Name: Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende un método colorimétrico optimizado para detectar primaquina antipalúdica en orina y suero humano mediante la reacción de Griess. Esta técnica simple y económica ofrece resultados comparables al HPLC con detección a vista desnuda.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores reconocen la beca Start-Up de la Universidad de Medicina China de Guangzhou y el proyecto de formación en investigación científica juvenil de GZUCM (2019QNPY06). También reconocemos el Centro de Investigación Médica Lingnan de la Universidad de Medicina China de Guangzhou por el apoyo en instalaciones.

1. Síntesis de Azos de colores
<ol><li>En un matraz inferior redondo de 25 ml (RBF), disolver anilina (0,1 mmol) y bisfosfato de primaquina (45,5 mg, 0,1 mmol) en 10 ml de solución de H3PO4 (5% v/v). Coloque el RBF en un baño de hielo, agregue una barra de agitación con el tamaño adecuado en la solución y coloque el RBF en una placa de agitación. NOTA: Para la síntesis de azo 3g (Figura 2), utilice 0,2 mmol de bisfosfato de primaquina.</li>
	<li>Disolver NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) en 1 ml de agua enfriada y luego añadir en la mezcla de reacción en forma de gota. Retire el baño de hielo y mantenga la mezcla de reacción agitada a temperatura ambiente.</li>
	<li>Supervise la reacción con una placa de cromatografía de capa fina (TLC) recubierta de gel de sílice. Utilice una mezcla de diclorometano (DCM)/metanol (MeOH) (vol/vol a 5:1) como eluyente para TLC. El producto azo exhibe manchas de colores en la placa TLC, que es fácil de distinguir por los ojos desnudos. Detenga la reacción cuando las manchas PMQ desaparezcan en TLC.</li>
	<li>Ajuste la mezcla de reacción a pH >10 por NaOH (2 M) en un baño de hielo. Utilice un embudo de separación de 50 ml para extraer la mezcla 3 veces con 20 ml de acetato de etilo para cada uno, combinar y concentrar la fase orgánica al vacío utilizando un evaporador rotatorio. NOTA: Antes de la extracción, ajuste el valor de pH de las soluciones de reacción por encima de 10. Esto puede mantener la amina primaria como su forma no ionizada, facilitando así la extracción.</li>
	<li>Purificar los residuos mediante cromatografía flash con gel de sílice de fase inversa bajo presión normal, utilizando MeOH/H2O como eluyente. Secar la solución del producto a través de la liofilización para dar los productos de azo deseados. NOTA: La misma reacción también se puede realizar en soluciones de HCl diluidas (0,2 M).</li>
</ol>2. Mediciones UV-Vis y Cálculo Teórico
<ol><li>Disolver el azo puro (50 oM) en agua destilada o en una solución de 5% H3PO4 (pH 1.1), respectivamente. Registre espectros de absorción UV-vis (250-700 nm) en un espectrofotómetro a temperatura ambiente (25 oC). Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.</li>
	<li>
Realice todos los cálculos teóricos para los productos PMQ y azo utilizando el programa Gaussian 16. Utilice la teoría funcional de densidad dependiente del tiempo (TD-DFT) con un conjunto de base 6-31G. Incluir efectos solventes por formalismo del modelo continuo polarizado (PCM) utilizando agua.
	<ol>
<li>Utilice software (por ejemplo, Chemdraw Office) para dibujar las estructuras y luego guardar la estructura como un archivo de entrada gaussiano (.gif).</li>
		<li>Abra el archivo gif con Vista Gauss y haga clic en el botón Calcular. Seleccione Configuración de cálculo gaussiano, Opt+Freqy estado de tierra-DFT-B3LYP-6-31G; a continuación, haga clic en Enviar. La optimización de geometría generará un archivo .log.</li>
		<li>Siguiendo el procedimiento anterior, utilice Gauss View para abrir este archivo de registro. Haga clic en Calcular configuración de cálculo gaussiano y seleccione energía y TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet solamente. A continuación, Enviar. El cálculo de energía generará otro archivo de registro y un archivo de cubo.</li>
		<li>Utilice la Vista Gauss para abrir el archivo de registro desde el cálculo de energía. Haga clic en Resultados-UV/Vis para ver la absorción prevista.</li>
		<li>Utilice la Vista Gauss para abrir el archivo de cubo. Haga clic en Resultados y seleccione acciones de superficie y contornos y nueva superficie para ver las órbitas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compare los resultados de la medición experimental y el cálculo gaussiano. Calcule el error de porcentaje entre los valores calculados y medidos, de acuerdo con la siguiente ecuación.               Error ? (Wmax cal.-Wmaxexper.) / Wmaxexper. | • 100% donde Wmax cal. representa la longitud de onda de absorción máxima del cálculo teórico y Wmax exper. representa la longitud de onda del resultado experimental.</li>
</ol>3. Determinación de PMQ
<ol><li>Medición PMQ utilizando una placa de 96 pocillos (Figura5)
	<ol>
<li>Disolver 4-metoxianilina en 0.2 M HCl para una solución de anilina de 200 mM, R1. Disolver el nitrito sódico en agua destilada para obtener una solución de 5 mM, R2. Mantener todas las soluciones en la nevera a 4 oC antes de su uso.</li>
		<li>Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 s de PMQ que contenga la muestra en la placa para mezclar con R1. A continuación, agregue 50 s l de R2 en la placa. Mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido.</li>
		<li>Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Repita 3x para cada prueba.  El producto azo es estable con exposición a la luz de la habitación; no es necesario mantener la placa bajo la oscuridad.</li>
		<li>Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva de calibración para la medición directa de PMQ en una muestra de orina
	<ol>
<li>Preparar soluciones PMQ utilizando orina sintética con concentraciones de PMQ a 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 M, respectivamente.</li>
		<li>Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 ml de solución de orina PMQ para mezclar con R1. A continuación, añadir 50 sl de R2 a la mezcla anterior. Mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, registre la absorbancia UV-vis a 504 nm.</li>
		<li>Genere una curva de calibración basada en las concentraciones de absorbancia I504 y PMQ. Utilice los valores de los pozos sin PMQ como espacio en blanco y reste los valores en blanco de todas las pruebas antes del procesamiento de datos.</li>
		<li>Realice un ajuste lineal para generar las ecuaciones lineales como Y - aX + b, donde Y es la intensidad de absorción en 504 nm, X es la concentración de PMQ, a es la pendiente, y b es la intercepción y de la línea lineal.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva de calibración para la medición directa de PMQ en una muestra de suero humano
	<ol>
<li>Preparar soluciones PMQ utilizando suero humano con concentraciones de PMQ a 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, M respectivamente.</li>
		<li>Agregue 100 l de R1 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 ml de solución sérica PMQ para mezclar con R1. Agregue 50 s l de R2 a la mezcla anterior y mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Exporte los datos como archivo .xls/.xlsx para su posterior análisis.</li>
		<li>Genere una curva de calibración basada en las concentraciones de absorbancia I504 y PMQ. Utilice los valores de los pozos sin PMQ como espacio en blanco y reste los valores en blanco de todas las pruebas antes del procesamiento de datos.</li>
		<li>Realice un ajuste lineal para generar las ecuaciones lineales como Y - aX + b, donde Y es la intensidad de absorción en 504 nm, X es la concentración de PMQ, a es la pendiente, y b es la intercepción y de la línea lineal.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de PMQ del suero
	<ol>
<li>Agregue una cierta cantidad de PMQ en el suero humano para simular el suero que contiene PMQ. Para la extracción de PMQ, añadir 6 ml de mezcla de acetato de etilo/hexano (7:1 v/v) en 2 ml de suero que contiene PMQ en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
		<li>Añadir al sistema de extracción 100 ml de solución de hidróxido de sodio (2 M). Agitar violentamente el tubo usando un mezclador de vórtice durante 30 s. Recoger la capa orgánica y concentrarla usando un evaporador rotatorio al vacío.</li>
		<li>Vuelva a disolver el residuo con 200 ml de agua destilada y elimine los componentes lipídicos insolubles mediante filtración a través de una membrana en forma de disco con un tamaño de poro de 220 nm. Utilice la solución final para la prueba.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar PMQ a partir del suero con extracción
	<ol>
<li>Siga los pasos 3.2 o 3.3 para generar la curva de calibración para PMQ en agua destilada. Extraiga PMQ de los sueros que contienen PMQ según el paso 3.4.</li>
		<li>Agregue 100 s de R1 y 50 l de solución PMQ en una placa de 96 pocillos. Agregue 50 sl de R2 a la mezcla anterior y mezcle las soluciones mediante pipeteo repetido.</li>
		<li>Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y registre la absorbancia UV-vis a 504 nm. Utilice los pozos con R1 y R2 pero sin PMQ como controles. Exporte los datos como archivos .xls/.xlsx para su posterior análisis.</li>
		<li>Restar los valores de control de los valores de absorbancia I504 para cada prueba y, a continuación, utilice el resultado para los cálculos de concentración de acuerdo con la ecuación de revestimiento de la curva de calibración. NOTA: El límite de detección (LOD) para PMQ en todos los casos se puede calcular según un método estándar22. El cálculo se basó en la función de calibración: LOD a 3,3 o SD/b, donde SD es la desviación estándar del espacio en blanco y b es la pendiente de la línea de regresión</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+in+vivax+malaria%3A+an+update+and+review+on+management+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues.</a> Malar Journal. 10, 351(2011).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+Artemisinin-Piperaquine+Mass+Drug+Administration+With+or+Without+Primaquine+Dramatically+Reduces+Malaria+in+a+Highly+Endemic+Region+of+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa.</a> Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).</li>
<li>Pavic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine+hybrids+as+promising+antimycobacterial+and+antimalarial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents.</a> European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).</li>
<li>McQueen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+cellular+localization+of+a+fluorescent+probe+of+the+antimalarial+8-aminoquinoline+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).</li>
<li>Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primaquine%3A+the+risks+and+the+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Primaquine: the risks and the benefits.</a> Malaria Journal. 13 (1), 418(2014).</li>
<li>Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+primaquine-induced+haemolysis+in+G6PD+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Beutler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective.</a> Blood. 111 (1), 16-24 (2008).</li>
<li>Endoh, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+determination+of+pamaquine%2C+primaquine+and+carboxy+primaquine+in+calf+plasma+using+electrochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).</li>
<li>Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+determination+of+primaquine+and+carboxyprimaquine+concentrations+in+plasma+and+blood+cells+in+Plasmodium+vivax+malaria+cases+following+chronic+dosage+with+primaquine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Applications%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).</li>
<li>Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantitation+of+chloroquine+and+primaquine+by+UPLC-DAD+and+comparison+with+a+HPLC-DAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method.</a> Malaria Journal. 14, 29(2015).</li>
<li>Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+illicit+drugs+in+human+urine+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).</li>
<li>Erni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+high-performance+liquid+chromatography+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry.</a> Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nitrite+and+nitrate+in+biological+fluids+by+assays+based+on+the+Griess+reaction%3A+Appraisal+of+the+Griess+reaction+in+the+l-arginine%2Fnitric+oxide+area+of+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research.</a> Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).</li>
<li>Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+a+known+gelator+scaffold+for+nitrite+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection.</a> Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).</li>
<li>Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+with+pendant+diazo-coupling+functionality+for+colorimetric+detection+of+nitrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).</li>
<li>Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Griess+reaction-based+paper+strip+for+colorimetric%2Ffluorescent%2FSERS+triple+sensing+of+nitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+colorimetric+detection+of+hydroxyl+radicals+based+on+a+modified+Griess+test%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test.</a> Talanta. 195, 152-157 (2019).</li>
<li>Pang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photo-responsive+macroscopic+switch+constructed+using+a+chiral+azo-calix%5B4%5Darene+functionalized+silicon+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface.</a> Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).</li>
<li>Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+naked-eye+ratiometric+and+colorimetric+receptor+for+anions+based+on+azo+dye+featuring+with+benzimidazole+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit.</a> Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Liu, F., Lou, J., Hristov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+responsive+nanoparticles+with+triggered+release+of+nitrite%2C+a+precursor+of+reactive+nitrogen+species%2C+for+enhanced+cancer+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization.</a> Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).</li>
<li>Deng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+Griess+reaction+on+the+important+anti-malarial+drug+primaquine+and+its+application+for+drug+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).</li>
<li>Shrivastava, A., Gupta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+determination+of+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation+of+the+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Chronicles+of+Young+Scientists%22%5BJournal%5D)">Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods.</a> Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Hemos descrito un método colorimétrico para la cuantificación conveniente de PMQ. Es potencialmente el método actual más simple y rentable. Lo que es más importante, este método ofrece la medición de PMQ basada en ojos desnudos sin utilizar ningún equipo.
La reacción Griess optimizada para la detección de PMQ puede generar un azo de color rojo con una absorción máxima a 504 nm. La influencia potencial de la absorción UV-vis de biomoléculas endógenas es limitada, lo que hace que el método sea p...

PMQ es uno de los fármacos antipalúdicos más importantes, funciona no sólo como un esquizontocida tisular para prevenir la recaída sino también como un gametocitocidio para interrumpir la transmisión de la enfermedad1,2,3,4. La hemólisis intravascular es uno de los efectos secundarios preocupantes de La PMQ, que se vuelve extremadamente grave en aquellos deficientes en G6PD. Se sabe que el trastorno genético G6PD se distribuye en todo el mundo con una frecuencia genética entre el 3 y el 30% en las zonas endémicas de la malaria. La gravedad de la debilidad de PMQ depende del grado de deficiencia de G6PD, así como de la dosis y de la duración de la exposición a PMQ5,6. Para reducir el riesgo, la OMS ha recomendado una dosis única baja (0,25 mg de base/kg) de PMQ para el tratamiento del paludismo. Sin embargo, esto todavía se desafia por las variaciones en la sensibilidad a los medicamentos del paciente5,7. El control de la dosis es necesario para evaluar la farmacocinética después de la administración de PMQ, lo que puede afectar el ajuste de dosis para un tratamiento exitoso con toxicidad limitada.
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es la técnica más utilizada para la determinación clínica de PMQ. Endoh et al. informaron de un sistema HPLC con un detector UV para la cuantificación de PMQ sérica utilizando una columna de gel de polímero C-188. En su sistema, las proteínas séricas se precipitaron primero con acetonitrilo, y luego el PMQ en el sobrenadante se separó para HPLC. La curva de calibración fue lineal en el rango de concentración de 0,01-1,0 g/mL8. Otro método basado en un HPLC de fase inversa con detección UV a 254 nm se ha informado para la cuantificación de PMQ y sus principales metabolitos9. La curva de calibración para PMQ era lineal en el rango entre 0,025-100 g/ml. Se utilizó una extracción adicional líquido-líquido con hexano mezclado y acetato de etilo como fase orgánica para la separación de PMQ con una recuperación porcentual alcanzada al 89%9. Más recientemente, Miranda y otros desarrollaron un método UPLC con detección UV a 260 nm para el análisis de PMQ en formulaciones de comprimidos con un límite de detección a 3 g/mL10.
Aunque los métodos HPLC exhiben una sensibilidad prometedora en la determinación de fármacos y la sensibilidad puede mejorarse aún más si el HPLC está equipado con un espectrómetro de masas, todavía hay algunas desventajas. Las mediciones directas de fármacos en fluidos biológicos suelen ser inaccesibles por HPLC, ya que muchas biomoléculas pueden influir en gran medida en el análisis. Se requieren extracciones adicionales para eliminar moléculas endógenas antes del análisis de HPLC11,12. Además, la detección de PMQ por un detector HPLC-UV se realiza típicamente en su longitud de onda de absorción máxima (260 nm);; sin embargo, hay muchas moléculas endógenas en fluidos biológicos con una fuerte absorbancia a 260 nm (por ejemplo, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos y pigmentos urocromos), interfiriendo así con la detección UV PMQ. Es necesario desarrollar métodos simples y rentables para la determinación de PMQ con una sensibilidad y selectividad razonables.
La reacción griess fue presentada por primera vez en 1879 como una prueba colorimétrica para la detección de nitrito13,14,15,16. Recientemente, esta reacción ha sido ampliamente explorada para detectar no sólo nitrito, sino también otras moléculas biológicamente relevantes17,18,19,20. Hemos informado previamente del primer estudio sistemático de una reacción inesperada de Griess con PMQ(Figura 1). En este sistema, PMQ es capaz de formar azos de color cuando se combina con anilinas sustituidas en presencia de iones de nitrito en condiciones ácidas. Hemos encontrado además que el color de los azos variaba de amarillo a azul al aumentar el efecto de donación de electrones del sustituito en anilinas21. Se ha desarrollado un método colorimétrico basado en absorción UV para la cuantificación de PMQ a través de la reacción optimizada entre 4-metoxianilina y PMQ. Este método ha demostrado un gran potencial para la detección sensible y selectiva de PMQ en fluidos biorelevantes. Aquí, nuestro objetivo es describir los procedimientos detallados para la determinación de PMQ basados en esta estrategia colorimétrica.

<table><tbody><tr><td>4-Methoxyaniline</td><td>Aladdin</td><td>K1709027</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dimetoxianilina</td><td>Heowns</td><td>10154207</td><td></td></tr><tr><td>3,4-Dimetoxianilina</td><td>Bidepharm BD21914</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Metilanilina</td><td>Adamas-beta</td><td>P1414526</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroanilina</td><td>Macklin</td><td>C10191447</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos,Flat Botton</td><td>Labserv</td><td></td><td></td>310109008</tr><tr><td>Gaussian@16 software</td><td>Gaussian, Inc</td><td></td><td>Versión:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>GCRF</td><td>20180902</td><td></td></tr><tr><td>Marvin sketch (software)</td>Edición gratuita de <td>CHEMAXON</td><td></td><td>: 15.6.29</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Macklin</td><td>C10112815</td><td></td></tr><tr><td>Primaquina bisifosfato</td><td>3A Productos químicos</td><td></td><td></td>CEBK200054</tr><tr><td>Nitrito de sodio</td><td>Alfa Aesar</td><td>5006K18R</td><td></td></tr><tr><td>Sulfonamidas</td><td>TCI (shanghai)</td><td>GCPLO-BP</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX Lector de placas</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Suministrado con software SkanIt 4.1</td></tr></tbody></table>

reacción de griess optimizada para uv-vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Primaquina (PMQ), un importante medicamento antipalúdico, ha sido recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para el tratamiento de infecciones potencialmente mortales causadas por P. vivax y ovale. Sin embargo, PMQ tiene efectos adversos no deseados que conducen a la hemólisis aguda en pacientes con deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Hay una necesidad de desarrollar métodos simples y confiables para la determinación de PMQ con el propósito de la supervisión de dosis. A principios de 2019, hemos informado de un enfoque basado en UV-Vis y a simple vista para la cuantificación colorimétrica PMQ. La detección se basó en una reacción similar a la Griess entre PMQ y anilines, que puede generar productos azoicos de color. El límite de detección para la medición directa de PMQ en orina sintética está en el rango nanomolar. Además, este método ha demostrado un gran potencial para la cuantificación de PMQ a partir de muestras de suero humano a concentraciones clínicamente relevantes. En este protocolo, describiremos los detalles técnicos relativos a las síntesis y caracterización de los productos azo de color, la preparación del reactivo y los procedimientos para la determinación de PMQ.

Para optimizar las condiciones de reacción(Figura 2), se utilizaron varias anilinas para acoplarse con PMQ a través de la reacción Griess. Hemos logrado una serie de azos con diferentes colores. Se ha encontrado que las anilinas con un sustituito de donación de electrones pueden causar un cambio rojo en el espectro de absorción UV-vis. Los cálculos teóricos se llevaron a cabo a través de la teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo (TD-DFT). Como se presenta en <strong class="xf...

Este protocolo describe un nuevo método colorimétrico para la detección de primaquinas antipalúdicas (PMQ) en orinas sintéticas y sueros humanos.

Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Primaquina es un conocido medicamento antipalúdico. La determinación de primaquina en fluidos biológicos a menudo es necesaria para evaluar la farmacocinética. Actualmente, las principales técnicas para la determinación de primaquinas se basan en HPLC.Los procedimientos de HPLC pueden ser bastante complicados y llevar mucho tiempo. Así que este método ofrece una forma sencilla para la detección rápida de Primaquine. Este método Griess es potencialmente la forma más simple y rentable para la cuantificación de Primaquinas.Además, este método puede ofrecer posibilidades para la detección de Primaquinas a simple vista sin la necesidad de ningún equipo. Además de las muestras de suero y orina, este método también podría utilizarse para determinar cuantitativamente Primaquine en formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, la determinación de Primaquina en tabletas para el control de calidad de fabricación. Wu Yalan y Wu Shengjun, dos estudiantes graduados de mi laboratorio.Comience por disolver 0,1 milimoles de anilina y bifosfato de primaquina en 10 mililitros de 5% de solución de ácido fosfórico en un matraz inferior marrón de 25 mililitros. Coloque el matraz en un baño de hielo y agregu

optimized-griess-reaction-for-uv-vis-naked-eye-determination-anti

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este video muestra un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo que involucra eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum marcados y opsonizados por monocitos. La citometría de flujo identifica la fluorescencia en los monocitos, lo que confirma la identificación exitosa de eritrocitos opsonizados a través de la fagocitosis.

Un ensayo para cuantificar la fagocitosis mediada por anticuerpos de eritrocitos infectados por parásitos

El video muestra un ensayo basado en células para detectar la inmunoglobulina G anti-acuaporina-4 utilizando un biochip que contiene células no transfectadas y células transfectadas que expresan acuaporina-4. Este método tiene aplicaciones en el diagnóstico de trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, confirmados por una fuerte fluorescencia verde en el biochip.

Un ensayo para detectar la inmunoglobulina G anti-acuaporina-4 sérica

Función de medición de anticuerpos es la clave para la comprensión de la inmunidad a la malaria Plasmodium falciparum. Este método describe la purificación de merozoitos viables, y la medición de la opsonización dependiente de la fagocitosis mediante citometría de flujo.

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Los reactivos de detección robustos son cada vez más necesarios para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico de la malaria. Se diseñó una sonda de iridio (III) que emite una señal luminiscente de larga duración en presencia de un biomarcador de proteína de la malaria rico en histidina. La detección de la proteína, ya sea en solución o inmovilizada en una partícula magnética, ofrece flexibilidad en la aplicación.

Iridium (III) luminiscentes Sonda para la detección de la proteína malaria biomarcador histidina Rich Protein-II

La coinfección humana es difícil de replicar in vitro. Sin embargo, los parásitos de la malaria humana pueden cultivarse fácilmente in vitro, al igual que las células mononucleares de sangre periférica humana recién aisladas infectadas naturalmente con el VIH. Esto proporciona un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunitarias tempranas a los parásitos de la malaria en el contexto de la coinfección por el VIH.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

En este manuscrito se presentan los métodos de oxidación periodato y reticulación de glutaraldehído para la inmovilización covalente de anticuerpos en discos de papel. Se evaluó la actividad de unión de los anticuerpos inmovilizados. Sobre la base de estos resultados, se utilizó un método de reticulación de glutaraldehído para desarrollar un nuevo inmunoensayo en papel para la detección de inmunoglobulinas G (IgG).

Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

Describimos un enfoque de una sola molécula para las mediciones de afinidad antígeno-anticuerpo utilizando fotometría de masas (MP). El protocolo basado en MP es rápido, preciso, utiliza una cantidad muy pequeña de material y no requiere modificación de proteínas.

Determinación rápida de la afinidad anticuerpos-antígenos por fotometría de masas

Este protocolo describe un ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich para detectar esporozoítos de glándulas salivales en mosquitos. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles, el método permite la detección rentable y de alto rendimiento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. El método es adecuado para la investigación de la transmisión del paludismo, incluidos los estudios de vectores.

Detección de esporozoítos de Plasmodium en mosquitos Anopheles mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas

Aprende un método colorimétrico optimizado para detectar primaquina antipalúdica en orina y suero humano mediante la reacción de Griess. Esta técnica simple y económica ofrece resultados comparables al HPLC con detección a vista desnuda.

Reacción de griess optimizada para UV-Vis y determinación a vista desnuda de primaquina antipalúdica

Explorar más videos