Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

La cromatografía líquida de ultra-rendimiento es la tecnología establecida para el análisis preciso de IgG n-glycan Debido a su sensibilidad parece ser y tiene capacidad para proporcionar una información específica de glicano Este método es fácil de usar y tiene un número de diferentes relativamente bajo costo de incrementos, alta reproducibilidad La capacidad de glycan isómeros. Las mediciones de proteínas en plasma podrían ser atractivas. en medicina.

también asociado con IgG en base de glucosa y Tal y biológico que contiene a la población. Usted sabe que el estado impuro se utiliza para probar IgG en glicanos. En realidad, puede probar n-glicanos de proteína.

Esto es necesario en una proteína cruzada de dos estados puros se puede aplicar a la proteína El proceso experimental OR es relativamente simple, mientras que el proceso experimental necesita ser estandarizado. El proceso experimental de extremo a extremo tarda tres días en funcionar, y los pasos experimentales deben memorizarse para dominar las habilidades experimentales. Para preparar las muestras, descongele la muestra de plasma congelado.

Luego, centrifugar a 80 veces G durante 10 minutos. Dejar la placa monolítica de proteína G a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera 100 micrómetros de muestra a cada pozo de la placa de recogida de dos mililitros.

Agregue agua ultra pura como una muestra de control. Diluir las muestras con un X PBS en una a siete unidades de volumen por volumen. Limpie una placa de filtro de polipropeno hidrófilo de 0,45 micras con 200 microlitros de agua ultra pura.

Repita la limpieza dos veces adicionales. Transfiera las muestras diluidas a la placa de filtro y filtre las muestras en la placa colectiva utilizando una bomba de vacío con presión de 266,6 a 399,9 Pascals. Para preparar las placas monolíticas de la proteína G, primero deseche el tampón de almacenamiento.

Limpie las placas monolíticas con dos mililitros de agua ultra pura, dos mililitros de un PBS X, un mililitro de ácido fórmico molar 0,17, dos mililitros de 10 PBS y dos mililitros de un PBS X secuencialmente. Retire el siguiente líquido con una bomba de vacío. Con una pipeta multicanal, transfiera las muestras filtradas a la placa monolítica de proteína G para la unión y limpieza de IgG.

A continuación, agregue dos mililitros de un X PBS para limpiar las placas monolíticas. Retire el PBS con una bomba de vacío y repita la limpieza dos veces adicionales. Illute IgG con un mililitro de ácido fórmico molar 0,17, y filtre las muestras en la placa de recogida mediante bomba de vacío.

A continuación, añada 170 microlitros de un bicarbonato de amonio molar en la placa de recogida. Detecte la concentración de IgG utilizando un espectrotómetro de absorción en la longitud de onda óptima de 280 nanómetros. Coloque el IgG extraído en un horno para secar a 60 grados centígrados durante tres horas.

Determinar la cantidad a observar de acuerdo con su concentración como se describe en el manuscrito, y preservarlo en menos 80 grados Celsius. Reúna el IgG seco y almacene productos químicos como 1.33%SDS, cuatro por ciento IgePal y 5%PBS a temperatura ambiente. Preparar la enzima indoglycosidasa F diluyendo 250 unidades de enzima con 250 microlitros de agua ultra pura.

Para desnaturalizar el IgG, añadir 30 microlitros de 1.33%SDS y mezclar por vórtice. Transfiera la muestra a un horno Celsius de 65 grados durante 10 minutos. Luego, retírelo del horno y déjelo enfriar durante 15 minutos.

Agregue 10 microlitros de cuatro por ciento de IgePal en la misma muestra y colóquelo en una incubadora de temblores durante cinco minutos. Añadir 20 microlitros de cinco X PBS y 30 a 35 microlitros de hidróxido de sodio molar 0,1 para regular el pH a 8,0, y mezclar por vórtice. Añadir cuatro microlitros de enzima endoglycosidasa F, y mezclar por vórtice.

Luego, incubar durante 18 a 20 horas en un baño de agua de 37 grados centígrados. Al día siguiente, coloque a los gitanos liberados en un horno a 60 grados centígrados para que se sequen durante dos horas y media a tres horas. Guarde los glicanos de liberación a menos 80 grados Centígrados hasta que se medin más.

Preparar los dos reactivos de etiquetado de benzimida de aminoácidos con 24,5 microlitros de DMSO, 10,5 microlitros de ácido acético, 0,7 miligramos de dos aminoácidos benzimida y seis miligramos de cianoborohidruro de sodio. A continuación, en una habitación oscura, etiquete los glicanos añadiendo 35 microlitros de dos reactivos de etiquetado de benzimida amino. Transfiera los glcans etiquetados a un oscilador durante cinco minutos, y luego, transfieralo al horno durante tres horas a 65 grados centígrados.

Después de eso, transfiételo a temperatura ambiente durante 30 minutos. El IgG n-glycase, lo etiquetaremos con el fin de ser detectados por la detección fluorescente de estado impuro. Pretraque una placa de filtro GHP de 0,2 micras con 200 microlitros de 70%etanol, 200 microlitros de agua ultra pura y 200 microlitros de 96%aceto nitrilo a cuatro grados Celsius.

A continuación, retire los residuos con una bomba de vacío. Para purificar los dos glicanos etiquetados con benzimida amino, agregue 700 microlitros de 100% acetonitrilo a la muestra y transfiéralo a una incubadora de temblores durante cinco minutos. Centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Transfiera el sobreniente a una placa de filtro GHP de 0,2 micras durante dos minutos y retire el filtrado utilizando el vacío. Lave los dos aminoácidos de benzimida etiquetados con 200 microlitros de 96%acetonitrilo a cuatro grados centígrados, y retire el filtrado con una bomba de vacío de cinco a seis veces. Illute dos amino benzimida etiquetada glicano con 100 microlitros de agua ultra pura tres veces.

Transfiera los dos aminoácidos de glucón incorporado a un horno para que se sequen a 60 grados centígrados durante tres horas y media. Guarde los n-glicanos etiquetados a menos 80 grados Centígrados hasta que se medin más. En primer lugar, abra el software para controlar las fases móviles.

Lave los instrumentos UPLC con 50%solvente B y 50%solvente C a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 30 minutos. A continuación, lave con 25%solvente A y 75%solvente B a un caudal de 0,2 mililitros por minuto durante 20 minutos. A continuación, agregue un caudal de 0,4 mililitros por minuto.

Disolver los n-glicanos etiquetados con 25 microlitros de una mezcla de 100%acetonitrilo y agua ultra pura a un volumen de dos a uno por proporción de volumen. Luego, centrifugar a 134 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, y utilice una tubería seca para cargar 10 microlitros del sobrenadante en los instrumentos UPLC. Separe los n-glicanos etiquetados a un caudal de 0,4 mililitros por minuto con un gradiente lineal de 75% a 62%acetonitrilo durante 25 minutos.

A continuación, realice un análisis ejecutado por la columna de glucopéptido de escalera de calibración Dexteran en un UPLC a 60 grados Celsius. Detectar fluorescentes n-glicanos en la cita X y longitudes de onda de emisión de 330 nanómetros y 420 nanómetros, respectivamente. Como se muestra en esta figura, Los IgG n-glycans se analizaron en 24 picos iniciales de Glicano IgG basados en la posición máxima y el tiempo de retención.

Las estructuras n-glycan están disponibles en 24 tipos a través de la detección de espectrometría de masas. Para analizar la repetibilidad y estabilidad del método, la muestra estándar se probó en paralelo seis veces. Los picos de glicano con proporciones relativamente pequeñas mostraron errores de medición altos de más del 10% del coeficiente de variación.

En la pieza e importante para formar a una estructura establecida de IgG n-glycan, especialmente para el establecimiento de terminal Por lo tanto, en lugar de 3.3 IgG n-glisa encontrado en es crítico en esto la importancia de IgG. Los glicanos de son conocidos por ser diferentes. Con los desarrollos en la prototómica de glicano, combinado en glicanos para explorar la información a esto de tal manera que se puede utilizar como un potencial para el diagnóstico de hoy.

Después de este desarrollo de la técnica, proporciona una nueva manera de explorar la