en este protocolo. La elución de IgG requiere un pH muy bajo, y existe el riesgo de pérdida de ácidos siálicos debido a la hidrólisis ácida. Por lo tanto, la elución se produce en cuestión de segundos, y el pH se restaura rápidamente a la neutralidad, preservando la integridad de IgG y los ácidos siálicos.</li>
	<li>Preparar las muestras: descongelar la muestra de plasma congelado y luego centrifugar a 80 x g durante 10 min, y dejar la placa monolítica de proteína G y los productos químicos antes mencionados durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Transferir una muestra de 100 l (que se puede utilizar para detectar 2 veces para evitar la primera falla) en una placa de recogida de 2 ml (aquí, un total de seis muestras estándar, una muestra de control [agua ultrapura] y 89 muestras de plasma fueron diseñadas para 96 placas de pozos y asignadas aleatoriamente al plato).</li>
	<li>Diluir las muestras con 1pbS por 1:7 (v/v).</li>
	<li>Limpie una placa de filtro de polipropileno hidrófilo (GHP) de 0,45 m con 200 ml de agua ultrapura (repetir 2x).</li>
	<li>Transfiera las muestras diluidas a la placa de filtro y filtre las muestras en la placa de recogida utilizando una bomba de vacío (controle la presión de vacío a 266.6-399.9 Pa).</li>
	<li>Preparación de las placas monolíticas de proteína G<ol>
<li>Deseche el búfer de almacenamiento.</li>
		<li>Limpie las placas monolíticas con 2 ml de agua ultrapura, 2 ml de 1x PBS, 1 ml de ácido fórmico de 0,1 M, 2 ml de 10 pbS 10 x, 2 ml de 1 x PBS (secuencialmente) y retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera las muestras filtradas a la placa monolítica de proteína G para la unión y limpieza de IgG, luego limpie las placas monolíticas con 2 ml de 1x PBS (repetir la limpieza 2x).</li>
	<li>Eluir IgG con 1 ml de ácido fórmico de 0,1 M y filtrar las muestras en la placa de recogida mediante bomba de vacío, a continuación, añadir 170 ol de 1 M de bicarbonato de amonio en la placa de recogida.</li>
	<li>Detectar la concentración de IgG utilizando un espectrofotómetro de absorción (longitud de onda óptima de 280 nm).<ol>
<li>Abra el software y seleccione el modo proteína-CY3.</li>
		<li>Dibuja 2 s de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla, luego haz clic en Blanco en el software para borrar la pantalla (repetir 1x).</li>
		<li>Dibuja 2 ml de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla y, a continuación, haz clic en Muestra en el software para detectar el agua ultrapura.</li>
		<li>Dibuje 2 s de la muestra de IgG y cárguelo en la pantalla, luego haga clic en Muestra en el software para detectar la muestra.</li>
		<li>Dibuja 2 s de agua ultrapura y cárguelo en la pantalla, luego haz clic en Blanco en el software para borrar la pantalla.</li>
		<li>Cierre el software. NOTA: La fórmula para calcular la concentración de IgG es la siguiente: CIgG - coeficiente de absorción/extinción (13,7) x 1.000 g/ml</li>
	</ol></li>
	<li>Poner el IgG extraído para secar en un horno a 60 oC y conservar el IgG extraído (300 l de IgG extraído durante 4 h).<ol>
<li>Retirar 300 s de IgG extraído si la concentración es superior a 1.000 g/ml.</li>
		<li>Retirar 350 s de IgG extraído si la concentración está entre 500-1.000 g/ml.</li>
		<li>Retirar 400 s de IgG extraído si la concentración se encuentra entre 200-500 g/ml.</li>
		<li>Retirar 600 ml de IgG extraído si la concentración es inferior a 200 g/ml. NOTA: La concentración de IgG debe ser preferiblemente de >200 g/ml para su posterior detección. La cantidad media de IgG debe ser preferiblemente >1.200 g, que se puede probar 2 veces en caso de que falle la primera prueba.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpieza de la placa monolítica de proteína G para su reutilización<ol>
<li>Lave la placa con 2 ml de agua ultrapura, 1 ml de 0,1 M NaOH (para eliminar proteínas precipitadas), 4 ml de agua ultrapura y 4 ml de 1 x PBS (secuencialmente), luego retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.</li>
		<li>Lave la placa con 2 ml de agua ultrapura, 2 ml de 30% de propan-2-ol (para eliminar proteínas hidrófobas unidas), 2 ml de agua ultrapura y 4 ml de 1pbS (secuencialmente), luego retire el líquido que fluye con una bomba de vacío.</li>
		<li>Lavar la placa con 1 ml de tampón (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) y añadir 1 ml de tampón (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) a la placa, luego dejar la placa a 4 oC.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lanzamiento de Glycan
<ol><li>Preparar el IgG seco y almacenar los productos químicos incluyendo 1.33% SDS, 4% Igepal (almacenar lejos de la luz), y 5x PBS en RT.</li>
	<li>Preparar la enzima PNGase F diluyendo la enzima 250 U con 250 ml de agua ultrapura.</li>
	<li>Desnaturalización de IgG<ol>
<li>Añadir 30 sl de 1,33% de SDS y mezclar por vórtice, transferir la muestra a un horno de 65 oC durante 10 minutos, luego retirarla del horno y dejar reposar durante 15 minutos.</li>
		<li>Añadir 10 s de 4% Igepal y colocarlo en la incubadora de agitación durante 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminación y liberación de glicanos<ol>
<li>Añadir 20 s de 5x PBS y 30-35 l de 0,1 mol/L NaOH para regular un pH de 8,0, y mezclar por vórtice. Añadir 4 l de enzima PNGase F y mezclar por vórtice. A continuación, incubar durante 18-20 h en un baño de agua de 37oC.</li>
		<li>Poner los glicanos liberados a secar en un horno a 60 oC durante 2,5-3,0 h.</li>
		<li>Guarde los glicanos liberados a -80 oC hasta que se mmeasuremente más. NOTA: Este paso es crítico. La clave para la liberación de glicano es mejorar la actividad de la enzima PNGase F para maximizar su eficiencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Etiquetado y purificación de glicanos
<ol><li>Preparar el reactivo de etiquetado 2-aminobenzamida (2-AB) con 0,70 mg de 2-AB, 10,50 l de ácido acético, 6 mg de cianoborohídrido sódico (NaBH3CN) y 24,50 l de sulfóxido de dimetil (DMSO) (volumen total a 35 ol). A continuación, agregue ácido acético, 2-AB, y NaBH3CN en el DMSO en orden.</li>
	<li>Etiquetar los glicanos utilizando 35 l de reactivo de etiquetado de 2-AB, transferir los glicanos etiquetados al oscilador durante 5 minutos, transferir al horno durante 3 h a 65 oC, luego transferir a RT durante 30 minutos. NOTA: Todo el paso de etiquetado de glicano debe realizarse mientras está protegido de la luz.</li>
	<li>Prerretíe una placa de filtro De0m de 0,2 m con 200 ml de etanol al 70%, 200 ml de agua ultrapura y 200 ml de acetonitrilo al 96% (4 oC) y, a continuación, retire los residuos con una bomba de vacío.</li>
	<li>Purificación de glicano 2-AB etiquetado<ol>
<li>Añadir 700 l de acetonitrilo al glicano etiquetado 2-AB y transferira a una incubadora de agitación durante 5 min.</li>
		<li>Centrífuga a 134 x g durante 5 min (4oC).</li>
		<li>Transfiera la muestra a una placa de filtro GHP de 0,2 m durante 2 minutos y retire el filtrado (líquido de flujo) utilizando una bomba de vacío.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar el glicano etiquetado 2-AB con 200 ml de acetonitrilo al 96% (4 oC) y retirar el filtrado (líquido que fluye) con una bomba de vacío 5x-6x.</li>
	<li>Elute 2-AB glicano etiquetado con 100 l de agua ultrapura 3x.</li>
	<li>Transfiera el glicano 2-AB a un horno para secara a 60oC durante 3,5 h.</li>
	<li>Guarde los N-glicanos etiquetados a -80 oC hasta que se manda más.</li>
</ol>4. Cromatografía de interacción hidrófila y análisis de glicanos
<ol><li>Acondicionamiento de instrumentos UPLC y preparación de fases móviles<ol>
<li>Preparar fases móviles incluyendo disolvente A: 100 mM de formato de amonio (pH a 4,4), disolvente B: 100% acetonitrilo, disolvente C: 90% agua ultrapura (10% metanol) y disolvente D: 50% metanol (agua ultrapura).</li>
		<li>Abra el software para controlar las fases móviles.</li>
		<li>Lave los instrumentos UPLC a un caudal de equilibrio de 0,2 ml/min (50% disolvente B y 50% disolvente C) durante 30 minutos, luego a un caudal de 0,2 ml/min (25% disolvente A y 75% disolvente B) equilibrado durante 20 minutos y, a continuación, un caudal de equilibrio de 0,4 ml/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disolver los Nglicanos etiquetados con 25 ml de una mezcla de acetonitrilo al 100% y agua ultrapura en una proporción de 2:1 (v/v). A continuación, centrifugar a 134 og durante 5 min (4 oC) y cargar 10 sL de los N-glicanos etiquetados en los instrumentos UPLC. </li>
	<li>Separe los N-glicanos etiquetados a un caudal de 0,4 ml/min con un gradiente lineal de 75% a 62% de acetonitrilo durante 25 min. A continuación, realice una ejecución analítica por la escalera de calibración de dextran/columna de glucopéptido en una UPLC a 60 oC (aquí, las muestras se mantuvieron a 4 oC antes de la inyección).</li>
	<li>Detectar fluorescencia De N-glicano a longitudes de onda de excitación y emisión de 330 nm y 420 nm, respectivamente. </li>
	<li>Integre los glicanos en función de la posición máxima y el tiempo de retención.</li>
	<li>Calcular el valor relativo de cada pico de Glycan (GP)/todos los picos de Glican (GP) (porcentaje, %) de la siguiente manera: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
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<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

UPLC sirve como método de análisis cuantitativo relativo5,15. Los resultados indican que UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y precisión cuantitativa relativa. La cantidad de glicanos en cada pico se expresa como un porcentaje del área integrada total utilizando UPLC, que es el valor relativo. La cuantificación relativa mejora la comparabilidad de las muestras de prueba. Además, 96 placas de proteína G de pozo se utilizan para p...

N-glicosilación de proteínas humanas es una modificación post-traduccional común y esencial1 y puede ayudar a predecir la aparición y el desarrollo de enfermedades con relativa precisión. Debido a la complejidad de su estructura, se espera que haya más de 5.000 estructuras glicanas, proporcionando un gran potencial como biomarcadores diagnósticos y predictivos para enfermedades2. Se ha demostrado que los Nglicanos unidos a la inmunoglobulina G (IgG) son esenciales para la función de IgG, y IgG N-glicosilación participa en el equilibrio entre los sistemas pro yantiinflamatorio3. La IgG Ndiferencial-glicosilación participa en el desarrollo y la progresión de la enfermedad, representando tanto una predisposición como un mecanismo funcional implicado en la patología de la enfermedad. El papel inflamatorio de IgG N-glicosilación se ha asociado con el envejecimiento, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, y el cáncer4.
Con el desarrollo de la tecnología de detección, los siguientes métodos se utilizan más ampliamente en glicómics de alto rendimiento: cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultra rendimiento con detección de fluorescencia (UPLC-FLR), electroforesis de gel capilar multiplex con fluores inducidos por láser Detección de cence (xCGE-LIF), espectrometría de masas de tiempo de tiempo de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) y espectrometría de masas electrospray por cromatografía líquida (LC-ESI-MS) . Estos métodos han superado las deficiencias anteriores de bajo flujo, resultados inestables y especificidad de sensibilidad deficiente5,6.
UPLC es ampliamente utilizado para explorar la asociación entre IgG N-glicosilación y ciertas enfermedades (es decir, envejecimiento7, obesidad8, dislipidemia9, tipo II diabetes10, hipertensión11, accidente cerebrovascular isquémico12, y la enfermedad de Parkinson13). En comparación con los otros tres métodos antes mencionados, UPLC tiene las siguientes ventajas5,14. En primer lugar, proporciona un método de análisis cuantitativo relativo, y el análisis de datos que implica la normalización total del área mejora la comparabilidad de cada muestra. En segundo lugar, el costo de los equipos y la experiencia requerida son relativamente bajos, lo que facilita la implementación y transformación de biomarcadores de glicosilación en aplicaciones clínicas. Aquí se presenta una introducción a UPLC para que pueda ser más ampliamente utilizado.

<table><tbody><tr><td>2-aminobenzamida, 2-AB</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa colectora de 96 pocillos</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa filtrante de 96 pocillos</td><td>Pol</td><td>0,45 mmm GHP</td> Placa monolítica de 96 pocillos BIA <td></td></tr><tr><td></td><td>Separaciones</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de placa de 96 pocillos</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemania</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formiato de amonio</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora / balancín de agitación constante</td><td>Zhicheng fabricación de instrumentos analíticos Co., Ltd, China</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de calibración de dextrano / columna de glicopéptidos</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Columna</td><td></td></tr><tr><td>BEH Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato disódico</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hornos eléctricos</td><td>Tester instruments Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, América</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Kit de etiquetado</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemania</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de baja temperatura</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de baja temperatura</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colector Placa de 96 pocillos</td><td>Tecnología de vatios Co., Ltd, China</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medidor de agua pura Milli-Q</td><td>Millipore Co., Ltd, América</td><td>Ventaja A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probador de PH</td><td>Sartorius Co., Ltd, Alemania</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemania</td><td>4672100, 0.5-10&mu; l & 10-100&mu; l & 20-200&mu; l & 1000&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>PNGasa F enzima</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de líquido</td><td>de transferencia Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, América</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de temperatura ultrabaja</td><td>Thermo Co., Ltd, América</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografía líquida de ultra rendimiento</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bomba de vacío Watts technology Co., Ltd, China</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Máquina volatilizadora/Secadora</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Alemania</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Tester instruments Co., Ltd</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de pesaje</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunoglobulina g análisis de n-glycan por cromatografía líquida ultra-performance

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics es una nueva subespecialidad en investigación de sistemas omics que ofrece un potencial significativo en el descubrimiento de biomarcadores de próxima generación para la susceptibilidad a enfermedades, el descubrimiento de objetivos de fármacos y la medicina de precisión. Se han notificado igG N-glicanos alternativos en varias enfermedades crónicas comunes y se ha sugerido que tienen un gran potencial en aplicaciones clínicas (es decir, biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de enfermedades). Los IgG N-glicanos se caracterizan ampliamente utilizando el método de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC). UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y alta precisión cuantitativa relativa. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada, y la composición de glicanos y la abundancia relativa en plasma se caracterizan.

Como se muestra en la Figura 1,los IgG N-glicanos se analizaron en 24 picos iniciales de IgG glicano (GPs) basados en la posición máxima y el tiempo de retención. Las estructuras N-glicano están disponibles a través de la detección de espectrometría de masas según un estudio anterior (Tabla 1)15. Para garantizar que los resultados fueran comparables, se aplicó la normalización total de la superficie,...

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

La cromatografía líquida de ultra-rendimiento es la tecnología establecida para el análisis preciso de IgG n-glycan Debido a su sensibilidad parece ser y tiene capacidad para proporcionar una información específica de glicano Este método es fácil de usar y tiene un número de diferentes relativamente bajo costo de incrementos, alta reproducibilidad La capacidad de glycan isómeros. Las mediciones de proteínas en plasma podrían ser atractivas. en medicina.también asociado con IgG en base de glucosa y Tal y biológico que contiene a la población. Usted sabe que el estado impuro se utiliza para probar IgG en glicanos. En realidad, puede probar n-glicanos de proteína.Esto es necesario en una proteína cruzada de dos estados puros se puede aplicar a la proteína El proceso experimental OR es relativamente simple, mientras que el proceso experimental necesita ser estandarizado. El proceso experimental de extremo a extremo tarda tres días en funcionar, y los pasos experimentales deben memorizarse para dominar las habilidades experimentales. Para preparar las muestras, descongele la muestra de plasma congelado.Luego, centrifugar a 80 veces G durante 10 minutos. Dejar la placa monolítica de proteína G a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera 100 micrómetros de muestra a cada pozo de la placa de recogida de dos mililitros.Agregue agua ultra pura como una muestra de control. Diluir las muestras con un X PBS en una a siete unidades de volumen por volumen. Limpie una placa de filtro de polipropeno hidrófilo de 0,45 micras con 200 microlitros de agua ultra pura.Repita la limpieza dos veces adicionales. Transfiera las muestras diluidas a la placa de filtro y filtre las muestras en la placa colectiva utilizando una bomba de vacío con presión de 266,6 a 399,9 Pascals. Para preparar las placas monolíticas de la proteína G, primero deseche el tampón de almacenamiento.Limpie las placas monolíticas con dos mililitros de agua ultra pura, dos mililitros de un PBS X, un mililitro de ácido fórmico molar 0,17, dos mililitros de 10 PBS y dos mililitros de un PBS X secuencialmente. Retire el siguiente líquido con una bomba de vacío. Con una pipeta multicanal, transfiera las muestras filtradas a la placa monolítica de proteína G para la unión y limpieza de IgG.A continuación, agregue dos mililitros de un X PBS para limpiar las placas monolíticas. Retire el PBS con una bomba de vacío y repita la limpieza dos veces adicionales. Illute IgG con un mililitro de ácido fórmico molar 0,17, y filtre las muestras en la placa de recogida mediante bomba de vacío.A continuación, añada 170 microlitros de un bicarbonato de amonio molar en la placa de recogida. Detecte la concentración de IgG utilizando un espectrotómetro de absorción en la longitud de onda óptima de 280 nanómetros. Coloque el IgG extraído en un horno para secar a 60 grados centígrados durante tres horas.Determinar la cantidad a observar de acuerdo con su concentración como se describe en el manuscrito, y preservarlo en menos 80 grados Celsius. Reúna el IgG seco y almacene productos químicos como 1.33%SDS, cuatro por ciento IgePal y 5%PBS a temperatura ambiente. Preparar la enzima indoglycosidasa F diluyendo 250 unidades de enzima con 250 microlitros de agua ultra pura.Para desnaturalizar el IgG, añadir 30 microlitros de 1.33%SDS y mezclar por vórtice. Transfiera la muestra a un horno Celsius de 65 grados durante 10 minutos. Luego, retírelo del horno y déjelo enfriar durante 15 minutos.Agregue 10 microlitros de cuatro por ciento de IgePal en la misma muestra y colóquelo en una incubadora de temblores durante cinco minutos. Añadir 20 microlitros de cinco X PBS y 30 a 35 microlitros de hidróxido de sodio molar 0,1 para regular el pH a 8,0, y mezclar por vórtice. Añadir cuatro microlitros de enzima endoglycosidasa F, y mezclar por vórtice.Luego, incubar durante 18 a 20 horas en un baño de agua de 37 grados centígrados. Al día siguiente, coloque a los gitanos liberados en un horno a 60 grados centígrados para que se sequen durante dos horas y media a tres horas. Guarde los glicanos de liberación a menos 80 grados Centígrados hasta que se medin más.Preparar los dos reactivos de etiquetado de benzimida de aminoácidos con 24,5 microlitros de DMSO, 10,5 microlitros de ácido acético, 0,7 miligramos de dos aminoácidos benzimida y seis miligramos de cianoborohidruro de sodio. A continuación, en una habitación oscura, etiquete los glicanos añadiendo 35 microlitros de dos reactivos de etiquetado de benzimida amino. Transfiera los glcans etiquetados a un oscilador durante cinco minutos, y luego, transfieralo al horno durante tres horas a 65 grados centígrados.Después de eso, transfiételo a temperatura ambiente durante 30 minutos. El IgG n-glycase, lo etiquetaremos con el fin de ser detectados por la detección fluorescente de estado impuro. Pretraque una placa de filtro GHP de 0,2 micras con 200 microlitros de 70%etanol, 200 microlitros de agua ultra pura y 200 microlitros de 96%aceto nitrilo a cuatro grados Celsius.A continuación, retire los residuos con una bomba de vacío. Para purificar los dos glicanos etiquetados con benzimida amino, agregue 700 microlitros de 100% acetonitrilo a la muestra y transfiéralo a una incubadora de temblores durante cinco minutos. Centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Transfiera el sobreniente a una placa de filtro GHP de 0,2 micras durante dos minutos y retire el filtrado utilizando el vacío. Lave los dos aminoácidos de benzimida etiquetados con 200 microlitros de 96%acetonitrilo a cuatro grados centígrados, y retire el filtrado con una bomba de vacío de cinco a seis veces. Illute dos amino benzimida etiquetada glicano con 100 microlitros de agua ultra pura tres veces.Transfiera los dos aminoácidos de glucón incorporado a un horno para que se sequen a 60 grados centígrados durante tres horas y media. Guarde los n-glicanos etiquetados a menos 80 grados Centígrados hasta que se medin más. En primer lugar, abra el software para controlar las fases móviles.Lave los instrumentos UPLC con 50%solvente B y 50%solvente C a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 30 minutos. A continuación, lave con 25%solvente A y 75%solvente B a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 20 minutos. A continuación, agregue un caudal de 0,4 mililitros por minuto.Disolver los n-glicanos etiquetados con 25 microlitros de una mezcla de 100%acetonitrilo y agua ultra pura a un volumen de dos a uno por proporción de volumen. Luego, centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, y utilice una tubería seca para cargar 10 microlitros del sobrenadante en los instrumentos UPLC. Separe los n-glicanos etiquetados a un caudal de 0,4 mililitros por minuto con un gradiente lineal de 75% a 62%acetonitrilo durante 25 minutos.A continuación, realice un análisis ejecutado por la columna de glucopéptido de escalera de calibración Dexteran en un UPLC a 60 grados Celsius. Detectar fluorescentes n-glicanos en la cita X y longitudes de onda de emisión de 330 nanómetros y 420 nanómetros, respectivamente. Como se muestra en esta figura, Los IgG n-glycans se analizaron en 24 picos iniciales de Glicano IgG basados en la posición máxima y el tiempo de retención.Las estructuras n-glycan están disponibles en 24 tipos a través de la detección de espectrometría de masas. Para analizar la repetibilidad y estabilidad del método, la muestra estándar se probó en paralelo seis veces. Los picos de glicano con proporciones relativamente pequeñas mostraron errores de medición altos de más del 10% del coeficiente de variación.En la pieza e importante para formar a una estructura establecida de IgG n-glycan, especialmente para el establecimiento de terminal Por lo tanto, en lugar de 3.3 IgG n-glisa encontrado en es crítico en esto la importancia de IgG. Los glicanos de son conocidos por ser diferentes. Con los desarrollos en la prototómica de glicano, combinado en glicanos para explorar la información a esto de tal manera que se puede utilizar como un potencial para el diagnóstico de hoy.Después de este desarrollo de la técnica, proporciona una nueva manera de explorar la

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Aprende a analizar N-glicanos de IgG mediante cromatografía líquida ultra-performance (UPLC). Este método sensible y reproducible permite separar isómeros glicánicos con aplicaciones en diagnóstico médico y estudios de glicobiología.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

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