Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

Usando este sistema, podemos recoger los racimos submilimétricos de tejido adiposo humano, en el que todo el microambiente de las células regenerativas está intacto. Todo el sistema microvascular también está intacto, por lo que podemos utilizar este tipo de micro órganos para el trasplante in vivo para el cultivo in vitro y para el aislamiento celular para una mayor caracterización. La razón principal para el uso del sistema en el laboratorio de investigación es que el proceso es totalmente libre de enzimas, por lo que permite el procesamiento rápido y eficiente del tejido adiposo humano manteniendo una microarquitectura y será la microvasculatura del tejido totalmente intacto.

Y así podemos estudiar directamente un producto de terapia celular que ha demostrado ser ya muy útil en la clínica. Esta tecnología de sistema cerrado es una técnica fácil de usar para la cosecha, procesamiento y reinyección de tejido graso refinado intraoperatorio, y se puede aplicar con éxito en la ortopedia cosmética, la proctología y también la ginecología. Este método permite un mayor estudio del impacto de la grasa en la regeneración tisular.

El procedimiento será demostrado por Bianca Vezzani, becaria postdoctoral y por Mario Gómez-Salazar, quien es estudiante de doctorado. Trabajando en condiciones asépticas dentro de las 16 horas de la cosecha, coloque la muestra de abdominoplastia encima de un paño quirúrgico con la piel hacia arriba. Utilice una cánula de infiltración de tejido desechable para inyectar de 50 a 100 mililitros de solución de cloruro sódico de 37 grados Celsius 0,9% en el tejido adiposo subcutáneo.

Conecte una jeringa de bloqueo Luer de 10 mililitros a una cánula de liposucción desechable y agarre la muestra en la región cutánea cerca de un borde de la muestra, introduzca cuidadosamente la cánula en el tejido adiposo. Una vez que la cánula está dentro del tejido, extraiga el émbolo y mueva la cánula radialmente dentro de la muestra de tejido adiposo. Es importante manejar el tejido adiposo firmemente durante la lipo-aspiración.

Si no se recoge suficiente grasa, considere la posibilidad de realizar una inyección de solución salina adicional. Cuando la jeringa esté llena de lipo-aspirado, retire cuidadosamente la cánula del tejido y reemplace la jeringa completa con una jeringa vacía nueva hasta que se hayan cosechado un total de 60 mililitros de aspirado. Para la micro-fragmentación del lipo-aspirado, retire el dispositivo del paquete y verifique que la unidad principal esté conectada a la bolsa de residuos.

Coloque la bolsa de recogida de residuos en el suelo y asegúrese de que las válvulas estén fijadas a las tapas de la unidad de proceso. Perfore el puerto de conexión de la bolsa para conectar el pico de terminal de la línea de entrada a la bolsa salina y coloque la bolsa salina por encima de la unidad de procesamiento. Compruebe que las cinco abrazaderas conectadas a los tubos de los circuitos estén abiertas, coloque la unidad de procesamiento en una posición vertical, permita que la solución salina llene la unidad de procesamiento y confirme que el flujo llega a la bolsa de residuos.

Agitar la unidad de procesamiento para eliminar las burbujas de aire y colocar la unidad en una posición vertical con la tapa azul hacia arriba. Cierre la abrazadera junto a la línea de entrada y conecte una jeringa de lipoexpesado a la válvula autoroclusa de la tapa de entrada azul para comenzar a inyectar el lipoexpeto. Manteniendo la unidad de procesamiento vertical, empuje lentamente hacia abajo el émbolo de la jeringa hasta que todo el lipo-aspirado se haya transferido a la unidad.

Cuando se haya inyectado todo el lipo-aspirado, abra la abrazadera de entrada para restaurar el flujo salino y agitar vigorosamente la unidad de procesamiento durante al menos dos minutos, comprobando regularmente el flujo de la solución salina en la bolsa de residuos. Cuando la solución salina de la unidad de procesamiento se vuelva transparente, coloque la unidad con la tapa gris hacia arriba y cierre las abrazaderas situadas en el drenaje cerca de las tapas azules y grises. El tejido procesado flotará en la parte superior.

A continuación, llene una jeringa luer de 10 mililitros con solución salina y conecte la jeringa a la válvula de carga de la tapa azul. Conecte una jeringa de bloqueo Luer de 10 mililitros vacía con el émbolo completamente insertado a la válvula de la tapa gris. Inyecte firmemente la solución salina en la unidad de procesamiento desde la tapa azul, comprobando que la jeringa conectada a la válvula gris se está llenando con el tejido procesado.

Cuando se haya inyectado toda la solución salina, retire cuidadosamente ambas jeringas y repita la perfusión salina hasta que se haya recogido todo el tejido procesado. Al final del procesamiento, retire todas las jeringas, cierre todas las abrazaderas, desenganche la bolsa salina y deseche el dispositivo de acuerdo con los protocolos locales. Cuando se haya recogido todo el tejido procesado, transfiera el tejido adiposo microdes fragmentado a un recipiente estéril y agregue un volumen igual de medio de digestión al recipiente.

Coloque el recipiente sellado en un baño de agua agitado de 37 grados Celsius, establecido en 120 rotaciones por minuto durante 45 minutos, deteniendo la digestión con un volumen igual de solución de bloqueo al final de la incubación. Filtrar secuencialmente la muestra, primero a través de un colador celular de 100 micrómetros seguido de filtración a través de un colador celular de 70 micrómetros y centrifugar la suspensión filtrada durante cinco minutos a 200 g. Suspendemos el pellet en aproximadamente 5 mililitros de tónimero de eritrocitos durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Detenga la lelisis con un volumen igual de solución de bloqueo y filtre la solución a través de un colador celular de 40 micrómetros. A continuación, recoger las células de tejido adiposo micro-fragmentados por centrifugación y suspendemos el pellet en solución de bloqueo fresco con mezcla de harina para el recuento. Después de la disociación y la tinción de anticuerpos, las células grasas micro-fragmentadas se pueden llevar al citómetro de flujo para el análisis celular y / o clasificación.

La disociación mecánica de los lipo-aspirados manuales da como resultado la producción de tejido adiposo micro-fragmentado que consiste en un agregado de adipocitos que envuelven una red microvascular. El análisis de inmunofluorescencia de gelatina incrustada en tejido adiposo micro-fragmentado criofijo resalta la estructura, mostrando la red vascular marcada por el marcador celular endotelial Ulex Europaeus Agglutinin 1 receptor y que consiste principalmente en pequeños vasos capilares. En particular, pericitos que expresan antígeno neuro-glial 2 o receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas se distribuyen normalmente, envainando las células endoteliales.

Al excluir las células hematopoyéticas cd31 positivas y CD45 positivas, la presencia de per pericitos negativos CD34 positivos CD146 y células adventitiales CD146 negativas y CD34 positivas se pueden identificar dentro de la MAT. El tejido adiposo micro fragmentado puede ser procesado posteriormente por tinción inmunohistoquímica, cultivo in vitro o análisis secretoma para obtener una visión más profunda de la biología del tejido adiposo.

Esta técnica permite el estudio de diversos tejidos en su disposición natural, nativa y tridimensional como una especie de pequeños organoides, que son lo suficientemente pequeños como para ser trasplantados en ratones o para ser mantenidos en cultivos a largo plazo. Y utilizamos este sistema principalmente para abordar experimentalmente los diferentes microambientes específicos del órgano. Nuestros donantes de tejido adiposo no se conocen como portadores de infecciones transmisibles.

Sin embargo, en ausencia de cualquier otro cribado, todos los tejidos humanos deben considerarse potencialmente contaminados y manipularse en consecuencia.