Visualización de la morfología de los astrocitos usando la iontoforesis amarilla de Lucifer
14 de septiembre de 2019
Los astrocitos son células morfológicamente complejas, ejemplificadas por sus múltiples procesos y territorios tupidos. Para analizar su elaborada morfología, presentamos un protocolo fiable para realizar la iontoforesis amarilla de Lucifer intracelular en tejido ligeramente fijo.
Este método se puede utilizar para facilitar la visualización de procesos de astrocitos muy finos para la evaluación de interacciones neuronales de astrocitos en la sinapsis durante la enfermedad y estados estables. Esta técnica también se puede aplicar en cualquier modelo de ratón, población celular o región cerebral. Para preparar un electrodo afilado con una resistencia adecuada, tire de un electrodo de barril único de vidrio borosilicato con un filamento en un tirador de micropipetas.
Guarde los electrodos tirados en un recipiente cerrado para evitar que el polvo entre en las puntas y mantenga los electrodos elevados desde la parte inferior de la caja para evitar que las puntas se rompan. Para llenar un electrodo con solución de tinte amarillo lucifer, coloque un electrodo en la posición vertical con la punta hacia abajo, y pipetee de uno a dos microlitros de solución amarilla lucifer en la parte posterior del electrodo. Espere de cinco a 10 minutos para que la solución se mueva a la punta a través de la acción capilar antes de asegurar suavemente el electrodo lleno en un soporte de electrodo conectado a un manipulador con el cable de plata del soporte del electrodo en contacto con el amarillo lucifer dentro del electrodo.
Para la prueba de eyección de tinte, coloque suavemente una rebanada de cerebro ligeramente fija en un plato de fondo de vidrio lleno de 0.1 MOLar PBS a temperatura ambiente y mantenga la rebanada en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon. Conecte el electrodo a una fuente de tensión y coloque el electrodo de tierra en el baño que contiene la rebanada cerebral. Mueva el objetivo de un microscopio confocal a la región cerebral de interés y baje el electrodo a la solución utilizando la lente de inmersión de agua 10X, moviendo el electrodo al centro del campo de visión.
Bajo iluminación de campo brillante, examine el electrodo cuidadosamente con la lente de inmersión en agua 40X para asegurarse de que el electrodo parezca transparente y sin residuos ni burbujas. Cambie a la microscopía de escaneo láser confocal con un láser de 488 nanómetros. Encienda el estimulador a 12 voltios para probar la eyección del tinte.
Una gran nube de colorante fluorescente debe ser visible alrededor de la punta del electrodo. Luego, debajo del campo brillante, baje lentamente el electrodo hacia la rebanada, deteniéndose justo por encima de la superficie. Para llenar un astrocito de interés con iontoforesis, utilice el contraste de interferencia diferencial infrarroja para identificar astrocitos con somatas alargadas de forma ovalada de unos 10 micrómetros de diámetro, de 40 a 50 micrómetros por debajo de la superficie de la rebanada.
Este es el estrato radiatum del hipocampo directamente debajo de la capa celular piramidal. A medida que nos movemos a través del tejido, podemos ver vasos sanguíneos, neuronas, astrocitos y otros tipos celulares. Una vez que se ha seleccionado un astrocito, mueva la celda al centro del campo de visión y baje lentamente la punta del electrodo en la rebanada, navegando a través del tejido hasta que el electrodo esté en la misma llanura que el cuerpo celular.
Una vez que el cuerpo celular del astrocito es claramente visible y esbozado, avance lenta y suavemente el electrodo hacia adelante, moviendo el electrodo hasta que la punta empale el soma de la célula. Mueva el foco del objetivo lentamente hacia arriba y hacia abajo para observar si el electrodo está dentro del soma. Una vez que la punta del electrodo está dentro de la célula, encienda el estimulador en 0.5 a uno voltios para expulsar continuamente la corriente en la célula.
Usando el microscopio confocal, vea la película celular, aumentando el zoom digital para visualizar los detalles de la célula y para asegurarse de que la punta del electrodo es visible dentro de la célula según sea necesario. Espere unos 15 minutos hasta que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos antes de apagar la tensión y retirar suavemente la punta del electrodo de la célula. Para crear una imagen de la celda rellena, espere de 15 a 20 minutos para que la célula vuelva a su forma original antes de ajustar el ajuste en el microscopio confocal para asegurarse de que las ramas y procesos más finos aparecen definidos bajo el objetivo 40X.
Configure una pila Z con un tamaño de paso de 0,3 micrómetros, moviendo el objetivo durante la toma de imágenes hasta que no haya señal de la celda y establezca ese paso como la parte superior. A continuación, mueva el objetivo hacia abajo, centrándose a través de la celda hasta que no haya señal y establezca ese paso como la parte inferior. Una vez completada la toma de imágenes, compruebe si el electrodo está en busca de eyección de tinte.
Si aparece una nube de tinte grande, el electrodo se puede utilizar para la siguiente rebanada. De lo contrario, sustituya el electrodo. Al generar una proyección de intensidad máxima, se puede observar una vista detallada de la estructura de un astrocito en su dominio.
Un zoom de cuatro X magnitud en el astrocito revela una proyección de intensidad máxima de una rama principal, varias ramas secundarias y la distribución de las ramillas y foliolos circundantes. Aquí, se muestra la imagen original de un astrocito CA1. El cuerpo celular, las ramas principales, los procesos y el volumen del territorio encerrados por el astrocito se reconstruyen en estas imágenes posteriores.
Después de que se crearon las reconstrucciones, se cuantificaron los volúmenes del soma, toda la célula y el territorio. Y el número de ramas principales fueron contadas. Como proteína citoesquelética que etiqueta filamentos astrocitos intermedios se expresa en el soma celular, ramas principales, y algunas ramas secundarias de astrocitos, pero no en las ramas y procesos más finos.
En este análisis representativo, no se encontraron diferencias significativas en el número de ramas primarias etiquetadas por proteína ácida fibrilaria glial y las visualizadas por amarillo lucifer. Además, el área celular y el volumen del astrocito etiquetado por proteína ácida fibrilacionaria glial fueron significativamente más pequeños que el área y el volumen visualizado con amarillo lucifer, lo que demuestra que la proteína ácida fibrilaria glial es un marcador confiable para etiquetar las principales ramas, pero no es útil para determinar el área general o el volumen de la célula. La cantidad de tinte liberado de la punta del electrodo depende de la resistencia del electrodo que debe ser lo suficientemente alta como para permitir que se expulse un flujo constante de tinte.
Estudios futuros pueden examinar los diferentes componentes de la estructura de astrocitos mediante microscopía de luz de superrescencia o mediante un análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteínas específicas dentro de la estructura de los astrocitos.
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Resumen
Este estudio describe un protocolo para la iontoforesis intracelular de amarillo de luciferina con el fin de visualizar la morfología compleja de los astrocitos en tejido cerebral. El método permite el análisis de las interacciones entre astrocitos y neuronas durante diversos estados de salud y enfermedad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Neuroimagen
Antecedentes
- Los astrocitos son células complejas con múltiples prolongaciones.
- Su morfología es crucial para comprender las interacciones celulares.
- El amarillo de luciferina es un colorante fluorescente utilizado para imágenes detalladas.
- El protocolo establecido es aplicable a diversos modelos de ratón y regiones cerebrales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica confiable para visualizar la morfología de los astrocitos.
- Facilitar el estudio de las interacciones entre astrocitos y neuronas.
- Mejorar la comprensión de los roles de los astrocitos en la salud y la enfermedad.
Métodos Utilizados
- Se empleó la iontoforesis intracelular de lucifer amarillo en tejido cerebral ligeramente fijado.
- La preparación del electrodo implicó la tracción de electrodos de vidrio borosilicatado.
- Se probó la expulsión del colorante antes de llenar los astrocitos.
- Se utilizó microscopía confocal para obtener imágenes de los astrocitos marcados.
- La cuantificación de las estructuras de los astrocitos se realizó tras la obtención de imágenes.
Resultados principales
- La técnica permitió la observación detallada de los finos procesos de los astrocitos.
- Se analizaron cuantitativamente las ramas principales y su volumen territorial.
- Se destacaron las diferencias entre la marcación con proteína ácida fibrilar glial y la visualización con amarillo de luciferina.
- Se discutieron las implicaciones para comprender la estructura de los astrocitos en diversos estados.
Conclusiones
- Este protocolo permite la visualización precisa de la morfología de los astrocitos y sus interacciones.
- Los hallazgos subrayan las limitaciones de los marcadores tradicionales para evaluar las estructuras astrocitarias.
- Los conocimientos obtenidos en este estudio contribuyen a la comprensión de la neurobiología en estados tanto sanos como patológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Visualizar la morfología de los astrocitos con alta fidelidad apoya la validación de objetivos en la investigación de enfermedades neurodegenerativas al permitir un fenotipado estructural preciso. Este método aumenta la confianza predictiva en modelos preclínicos al revelar cambios morfológicos asociados a la enfermedad que se correlacionan con resultados funcionales. Proporciona una plataforma reproducible para la reducción mecanicista de riesgos en hipótesis terapéuticas que implican la modulación glial.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la integridad estructural de los astrocitos como biomarcador de la salud neuronal en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona mediciones morfométricas cuantitativas (volumen del soma, número de ramas, territorio) para evaluar de forma objetiva la interacción con el objetivo.
- Valor predictivo: Facilita la selección fenotípica de compuestos destinados a modular la reactividad de los astrocitos o la elaboración de sus prolongaciones.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera reconstrucciones 3D estandarizadas y de alta resolución adecuadas para tuberías de análisis de imágenes automatizadas.
- Reproducibilidad: Se basa en parámetros controlados de iontoforesis (voltaje, duración) para garantizar una tinción uniforme entre preparaciones.
- Escalabilidad: Compatible con múltiples regiones cerebrales y modelos de ratón, lo que permite la comparabilidad entre estudios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Permite examinar rigurosamente la remodelación estructural de los astrocitos en contextos de lesión o enfermedad donde se proponen cambios morfológicos.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos morfológicos de fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante puntos finales estructurales cuantificables.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Los datos morfométricos (por ejemplo, volumen del territorio, complejidad de las ramificaciones) informan los criterios de avance o interrupción para dianas que afectan la comunicación glioneuronal.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al proporcionar fenotipificación estructural que aporta información para la validación de dianas y las fases de optimización de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las interacciones astrocito-neuronales en sinapsis mediante la visualización directa de procesos finos.
- Selección: Permite preparaciones listas para ensayos con resultados cuantificables para evaluar los efectos de compuestos sobre la morfología de astrocitos.
- Análisis: Genera series Z confocales y proyecciones de intensidad máxima para el análisis morfométrico del soma, ramas y territorio.
- Investigación Traducional: Relaciona cambios estructurales con resultados funcionales mediante la correlación con la expresión proteica (por ejemplo, GFAP) dentro de astrocitos marcados.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen reutilizable aplicable a diversos modelos de enfermedades del SNC y regiones cerebrales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al distinguir la marcación de ramas principales (GFAP) de la visualización del volumen total de la célula (amarillo de Lucifer).
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de preparación del electrodo y validación de la expulsión del colorante.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de compuestos ineficaces dirigidos a las células gliales mediante fenotipado morfológico.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en perfiles de respuesta estructural de los astrocitos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología y microscopía confocal para la manipulación de electrodos y la iontoforesis.
- Depende de micropipeteadoras, estimuladores de voltaje y sistemas confocales de barrido láser con excitación a 488 nm.
- Necesita la estandarización de la fijación del tejido, la resistencia del electrodo y la concentración del colorante entre diferentes usuarios y sitios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la profundidad variable de la región cerebral, el tamaño celular y la permeabilidad del tejido en diferentes modelos de ratón o estados patológicos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la obstrucción del electrodo, la fuga del colorante y la necesidad de un tiempo de recuperación tras el llenado para evitar artefactos estructurales.
