Name: Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan GM-CSF a partir de células madre embrionarias. Este protocolo detallado permite producir vesículas inmunorreguladoras de alta calidad para estudios terapéuticos.

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Agradecemos al Sr. Arkadiusz Slusarczyk y a kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imágenes de microscopio electrónico de transmisión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 y CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) y Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. Cultivo de células ES-D3
<ol><li>Para generar suero bovino fetal libre de exosomas (FBS), cargue FBS en una ultracentrífuga y centrífuga a 100.000 x g durante 16 h a 4 °C. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante sérico como FBS libre de exosomas para cultivar la línea celular ESC murina ES-D3 y adquirir EV enriquecidos con exosomas.</li>
	<li>Antes de emplatar las células ES-D3, cubra los platos de cultivo de tejidos de 15 cm con gelatina (0,1%) a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Siguiendo un protocolo16descrito anteriormente, culta las células ES-D3 sin células de capa alimentadora en las vajillas de cultivo de tejido de 15 cm recubiertas de gelatina. El medio de cultivo celular ES-D3 está compuesto por DMEM, FBS libre de exosomas (15%), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), L-glutamina (2 mM), β-mercaptoetanol (0,1 mM), penicilina (50 unidades/mL), estreptomicina (50 μg/mL) y factor inhibidor de la leucemia (LIF; 100 unidades/mL). Culta células ES-D3 a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2.</li>
	<li>Una vez que las células ES-D3 alcancen alrededor del 90% de confluencia en platos de cultivo de tejidos de 15 cm, retire el medio por aspiración. Lavar las células con tripsina (5 ml; 0,05%). Añadir tripsina (5 ml) a los platos e incubar a 37 °C durante 5 min. Recoge las células de los platos.</li>
	<li>Agregue un medio de cultivo fresco (5 ml) a las células recolectadas para inactivar la tripsina. Centrifugar las células a 390 x g durante 5 min. Resuspend las células en medio fresco y determine el número de células usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Para las células de paso, placa las células ES-D3 (5 x 106) en una placa de cultivo de tejido de 15 cm recubierta de gelatina (0,1%) con medio fresco (15 ml) y cultivo durante 3 días antes de subcultivar las células.</li>
	<li>Para recolectar el sobrenadante de cultivo celular para el aislamiento de EVs enriquecidos con exosomas, coloca las células ES-D3 (1 x 107) en una placa de cultivo de tejido de 15 cm recubierta de gelatina (0,1%) con medio fresco (15 mL) durante 3 días antes de recolectar el sobrenadante de cultivo celular.</li>
</ol>2. Generación de plásmido de expresión GM-CSF
NOTA: Generar el plásmido de transfección pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpresar GM-CSF en células ES-D3. En este plásmido, la expresión del ADNc gm-CSF murino junto con el marcador proteico humanizado Renilla reniformis GFP (hrGFP) es impulsado por el promotor del factor de elongación de la cadena polipeptídica humana 1α (EF1α)17,18.
<ol><li>Generar la columna vertebral vectorial.<ol>
<li>Digerir el plásmido pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg de ADN) utilizando la enzima de restricción EcoRI (100 unidades) a 37 °C durante 2 h para generar dos fragmentos de ADN: la columna vertebral del vector (6,0 kb) y el inserto FD3ER (2,5 kb).</li>
		<li>Transfiera el 50% del ADN plásmido digerido (10 μg) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y trátelo con fosfatasa alcalina (20 unidades) a 37 °C durante 1 h. Resolver tanto el ADN no tratado como el desfosforilado mediante electroforesis en gel de agarosa (2%).</li>
		<li>Purificar los fragmentos de ADN de la columna vertebral del vector (6.0 kb) utilizando un kit de extracción de gel de ADN. Mientras que la columna vertebral del vector no tratado servirá como vector vacío (pEF1α-IRES-hrGFP), la columna vertebral del vector desfosforilado se utilizará para generar plásmido que expresa GM-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genere el inserto gm-CSF cDNA.<ol>
<li>Digerir el plásmido pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) utilizando la enzima de restricción EcoRI (100 unidades) a 37 °C durante 2 h para producir dos fragmentos de ADN: la columna vertebral vectorial (6,5 kb) y el inserto murino GM-CSF cDNA (474 pb).</li>
		<li>Resolver el ADN digerido a través de la electroforesis en gel de agarosa (2%). Purificar el fragmento murino de ADNc GM-CSF (474 pb) utilizando un kit de extracción de gel de ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generar los plásmidos de expresión.<ol>
<li>Configure 2 reacciones de ligadura (volumen total de 10 μL) utilizando un kit de ligadura de ADN.<ol>
<li>Para generar el vector vacío pEF1α-IRES-hrGFP, ligar la columna vertebral del vector no tratado a partir del paso 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng).</li>
			<li>Para generar pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligar los siguientes fragmentos de ADN: (1) la columna vertebral del vector desfosforilado del paso 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) y (2) el fragmento de aDNc mGM-CSF generado en el paso 2.2.2 (474 bp; 200 ng).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligar a 25 °C durante 5 min. Transformar el ADN ligado en células de E. coli competentes en DH5α. Placa las células transformadas de E. coli en placas de LB-agar que contienen carbenicilina (50 μg/mL).</li>
		<li>Purificar plásmidos de colonias individuales de E. coli utilizando un kit de aislamiento de ADN. Validar las identidades de los plásmidos mediante secuenciación de ADN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generación de células ES-D3 que sobreexpresan GM-CSF
NOTA: Transfectar las células ES-D3 con el plásmido pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpresar GM-CS. Cotransfectar el plásmido pBabe-Neo en células ES-D3 para facilitar la selección de células transfectadas de forma estable18,20.
<ol><li>Transfectar los plásmidos en las células ES-D3.<ol>
<li>Placa las células ES-D3 (1,4 x 106) en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm recubierta de gelatina (0,1%) con medio de cultivo (10 ml) para transfección. Cultivar células ES-D3 chapadas a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Preparar dos mezclas de plásmidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, control vectorial) con pBabe-Neo (4 μg) y (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, expresando GM-CSF) con pBabe-Neo (4 μg). Realizar la transfección utilizando un kit de transfección siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Añadir medio de transfección (1 ml) y reactivo de transfección (64 μL) a cada tubo que contenga las mezclas de plásmidos e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Agregue las mezclas de transfección a los respectivos platos de 10 cm de células ES-D3. Incubar a 37 °C durante 5 h.</li>
		<li>Reemplace el medio en platos de 10 cm con medio de cultivo fresco (10 ml). Incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generar poblaciones masivas de células ES-D3 transfectadas de manera estable.<ol>
<li>Retire el medio de las células ES-D3 transfectadas. Lavar las células con tripsina (2 ml; 0,05%). Añadir tripsina (2 ml) e incubar a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 ml y agregue 2 ml de medio de cultivo fresco para neutralizar la tripsina. Centrifugadora a 390 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspend las células transfectadas en medio de cultivo fresco (10 mL). Evaluar la intensidad de fluorescencia de GFP en células ES-D3 transfectadas utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Transfiera las células transfectadas a dos platos de 10 cm que contengan un medio de cultivo fresco (10 ml). Añadir neomicina (0,5 mg/ml) para eliminar las células no transfectadas.</li>
		<li>Continuar cultivando las células transfectadas en medio de cultivo que contenga neomicina (0,5 mg/ml). Cuando el ES-D3 transfectado alcance el 90% de confluencia, transfiera las células a platos de cultivo de tejido de 15 cm nuevamente. Repita el procedimiento durante 2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generar clones de células ES-D3 transfectadas de forma estable.<ol>
<li>Una vez que se generan poblaciones masivas de células ES-D3 transfectadas de manera estable, recoja las células como antes. Determine los números de células usando un hemocitómetro. Centrifugar las células a 390 x g durante 5 min. Resuspend las células (1 x 107 células/ml) en medio de cultivo fresco.</li>
		<li>Filtre las células a través de un colador de células estéril de 40 μm. Purifique las células ES-D3 GFP positivas utilizando FACS, siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Placa una sola célula ES-D3 clasificada en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos recubierta de gelatina (0,1%) que contiene células ES-D3 parentales (1 x 103) en medio libre de neomicina (200 μL). El cocultivo de células ES-D3 transfectadas con sus contrapartes parentales no transfectadas garantiza que las células ES-D3 individuales transfectadas de manera estable sobrevivan y proliferen como un solo clon.</li>
		<li>Culta las células durante 48 h y luego agregue neomicina (0,5 mg / ml) a placas de 96 póyes para eliminar las células ES-D3 parentales no transfectadas.</li>
		<li>Continuar cultivando las células ES-D3 GFP positivas en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos con medio que contenga neomicina (0,5 mg/ml) durante 1 semana. Transferir líneas celulares clonales es-D3 a platos de cultivo de tejidos de 6 cm recubiertos de gelatina (0,1%) con medio de cultivo (5 ml) que contenga neomicina (0,5 mg/ml) durante 1 semana.</li>
		<li>Determinar la intensidad de la fluorescencia GFP en cada uno de los clones de células ES-D3 transfectadas utilizando FACS, siguiendo el protocolo del fabricante. Seleccione los clones de ES-D3 que expresan GM-CSF o el vector vacío con altos niveles de fluorescencia verde.</li>
		<li>Determine las cantidades de GM-CSF secretadas por las células ES-D3 utilizando un kit ELISA GM-CSF murino, siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas
<ol><li>Cultivo de las células ES-D3 (1 x 107) en platos de cultivo de tejidos de 15 cm durante 72 h a 37 °C. Recoger el sobrenadante de cultivo celular. Almacene el sobrenadante recolectado a 4 °C hasta 1 semana para mantener la integridad exosomal.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 5.000 x g durante 60 min a 4 °C utilizando una centrífuga para sedimentar fragmentos celulares grandes.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante y la centrífuga a 100.000 x g durante 90 min a 4 °C utilizando una ultracentrífuga.</li>
	<li>Retire el sobrenadante. Enjuague suavemente cada gránulo dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 1 ml) para eliminar el sobrenadante de cultivo residual.</li>
	<li>Resuspenda cada pellet en PBS. Cuantificar los EVs enriquecidos con exosomas por su contenido proteico5.<ol>
<li>Mida la concentración de proteínas de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas con un ensayo de ácido bicinconinico (BCA). El rendimiento esperado de los EV enriquecidos con exosomas de las células ES-D3 es de aproximadamente 4 μg de proteína/ml de sobrenadante de cultivo celular. Resuspend los EV enriquecidos con exosomas en PBS (concentración de proteínas: ~6 μg/μL). Guarde los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caracterización de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión
NOTA: Investigar la composición y la estructura de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas aislados de CES mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)5.
<ol><li>Fije los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas (3-5 μg/μL) con una concentración final de paraformaldehído de grado EM al 2% a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
	<li>Cargue muestras fijas (10 μL) en rejillas de cobre con película de soporte de carbono. Incubar las muestras con rejillas de cobre durante 1 minuto y luego drenar las rejillas con papel de filtro.</li>
	<li>Manche las rejillas con una solución de tinción siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Transfiera las rejillas a un trozo de papel de filtro con pinzas. Deje que las rejillas se sequen durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Adquirir imágenes de microscopía electrónica utilizando un microscopio electrónico de transmisión (aumento de 50.000x), siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
</ol>6. Evaluación de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas mediante análisis de western blot
<ol><li>Preparar extractos de células enteras.<ol>
<li>Retire el medio de las células ES-D3 cultivadas en platos de 15 cm. Lavar las células con tripsina (5 ml; 0,05%). Agregue tripsina (5 ml) a las células. Incubar a 37 °C durante 5 min. Recoger las células y añadir medio de cultivo fresco (5 ml) para neutralizar la tripsina. Centrifugar las células a 390 x g durante 5 min. Resuspend las células en PBS.</li>
		<li>Determine los números de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar las células de nuevo a 390 x g durante 5 min. Resuspend las celdas en el búfer de carga SDS-PAGE que contiene 0,5% SDS (5.000 celdas/μL).</li>
		<li>Sonicar las muestras durante 10 s utilizando un sonicador con 10% de amplitud (potencia: 500 W; frecuencia ultrasónica: 20 kHz). Calentar las muestras a 100 °C durante 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare los lisados de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas.<ol>
<li>Resuspend los EV enriquecidos con exosomas en tampón de carga SDS-PAGE que contiene 0,5% SDS a una concentración de 1,2 μg/μL.</li>
		<li>Sonicar las muestras durante 10 s utilizando un sonicador con 10% de amplitud (potencia: 500 W; frecuencia ultrasónica: 20 kHz). Calentar las muestras a 100 °C durante 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detectar proteínas por Western blot.<ol>
<li>Cargue extractos de células enteras (10 μL; 5.000 células/μL) y lisatos EV enriquecidos con exosomas (10 μL; 1,2 μg/μL) en cada pozo de un gel Bis-Tris PAGE (4-20%). Transfiera proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF).</li>
		<li>Incubar membranas con anticuerpos primarios y secundarios apropiados. Diluir los anticuerpos (en las concentraciones indicadas a continuación) en tampón secante que contenga PBS, Tween-20 (0,2%) y leche en polvo sin grasa (10% p/v).<ol>
<li>Utilice los siguientes anticuerpos primarios: anti-Anexina V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromo c (100 ng/mL), anti-proteína disulfuro isomerasa (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) y anti-Oxphos COX IV-subunidad IV (600 ng/mL).</li>
			<li>Utilice los siguientes anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa (20 ng/mL) e IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (20 ng/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detecte proteínas utilizando un kit de detección de quimioluminescencia mejorado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Determinación de las concentraciones de GM-CSF en vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas por ELISA
NOTA: Evalúe las cantidades de GM-CSF en vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas mediante ELISA utilizando un kit para GM-CSF murino, siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.
<ol><li>Cubra la placa ELISA con anticuerpos de captura. Tratar los EVs enriquecidos con exosomas (0,6 μg) en PBS solo o PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) a temperatura ambiente durante 30 min. Agregue las muestras tratadas a la placa ELISA recubierta e incube a temperatura ambiente durante 1 h. Lave la placa con PBS solo o PBS + 0.05% Tween-20.</li>
	<li>Agregue anticuerpos de detección a las muestras. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lave la placa con PBS solo o PBS + 0.05% Tween-20. Agregue Avidin-HRP a las muestras. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Lave la placa con PBS solo o PBS + 0.05% Tween-20.</li>
	<li>Determine las concentraciones de GM-CSF en vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas midiendo la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas.</li>
</ol>

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Kavitha Yaddanapudi, Chi Li y John W. Eaton presentaron una solicitud de patente estadounidense "Composiciones que comprenden exosomas derivados de células madre embrionarias modificadas y métodos de uso de los mismos".

Este estudio muestra un método altamente eficiente para producir vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas que transportan la proteína inmunoestimulante GM-CSF, que se puede emplear para estudiar los efectos inmunomoduladores de los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. Varios estudios sugieren que los exosomas exhiben funciones inmunorreguladoras y antitumorales22. Por lo tanto, los exosomas de las CES que expresan GM-CSF también podrían poseer actividades biológicas que regulan la...

Las CES se derivan de la etapa de blastocisto de un embrión preimplantacional1. Como células madre pluripotentes, las ESC tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en cualquier tipo de célula embrionaria. Debido a su notable potencial de desarrollo y capacidad proliferativa a largo plazo, los CES son extremadamente valiosos para la investigación biomédica1. Los esfuerzos de investigación actuales se han centrado en gran medida en el potencial terapéutico de las CES para una variedad de trastornos patológicos importantes, como la diabetes, las enfermedades cardíacas y las enfermedades neurodegenerativas2,3,4.
Se sabe que las células de mamíferos, incluidas las CES, liberan vesículas con tamaños variables al entorno extracelular, y estas EV poseen muchas funciones fisiológicas y patológicas debido a su papel en la comunicación intercelular5. Entre los diferentes subtipos de EVs, los exosomas son pequeñas vesículas de membrana liberadas desde varios tipos de células en el espacio extracelular tras la fusión de compartimentos endocíticos intermedios, cuerpos multivesiculares (MVB), con la membrana plasmática6. Se ha informado que los exosomas median la comunicación intercelular y están críticamente involucrados en muchos procesos (pato)fisiológicos7,8. Los exosomas heredan algunas funciones biológicas de sus propias células parentales, porque los exosomas contienen materiales biológicos adquiridos del citosol, incluidas proteínas y ácidos nucleicos. Así, los antígenos o factores asociados que estimulan la respuesta inmune específica para una enfermedad dada se encapsulan en los exosomas de tipos particulares de células9. Esto allanó el camino para los ensayos clínicos que exploran los exosomas derivados de tumores como una vacuna contra el cáncer10.
GM-CSF es una citocina secretada por diferentes tipos de células inmunes11. La evidencia emergente demuestra que el GM-CSF activa y regula el sistema inmunológico y desempeña un papel esencial en el proceso de presentación de antígenos12. Por ejemplo, un informe clínico sugiere que GM-CSF estimula la respuesta inmune a los tumores como adyuvante de la vacuna13. Varias estrategias de inmunoterapia contra el cáncer basadas en GM-CSF para explotar la potente actividad inmunoestimuladora de GM-CSF han sido investigadas en ensayos clínicos14. Entre estos, una vacuna contra el cáncer compuesta de células tumorales secretoras de GM-CSF irradiadas ha demostrado ser prometedora en pacientes con melanoma avanzado al inducir respuestas antitumorales celulares y humorales y la necrosis posterior en tumores metastásicos15.
Debido a que los exosomas derivados de las CES poseen actividades biológicas similares a las CES originales, tal vez los exosomas portadores de GM-CSF de las CSC podrían funcionar como vesículas libres de células para regular la respuesta inmune. En este artículo, se describe un método detallado para producir vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas de alta calidad a partir de CES que expresan GM-CSF. Estos vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas tienen el potencial de servir como vesículas inmunorreguladoras para modular la respuesta inmune.

<table><tbody><tr><td>Fosfato alcalino, ternero intestinal</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Plásmido de ADN desfosforilante</td></tr><tr><td>anti-anexina V mAb</td> Santa <td>Cruz</td><td>clon H-3, sc-74438</td> Western <td>blot, RRID:AB_1118989</td></tr><tr><td>anti-CD81 mAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>clon B-11, sc-166029</td><td>Western blot, RRID:AB_2275892</td></tr><tr><td>anti-citocromo c mAb</td><td>Santa Cruz Biotecnología</td><td>clon A-8, sc-13156</td> Western <td>blot, RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>anti-Flotillillin-1 mAb</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>clon C-2; sc-74566</td> Western <td>blot, RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>anti-GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td> Western <td>blot, RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>anti-ratón IgG de cabra, conjugado con peroxidasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td> Western <td>blot, RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>anti-Oxphos COX IV-subunidad IV mAb</td> clon <td>Thermo Fisher</td><td>20E8C12 A21348</td> Western <td>blot, RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>anti-proteína disulfuro isomerasa (PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td> Western <td>blot, RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>anti-conejo IgG, cabra, conjugada con peroxidasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td> Western <td>blot, RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>Ensayo BCA (ácido bicinconínico)</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>Determinación de las concentraciones de proteínas</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td><td>Genscript</td><td>M42015</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Carbenicillina, sal disódica</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Selección de colonias E. coli</td></tr><tr><td>Centrífuga, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Centrifugación de baja velocidad</td></tr><tr><td>Rotor centrífugo, JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U1597</td> Botella de centrífuga <td>de centrifugación de baja velocidad</td></tr><tr><td>, Nalgene PPCO</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td> Rejillas de <td>Cu de centrifugación de baja velocidad</td></tr><tr><td>con película de soporte</td><td>de carbono Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>FF200-Cu</td><td>Adquisición de imágenes de microscopía electrónica</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>Plásmido de ADN de digestión</td></tr><tr><td>Quimioluminiscencia mejorada sistema de detección</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>FACScitómetro de flujo Calibur</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Examen de los niveles de GFP de las células ES-D3</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>Medio para células ES-D3</td></tr><tr><td>Fisherbrand Filtros de células estériles; Tamaño de malla: 40&mu; m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>Filtrado de células ES-D3 para la clasificación de FACS</td></tr><tr><td>Gelatina (0,1%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>Cultivo de células ES-D3</td></tr><tr><td>GM-CSF Kit ELISA THERMO</td><td>FISHER Thermo Fisher</td><td>88733422</td><td>Determinación de las concentraciones de GM-CSF</td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td><td>Medio para células ES-D3</td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td><td>Medio para células ES-D3</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>Medio para células ES-D3</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>Transfecting Celdas ES-D3</td></tr><tr><td>Lector de microplacas, PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>Determinación de las concentraciones de GM-CSF Clasificador</td></tr><tr><td>de células de alta velocidad MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Aislamiento de clones de células ES-D3 individuales</td></tr><tr><td>NEB 5-alfa E. coli competente</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>Generación de plásmido de expresión de GM-CSF</td></tr><tr><td>Neomicina Thermo</td><td>Fisher</td><td>10-131-035</td><td>Selección de clones de ES-D3</td></tr><tr><td>Aminoácidos</td> <td>no esencialesMedio Thermo Fisher</td><td>SH3023801</td><td>para células ES-D3</td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>Transfectación de células ES-D3</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>15710</td><td>Adquisición de imágenes de microscopía electrónica</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>Medio para células ES-D3</td></tr><tr><td>plásmido pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>Generación de expresión de GM-CSF plásmido de expresión</td></tr><tr><td>de PVDF membranas</td><td>Millipore EMD</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Generación de plásmido de expresión de GM-CSF</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>Generación de plásmido de expresión de GM-CSF</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Generación de plásmido de expresión de GM-CSF</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>Adquisición de imágenes de microscopía</td></tr><tr><td>electrónica Tripsina</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Cultivo de células ES-D3</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga, OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>High centrifugación de velocidad</td></tr><tr><td>Rotor ultracentrífugo, 45Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>Centrifugación de alta velocidad</td></tr><tr><td>Botella de policarbonato Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td>Centrifugación de alta velocidad</td></tr><tr><td>UranyLess solución de tinción</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>22409</td><td>Adquisición de imágenes de microscopía electrónica</td></tr></tbody></table>

aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Las células madre embrionarias (CES) son células madre pluripotentes capaces de autorrenovarse y diferenciarse en todo tipo de células embrionarias. Al igual que muchos otros tipos de células, las CES liberan pequeñas vesículas de membrana, como los exosomas, al entorno extracelular. Los exosomas sirven como mediadores esenciales de la comunicación intercelular y desempeñan un papel básico en muchos procesos (pato)fisiológicos. El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) funciona como una citoquina para modular la respuesta inmune. La presencia de GM-CSF en exosomas tiene el potencial de aumentar su función inmuno-reguladora. Aquí, GM-CSF se sobreexpresó de manera estable en la línea celular ESC murina ES-D3. Se desarrolló un protocolo para aislar vesículas extracelulares (VE) enriquecidas con exosomas de alta calidad de células ES-D3 que sobreexpresan GM-CSF. Los vehículos eléctricos aislados enriquecidos con exosomas se caracterizaron por una variedad de enfoques experimentales. Es importante destacar que se encontró que cantidades significativas de GM-CSF estaban presentes en los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas. En general, los vehículos eléctricos enriquecidos con exosomas que contienen GM-CSF de las CES podrían funcionar como vesículas libres de células para ejercer sus actividades inmunorreguladoras.

Gm-CSF se sobreexpresa en las CES murinas. Para sobreexpresar de manera estable GM-CSF en células ES-D3, el ADNc GM-CSF murino se clonó en un vector de transfección para generar el vector de expresión pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figura 1A). GM-CSF se sobreexpresó en las células ES-D3 por transfección, y alrededor del 20% de las células ES-D3 transfectadas transitoriamente fueron GFP positivas. Los clones celulares que sobree...

Este estudio describe un método para aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factores estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos inmunoestimulantes a partir de células madre embrionarias.

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Nuestro protocolo se puede utilizar para producir vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas de alta calidad a partir de células madre embrionarias que expresan el factor inmunoestimuldor, GM-CSF. Las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan GM-CSF, tienen el potencial de servir a las vesículas reguladoras inmunes libres de células que pueden modular la respuesta inmune. Los investigadores con la formación básica en biología molecular y celular, deberían ser capaces de fácilmente como podría ser este protocolo, pero cualquiera que realice este protocolo por primera vez debe seguir las instrucciones de cerca.Dado que nuestro protocolo es complicado, visualizar los intrincados detalles de cada paso ayudará a otros investigadores a generar FBS libre de exosomas, ultracentrífugo el volumen deseado de FBS y recolectar el sobrenadante libre de exosomas. Antes de emplatar la ESD tres células, cubra los platos de cultivo de tejidos de 15 centímetros con gelatina al 0,1% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Eliminar la gelatina por aspiración y cultivar las tres células ESD sin células de capa alimentadora en ESD tres medios de cultivo celular a 37 grados centígrados en incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcancen el 90% de confluencia.Lave los cultivos casi confluentes con cinco mililitros de tripsina al 0,05% por plato, seguido de una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados en tripsina fresca. Al final de la incubación, tire de las células separadas en un tubo de centrífuga e inactive la tripsina con cinco mililitros de medio de cultivo fresco. Sedimentar las células por centrifugación y volver a suspender los palets en medio fresco para el conteo Para el paso, placa cinco veces 10 a la sexta de la ESD tres células en 15 mililitros de medio de cultivo celular en nuevas placas recubiertas de gelatina durante tres días de cultivo antes de subcultivar las células Para recolectar el sobrenadante de cultivo celular para el aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas placa una vez 10 a la séptima ESD tres células en 15 mililitros de medio de cultivo celular por nueva placa recubierta de gelatina durante tres días antes de recolectar los sobrenadantes de cultivo celular Para el aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas, primero sedimentar los fragmentos celulares grandes dentro de los sobrenadantes recolectados de tres células ESD cultivadas durante 72 horas por centrifugación.Después de recolectar el sobrenadante, ultracentrifupe las muestras y deseche los sobrenadantes. Enjuague suavemente cada paleta dos veces con un mililitro de PBS por lavado para eliminar cualquier sobrenadante de cultivo residual y cuantificar el contenido de proteína de vesícula extracelular enriquecida con exosomas con un ensayo de ácido bicinconínico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego vuelva a suspender las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas en PBS a una concentración de seis microgramos por micro metro para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados.Para visualizar las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión, fije de tres a cinco microgramos por mililitro de las vesículas extracelulares con la concentración final de paraformaldehído de rejilla de microscopio electrónico al 2% a temperatura ambiente durante dos horas. Al final de la incubación, cargue 10 microlitros de las muestras fijas en rejillas de cobre con película de soporte de carbono durante un minuto antes de drenar las rejillas con papel de filtro, permanezca en las rejillas con una solución de tinción adecuada, de acuerdo con el protocolo del fabricante y use pinzas para transferir las rejillas a un trozo de papel de filtro, luego use el microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 50, 000 veces para adquirir imágenes de microscopía electrónica, de acuerdo con los protocolos estándar. Para preparar extractos de células enteras, recoja tres células ESD del cultivo como se ha demostrado y vuelva a suspender las células cosechadas en PBS para su conteo.Después de una segunda centrifugación, vuelva a suspender las celdas de cinco veces 10 a la tercera celda por microlitro de búfer de carga de página SDS que contiene una concentración de SDS de 0.5% y sonice las muestras durante 10 segundos en un Sonicator con una amplitud del 10%. Luego caliente las muestras a 100 grados centígrados durante cinco minutos. Para preparar lisatos para las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas, vuelva a suspender las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas en el búfer de carga de páginas SDS que contiene 0.5% SDS a una concentración de 1.2 microgramos por microlitro y sonice las muestras durante 10 segundos como se demostró y luego caliente las muestras a 100 grados Celsius durante cinco minutos.Para el análisis de Western Blot, cargue 10 microlitros de extracto al por mayor y muestras de lisado de vesícula extracelular enriquecida con exosomas en pozos individuales de un mejor gel de página de estrés. Al final de la carrera, transfiera las proteínas a las membranas de PVDF e incube las membranas con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados de interés, luego detecte la expresión de proteínas utilizando un kit de detección de quimioluminescencia mejorado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evaluar la cantidad de GM-CSF dentro de las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas, use un kit Murine GM-CSF para recubrir una placa ELISA con anticuerpos de captura anti GM-CSF a continuación, trate 0.6 microgramos de muestras de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas con 100 microlitros de PBS solo, o PBS más 0.05% tween 20 a temperatura ambiente durante 30 minutos.Al final de la incubación, agregue las muestras tratadas a los pozos individuales de la placa ELISA preparada durante una incubación de una hora a temperatura ambiente seguida del lavado de los pozos correspondientes apropiados con PBS solo, o PBS más 0.05% tween 20. Después del lavado, agregue el anticuerpo de detección a las muestras durante una incubación de una hora a temperatura ambiente seguida de un lavado con PBS solo o PBS más 0.05% tween 20 como se demuestra, Luego agregue Avidin Horseradish Peroxidasa a las muestras para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un lavado y medición de la absorbancia en cada pozo en un lector de microplacas a 450 nanómetros. La intensidad de fluorescencia GFP de una línea celular TRES DE ESD que expresa ESD tres o una línea de tres células de ESD que expresa un vector vacío es mucho mayor que la de sus contrapartes parentales.ELISA revela que tres células de ESD que expresan GM-CSF producen niveles marcadamente más altos de GMCSF en su sobrenadante de cultivo celular que las células de control de vectores vacíos. Además, la cantidad de GM-CSF generada por GM-CSF que expresa tres células es ESD es similar a la producida por los fibroblastos STO que expresan GM-CSF. La microscopía electrónica de transmisión de vesículas extracelulares aisladas de cultivos celulares transducidos vectoriales y transducidos GM-CSF revelan vesículas de diferentes tamaños que caen dentro del rango esperado de 30 a 100 nanómetros de diámetro.La expresión de marcadores exosómicos, incluyendo CD81, Annexin V y flotillin-1 se ve notablemente mejorada en vesículas extracelulares, aisladas de tres células ESD en comparación con los extractos mayoristas correspondientes por análisis de Western blot. Es importante destacar que no se detectó la presencia de otros marcadores de compartimento subcelular en ESD tres vesículas extracelulares derivadas, incluido el marcador de retículo endoplásmico, la proteína disulfuro isomerasa, los marcadores mitocondriales, el citocromo C y oxphos complejo IV-subunidad IV y el marcador citosólico GAPDH. Después del lavado con 0,05%tween 20, los niveles de GM-CSF de fondo detectados en las vesículas extracelulares de control se redujeron significativamente.En contraste, los niveles de GM-CSF en las vesículas extracelulares de las células que expresan GM-CSF aumentaron significativamente en la interpolación 20. La adquisición de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas de alta calidad que transportan GMCSF es el paso más importante para el éxito de este protocolo. Los investigadores pueden realizar experimentos adicionales, como estudios en líneas celulares y animales dependientes de GM-CSF para determinar si las vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que cuidan gm-CSF pueden funcionar como vesículas reguladoras inmunes libres de células.Estas vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas se pueden usar para explorar cómo la modulación de la respuesta inmune afecta diferentes condiciones de enfermedad.

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe un método basado en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para aislar vesículas extracelulares o EV derivadas de las células inmunitarias del cerebro: la microglía. Los VE actúan como carga molecular para administrar mediadores, que regulan una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, los EV aislados se pueden utilizar como modelo in vitro para estudiar la diafonía entre la microglía y las neuronas durante una respuesta inmunitaria neuronal.

Aislamiento basado en SEC de vesículas extracelulares derivadas de la microglía: una técnica para aislar vesículas extracelulares de medios de cultivo condicionados por la microglía

Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.

Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

La aplicación de exosoma es una herramienta emergente para el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Establecemos un protocolo de aislamiento exosoma con alta pureza para aislar exosomas de nuevas células madre identificadas llamadas CB-SC para estudios mecánicos. También coculuramos exosomas derivados de CB-SC con monocitos humanos, lo que lleva a su diferenciación en macrófagos fenotípicamente distintos.

Diferenciación de monocitos en macrófagos fenotípicamente distintos después del tratamiento con células madre de sangre de cordón humano (CB-SC)-Exosomas derivados

El protocolo aquí demuestra que las vesículas extracelulares pueden separarse adecuadamente de los medios de cultivo celular condicionados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño.

Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

El presente protocolo describe la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EVs representativas (exosomas y microvesículas) de MSCs humanas cultivadas. Otras aplicaciones de estos vehículos eléctricos también se explican en este artículo.

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Aquí, describimos un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de nanovesículas derivadas de endosomas como un nuevo tipo de imitadores de exosomas (EM) que comparten el mismo origen biológico y una estructura, morfología y composición proteica similares de las vesículas extracelulares (EV) nativas.

Un método de homogeneización de alta velocidad asistido por separación magnética para la producción a gran escala de vesículas derivadas de endosomas

La presencia de células madre del cáncer (CSC) en sarcomas óseos se ha vinculado recientemente a su patogénesis. En este artículo, presentamos el aislamiento de células madre cancerosas a partir de cultivos celulares primarios obtenidos de biopsias humanas de osteosarcoma convencional (OS) utilizando la capacidad de las células madre cancerosas de crecer bajo condiciones no adherentes.

Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

Aprende a aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan GM-CSF a partir de células madre embrionarias. Este protocolo detallado permite producir vesículas inmunorreguladoras de alta calidad para estudios terapéuticos.

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

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