Name: Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a cuantificar la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos mediante un ensayo de fluorescencia de alto rendimiento. Este método permite evaluar candidatos farmacológicos específicos para pacientes.

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Agradecemos a B. Spee por proporcionar generosamente LD540. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.

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<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, proporcionamos un protocolo para determinar la formación de LD en organoides intestinales humanos tras la incubación con ácido oleico. Este método se basa en el tinte fluorescente específico ld 54018,que permite la caracterización y cuantificación del volumen total de gotas lipídicas dentro de un cultivo organoide. Los procedimientos para establecer y mantener los cultivos organoides intestinales humanos se han publicado antes de13, y una guía visual de este protocolo...

Los lípidos son un componente crucial de la dieta humana y juegan un papel importante en el almacenamiento de energía sistémica y el metabolismo. Cuando se ingenian, los lípidos dietéticos se degradan en ácidos grasos libres (FFA) y monoglicéridos (GM) por lipasas pancreáticas. Estos sustratos son entonces tomados por los enterocitos del epitelio intestinal, donde primero son reesterificados a diglicéridos (DG) por enzimas aciltransferasas monoglicéridos (MGAT) y posteriormente a triglicéridos (TG) por diacilglicerol acitransferasa 1 (DGAT1)1. Por último, estos TG s están integrados en quilomicrones para su exportación al sistema linfático o gotas lipídicas citosólicas (LD) para el almacenamiento intracelular2,3. Aunque se necesitan quilomicrones para distribuir lípidos dietéticos a otros órganos, la importancia del almacenamiento de grasa intracelular en los D No está completamente clara. Sin embargo, se ha demostrado que los DN realizan una función reguladora en el intestino, ya que liberan lentamente lípidos en la circulación hasta 16 h después de una comida4. Además, se ha demostrado que los LU protegen contra las concentraciones de ácidos grasos tóxicos, como en los adipocitos de ratón durante condiciones lililíticas5.
La proteína DGAT1 se encuentra en la membrana del retículo endoplasmático (ER) y desempeña un papel crucial en la formación de LD en el epitelio intestinal. Las mutaciones homocigotas en DGAT1 conducen a diarrea y/o vómitos graves de inicio temprano, hipoalbuminemia y/o enteropatía (fatal) que pierde proteínas con insuficiencia intestinal al tener grasa, lo que ilustra la importancia de DGAT1 en la homeostasis lipídica del ser humano epitelio intestinal6,7,8,9,10. Dado que la aparición de deficiencia de DGAT1 en humanos es poco frecuente, el acceso a las células primarias derivadas del paciente ha sido escaso. Además, el cultivo a largo plazo de las células epiteliales intestinales se ha restringido durante mucho tiempo a las líneas celulares derivadas de tumores que representan la fisiología normal sólo a una extensión limitada. Por lo tanto, la formación de LD mediada por DGAT1 se ha estudiado principalmente en fibroblastos o líneas celulares de origen animal7,10,11,12. Como tal, recientemente se demostró que los fibroblastos derivados del paciente con deficiencia de DGAT1 acumulan menos LDs en comparación con las células de control sanas después de la estimulación con ácido oleico (OA)8.
Anteriormente, se establecieron protocolos para cultivar células madre epiteliales de cualquier órgano gastrointestinal en forma de organoides tridimensionales (3D)13. Estos organoides intestinales se pueden mantener en cultivo durante un largo período de tiempo13,y permiten el estudio funcional de las características epiteliales específicas del paciente e intestinal14. Son genética y fenotípicamente estables y pueden almacenarse, permitiendo la expansión a largo plazo y la biobanca13.
Recientemente demostramos que la formación de LD se puede medir fácilmente en organoides intestinales humanos en un ensayo de formación de LD (LDF)6. Cuando se exponen a OA durante 16 h, los organoides generan LDs para proteger las células de la toxicidad inducida por lípidos. Cuando las concentraciones de OA son demasiado altas, las células mueren por apoptosis mediada por caspasa6. Anteriormente se demostró que el ensayo LDF dependía en gran medida de DGAT1, como indican los organoides derivados de pacientes con mutantes DGAT1 y el uso de inhibidores específicos de DGAT16.
Para el ensayo de LDF descrito en detalle aquí, los organoides 3D se cultivan a partir de biopsias intestinales y se reperduen semanalmente por la interrupción en células individuales que forman fácilmente nuevos organoides. Para ejecutar el ensayo de LDF, se celen células individuales derivadas de organoides de 7.500 euros en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Los organoides se forman durante varios días, se incuban durante la noche con 1 mM de OA y se tiñen con LD540, un tinte específico para LD permeable a las células fluorescentes que facilita la toma de imágenes. La formación de LD se cuantifica entonces mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo.
Al escalar este ensayo de formación de LD a un formato de 96 pozos, el ensayo también se puede utilizar para el análisis de alto rendimiento de la formación de LD para detectar nuevos fármacos que afectan a la formación de LD en cultivos organoides intestinales humanos, o para estudiar trastornos (genéticos humanos) que afectan Metabolismo de la LD.

<table><tbody><tr><td>Avanzado DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal (matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de DGAT1 (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>Sin ácidos grasos BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td><td>amablemente proporcionado por el Dr. B. Spee, Universidad de Utrecht</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>Células productoras de Noggin (células HEK293-mNoggin-Fc)</td><td></td><td></td><td>MTA con J. den Hertog, Instituto Hubrecht</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 Inhibidor de MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Células productoras de R-espondina (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td><td>R& Sistemas D</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos tratadas con TC</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos de fondo transparente negro con tratamiento TC</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor del receptor TGFb tipo I (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>células productoras de WNT-3A (células L-Wnt-3A)</td><td></td><td></td><td>MTA con J. den Hertog, Instituto Hubrecht</td></tr><tr><td>Clorhidrato Y-27632 (inhibidor de la Rho quinasa)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Los lípidos dietéticos son tomados como ácidos grasos libres (FAs) por el epitelio intestinal. Estos FA se convierten intracelularmente en moléculas de triglicéridos (TG), antes de que se envasen en quilomicrones para su transporte a la linfa o en gotas de lípidos citosólicos (LD) para el almacenamiento intracelular. Un paso crucial para la formación de LOS LU es la actividad catalítica de las aciltransferasas diacilglicerol (DGAT) en el paso final de la síntesis de TG. Los D.M. son importantes para amortiguar las especies de lípidos tóxicos y regular el metabolismo celular en diferentes tipos de células. Dado que el epitelio intestinal humano se enfrenta regularmente con altas concentraciones de lípidos, la formación de LD es de gran importancia para regular la homeostasis. Aquí describimos un simple ensayo para la caracterización y cuantificación de la formación de LD (LDF) sobre la estimulación con el ácido graso insaturado más común, el ácido oleico, en los organoides intestinales humanos. El ensayo LDF se basa en el tinte fluorescente LD540 específico de LD, que permite cuantificar los D mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo. El ensayo LDF se puede utilizar para caracterizar la formación de LD en células epiteliales intestinales humanas, o para estudiar trastornos humanos (genéticos) que afectan el metabolismo de la LD, como la deficiencia de DGAT1. Además, este ensayo también se puede utilizar en una tubería de alto rendimiento para probar nuevos compuestos terapéuticos, que restauran defectos en la formación de LD en los órganooides intestinales u otros tipos.

Para un análisis adecuado de la formación de LD, los organoides no deben ser sembrados demasiado densamente antes de la estimulación con OA y posterior tinción. Esto es especialmente importante para la lectura confocal y lector de placas, ya que los organoides superpuestos podrían interferir con la fluorescencia. Se muestra un ejemplo de densidad de semilla de organoides adecuada(Figura 1A) y un cultivo con organoides superpuestos (<strong cl...

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Este protocolo describe algunos métodos para cuantificar la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos. Se puede utilizar como una plataforma de cribado de alto rendimiento para probar fármacos que modulan la formación de gotas de lípidos. El método que describimos se basa en un tinte específico para gotas de lípidos y organoides intestinales derivados de biopsias.Por lo tanto, proporciona un modelo estable, preciso y fisiológicamente relevante para la formación de gotas de lípidos. Este protocolo se puede utilizar para detectar nuevos candidatos a fármacos específicos del paciente que modulan la formación de gotas de lípidos, por ejemplo, en pacientes con deficiencia de DGAT1. Este ensayo de formación de gotas lipídicas también se puede aplicar a otros tipos de cultivos organoides para estudiar el metabolismo de los lípidos en otros tipos de células.El ensayo depende en gran medida de la densidad del cultivo organoide. Trate de asegurar una densidad organoidea consistente entre muestras y experimentos. La demostración visual de este ensayo es crítica porque es importante mostrar cómo se debe cultivar el organoide y cómo deben tratarse para asegurar un análisis

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Aprende a cuantificar la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos mediante un ensayo de fluorescencia de alto rendimiento. Este método permite evaluar candidatos farmacológicos específicos para pacientes.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos (Video) | JoVE Journal

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

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