Name: Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a editar el genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos de las familias Gymnotiformes y Mormyridae. Este protocolo permite generar larvas mutantes F0 para estudiar la función génica en organismos modelo.

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Los autores reconocen los heroicos esfuerzos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud y Hope Healey por su ayuda con la cría de peces, la recopilación de datos y el desarrollo temprano del protocolo. También nos gustaría dar las gracias a los tres críticos por sus sugerencias al manuscrito. Creemos que el producto final es de mejor calidad después de abordar sus comentarios. Este trabajo fue financiado por el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias #1644965 y #1455405 a JRG, y la DG del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería a VLS.

Los autores no tienen nada que revelar.

La riqueza fenotípica de los peces débilmente eléctricos, junto con una reciente proliferación de recursos genómicos, motiva una fuerte necesidad de herramientas genómicas funcionales en el modelo de peces débilmente eléctricos. Este sistema es particularmente atractivo debido a la evolución convergente de numerosos rasgos fenotípicos en linajes paralelos de peces, que se mantienen fácilmente en el laboratorio.
El protocolo descrito aquí demuestra la eficacia de la técnica CRISPR/Cas9 en linaj...

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Dos linajes de peces teleost, osteoglossiformes y siluriformes, electrorecepción evolucionada en paralelo, y cinco linajes de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, y los géneros Astroscopus, Malapterurus y Synodontis) electrogénesis evolucionada en paralelo. Hay un grado sorprendente de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común1,2,3.
Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnotiformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies, que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno ycomunicarse 4, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo1,5 ,6, sistemas y circuitos neurociencia7,8,9,10, fisiología celular11,12, ecología y energía13 ,14,15,16,17, comportamiento18,19, y macroevolución3,20,21 .
Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos, transcriptomicos y proteómicos para peces eléctricos1,22,23,24,25,26, 27,28. El uso de estos recursos ya ha producido importantes perspectivas sobre la conexión entre genotipo y fenotipo en estas especies1,2,3,28,29 ,30. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales31.
Una de estas herramientas es la técnica de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas recientemente desarrolladas junto con la técnica de endonucleasa Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición del genoma que ha entrado en uso generalizado tanto en los modelos32,33,34 y organismos no modelo35,36,37 por igual. La tecnología CRISPR/Cas9 ha progresado hasta un punto en el que un laboratorio capaz de la biología molecular básica puede generar fácilmente sondas específicas genéticas llamadas ARN de guía corta (SgRNAs), a un bajo costo utilizando un método de no clonación38. CRISPR tiene ventajas sobre otras estrategias de derribo/desaqueo, como morpholinos39,40, nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALENs), y nucleasas de dedos de zinc (ZFN), que son costosas y tiempo para generar para cada gen objetivo.
El sistema CRISPR/Cas9 funciona para crear nocauts genéticos apuntando a una región específica del genoma, dirigida por la secuencia sgRNA, y causando una rotura de doble cadena. La rotura de doble cadena es detectada por la célula y desencadena mecanismos endógenos de reparación del ADN preferentemente utilizando la vía de unión final no homóloga (NHEJ). Esta vía es altamente propensa a errores: durante el proceso de reparación, la molécula de ADN a menudo incorporará inserciones o deleciones (indels) en el sitio de rotura de doble cadena. Estos indels pueden resultar en una pérdida de la función debido a (1) cambios en el marco de lectura abierto, (2) inserción de un codón de parada prematura, o (3) cambios en la estructura primaria crítica del producto genético. En este protocolo, utilizamos la edición CRISPR/Cas9 para apuntar mutaciones puntuales en genes diana utilizando el NHEJ en especies de peces débilmente eléctricos. Si bien es más simple y eficiente que otras técnicas, se espera que este método de mutagénesis resulte en una serie de severidades fenotípicas en F0,que se atribuye al mosaico genético41,42,43 ,44.
Selección de organismos Con el fin de facilitar futuros estudios sobre la genómica comparativa de los peces débilmente eléctricos, es necesario seleccionar una especie representativa tanto para gimnotiformes como mormyrids para el desarrollo de protocolos. Después de las discusiones durante la reunión de Pescado Eléctrico de 2016 en Montevideo, Uruguay, hubo consenso de la comunidad para utilizar especies que ya podían ser criadas en el laboratorio y que tenían recursos genómicos disponibles. El gymnotiform Brachyhypopomus gauderio y el mormyrid Brienomyrus brachyistius fueron seleccionados como especies que se ajustan a estos criterios. En ambas especies, las señales naturales para inducir y mantener las condiciones de reproducción son fáciles de imitar en cautiverio. B. gauderio,una especie gimnoiforme de América del Sur, tiene la ventaja de bajos requisitos de cría: los peces se pueden mantener a una densidad relativamente alta en tanques relativamente pequeños (4 L). B. gauderio también tiene una rápida rotación generacional en condiciones cautivas. En condiciones de laboratorio, B. gauderio puede desarrollarse de huevo a adulto en aproximadamente 4 meses.
B. brachyistius, una especie de pez mormirid de Africa Occidental-Central, se reproduce fácilmente en cautiverio. B. brachyistius está fácilmente disponible a través del comercio de acuarios, ha sido ampliamente utilizado en muchos estudios, y ahora tiene una serie de recursos genómicos disponibles. Su ciclo de vida abarca entre 1 y 3 años, dependiendo de las condiciones de laboratorio. Los requisitos de cría son algo más intensivos para esta especie, requiriendo tanques de tamaño moderado (50-100 L) debido a su agresión durante la reproducción.
Los laboratorios que estudian otras especies de peces eléctricos deben ser capaces de adaptar fácilmente este protocolo siempre y cuando la especie pueda ser criada, y los embriones de una sola célula pueden ser recogidos y criados en la edad adulta. Las tasas de vivienda, cría larvaria y fertilización in vitro (FIV) probablemente cambiarán con otras especies; sin embargo, este protocolo puede ser utilizado como punto de partida para los intentos de cría en otros peces débilmente eléctricos.
Un objetivo gene ideal para la prueba de concepto: scn4aa Los peces mormyrid y gimnotiformo débilmente eléctricos generan campos eléctricos (electrogénesis) mediante la descarga de un órgano especializado, llamado órgano eléctrico. Las descargas de órganos eléctricos (EOD) son el resultado de la producción simultánea de potenciales de acción en las células de órganos eléctricos llamadas electrocitos. Los EOD son detectados por una serie de electrorreceptores en la piel para crear imágenes eléctricas de alta resolución del entorno de los peces45. Los peces débilmente eléctricos también son capaces de detectar características de las formas de onda EOD de sus conespecíficos18, así como sus velocidades de descarga46,lo que permite que los EODfunciones funcionen adicionalmente como una señal de comunicación social análoga al canto de los pájaros o ranas vocalizaciones47.
Un componente principal de la generación de potencial de acción en los electrocitos de peces débilmente eléctricos mormyrid y gymnotiform es el canal de sodio cerrado por tensión NaV1.42. Los teleosts no eléctricos expresan dos copias genéticas yólo, scn4aa y scn4ab,codificación para el canal de sodio cerrado con tensión NaV1.430. Tanto en los linajes de peces gimnotiformos como mormyrid débilmente eléctricos, scn4aa ha evolucionado rápidamente y ha sufrido numerosas sustituciones de aminoácidos que afectan a sus propiedades cinéticas48. Lo más importante es que la scn4aa se ha compartimentado en ambos linajes del órgano eléctrico2,3. La expresión relativamente restringida de scn4aa al órgano eléctrico, así como su papel clave en la generación de EODs, lo convierten en un objetivo ideal para los experimentos knockout de CRISPR/Cas9, ya que tiene efectos pleiotrópicos mínimamente nocivos. Debido a que los peces débilmente eléctricos comienzan a descargar sus órganos eléctricos larvales de 6 a 8 días después de la fertilización (DPF), la focalización de scn4aa es ideal para el fenotipado rápido después de la microinyección de embriones.

<table><tbody><tr><td>20 mg/mL Glucógeno de grado de ARN</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>50 pb Escalera de ADN</td><td>NEB</td><td>N3236L</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>Instrumento</td><td>Sutter BF100-58-10</td> <td>(D.O. 1,0 mm, D.I. 0,58 mm, 10 cm de longitud</td></tr><tr><td>)Proteína Cas9 con NLS; 1 mg/mL</td><td>PNA Biología</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood & Kit de tisú</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector Eppendorf FemptoJet 4i</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcargador Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton jeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-654</td><td>denominada "jeringa de vidrio de precisión" en el protocolo</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>denominado "toallita de tareas delicadas" en el protocolo</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>NEB</td><td>B7003S</td><td>utilizado para el ensayo de escisión in vitro</td></tr><tr><td>OneTaq DNA kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Syndel USA</td><td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td><td>denominado "agente de desove" en el protocolo</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>denominado "termoplástico" en el protocolo</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>WPI</td><td>SU-P97</td><td>marca</td></tr><tr><td>sutter QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Aguja reutilizable- requiere personalización</td><td>Fisher Scientific</td><td>7803-02</td><td>Personalice a 0.7 pulgadas de largo; estilo de punto 4 y ángulo 25</td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td>Uso con el tampón NEB 10x que se incluye</td></tr><tr><td>Herramientas recubiertas de teflón</td><td>bonefolder.com</td><td>T-SPATULA4PIECE</td><td>denominado "politetrafluoroeteno" en el protocolo</td></tr></tbody></table>

silenciar la chispa: edición del genoma crispr/cas9 en peces débilmente eléctricos

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Hay un sorprendente grado de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común. Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnoliformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno y comunicarse, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo, los sistemas y circuitos de neurociencia, fisiología celular, ecología, biología evolutiva y comportamiento. Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos para los peces eléctricos. El uso de estos recursos ya ha facilitado importantes conocimientos con respecto a la conexión entre el genotipo y el fenotipo en estas especies. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales. Aquí informamos de un protocolo completo para la realización de mutagénesis CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos endógenos de reparación del ADN en peces débilmente eléctricos. Demostramos que este protocolo es igualmente eficaz tanto en la especie mormyrid Brienomyrus brachyistius como en el gymnotiform Brachyhypopomus gauderio mediante el uso de CRISPR/Cas9 para apuntar a indels y mutaciones puntuales en el primer exón de la canal de sodio scn4aa. Utilizando este protocolo, se obtuvieron embriones de ambas especies y se genotiparon para confirmar que las mutaciones pronosticadas en el primer exón del canal de sodio scn4aa estaban presentes. El fenotipo de éxito de knock-out se confirmó con grabaciones que muestran amplitudes de descarga de órganos eléctricos reducidas en comparación con los controles de tamaño no inyectados.

Los sitios objetivo del sgRNA se identificaron dentro del exón 1 de scn4aa en B. gauderio y B. brachyistius como se describe en la Sección 1. Los sgRNA se generaron como se describe en la Sección 2. Tras la selección y síntesis exitosas del ARNS(Figura 1), se probó el escote in vitro(Figura 2). Los sgRNA que demostraban el corte in vitro fueron seleccionados para microinyecciones de una sola célula.
Los pece...

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

La edición de genes CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos, particularmente en un contexto comparativo, permitirá a los investigadores probar hipótesis sobre cómo los genes específicos y la varianza genética contribuyen a la variación fenotípica. CRISPR/Cas9 es un método eficiente para generar embriones mutantes F-cero. Este protocolo permite a los investigadores llevar a cabo manipulaciones CRISPR-Cas9 en dos especies evolucionadas convergentemente de peces débilmente eléctricos.La clave para utilizar este enfoque con algunas modificaciones en otros peces eléctricos u otras especies de peces es la disponibilidad de recursos transcriptómicos o genómicos para hacer sgRNAs. Realizar las microinyeccións y visualizar las celdas en una ubicación 3D dentro de un plano 2D puede ser difícil. Obtener una pequeña colonia de peces cebra para que los huevos practiquen técnicas generales de microinyección.Demostrando el procedimiento con Savvas Constantinou estará Jared Thompson, un técnico de mi laboratorio. Después de albergar las especies de peces de interés en las condiciones de cría adecuadas, identifique los peces hembra que aparecen gravid. En B.gauderio, la hembra tendrá gónadas hin

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Investigación

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Biology

Biología

Este video describe una técnica de eliminación de genes que utiliza morfolinos bloqueadores traslacionales microinyectados en la etapa unicelular del pez de cueva. Los morfolinos son oligonucleótidos de ADN que se unen a la secuencia complementaria del ARNm diana y bloquean su traducción a una proteína. En consecuencia, los morfolinos se utilizan como herramientas moleculares para detener o reducir la expresión de un gen de forma transitoria.

Edición de genes mediada por morfolinos: una técnica de eliminación de genes que utiliza oligonucleótidos de morfolino bloqueantes traslacionales en huevos unicelulares de peces de cueva

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Aquí, describimos una herramienta de edición del genoma basada en la estabilización temporal y condicional de la proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) (Cas9) bajo la pequeña molécula, Shield-1. El método se puede utilizar para células cultivadas y modelos animales.

Un nuevo kit de herramientas para evaluar las funciones genéticas utilizando la estabilización condicional cas9

Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Este protocolo describe cómo realizar una edición eficiente de la base de adenina sin limitación de PAM para construir un modelo preciso de la enfermedad del pez cebra utilizando zSpRY-ABE8e.

Edición de base eficiente sin PAM para el modelado de peces cebra de enfermedades genéticas humanas con zSpRY-ABE8e

Aquí, describimos un protocolo para generar mutantes maternos que acopla una línea knock-in zpc:cas9 estable con la entrega mediada por Tol2 de casetes de expresión de sgRNA.

Generación de mutantes maternos usando pez cebra zpc:cas9 knock-in

Aprende a editar el genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos de las familias Gymnotiformes y Mormyridae. Este protocolo permite generar larvas mutantes F0 para estudiar la función génica en organismos modelo.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

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