Name: Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a evaluar la dinámica del husillo mitótico y el destino celular mediante imágenes de células vivas. Este método permite visualizar defectos mitóticos y analizar la progresión celular en respuesta a fármacos.

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1. Generación de células hTERT-RPE-1 que expresan establemente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) y -tubulin-EGFP (tub-EGFP)
NOTA: Todos los pasos siguen técnicas asépticas y tienen lugar en un armario de seguridad de nivel de bioseguridad II+ (BSL2+).
<ol><li>Generar retrovirus que lleven los genes de interés (-tubulina-EGFP y RFP-H2B) por la transfección de células 293T con los plásmidos lentivirales apropiados de acuerdo con las instrucciones del fabricante del sistema de administración de transfección basado en lípidos.<ol>
<li>Día 1: Utilice una pipeta Pasteur de vidrio desechable para aspirar el medio de cultivo celular de una placa de células subconfluentes 293T y lavar el medio residual con solución salina tamponada de fosfato (PBS) añadiendo 5 ml de PBS. Gire para distribuir PBS sobre el fondo de la placa, luego aspire el PBS con una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril.</li>
		<li>Añadir 2 ml de trippsina al 0,05% que se haya precalentado a 37 oC y devolver la placa a una incubadora humidificada a 37 oC con 5% deCO2 durante 2 a 5 min para permitir la liberación de células adherentes de la superficie del plato de cultivo celular.</li>
		<li>Añadir 8 ml de medio de águila modificado (DMEM) fresco de Dulbecco, complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina a la placa que contiene trippsina.</li>
		<li>Resuspenda las células pipeteando suavemente y transfiera la suspensión a un tubo cónico estéril de 15 ml. Coloque el tubo cónico en una centrífuga equilibrada y gire a 161 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar suavemente las células.</li>
		<li>Aspirar la solución media/trippsina de células peletizadas y resuspender células en 10 ml de DMEM suplementadas con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina. Utilice un hemocitómetro para contar la suspensión de celda 293T y la placa 2 x 106 293T células por pozo de una placa de 6 pocillos.</li>
		<li>Células de cultivo en un volumen total de 2 ml del medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementadas con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina y manteneren en una incubadora humidificada a 37oC con 5% de CO2.</li>
		<li>Día 2: Pipeta de 7 ml de reactivo de entrega de transfección a base de lípidos y 100 ml de medio sérico reducido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y permite que se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos (tubo #1).</li>
		<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, pipeta 1 g de vector de expresión RFP-H2B (o 1 g de vector de expresión de tubulina-EGFP), junto con un reactivo potenciador de 5 l (según sea necesario según las directrices del fabricante), 0,5 g pMD2.G y 1 g de psPAX2 y 100 l de reactivo reducido medio sérico (tubo #2).</li>
		<li>Combine el contenido del paso 1.1.7 y el paso 1.1.8 pipeteando cuidadosamente #2 en tubos #1 e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. NOTA: La reacción se puede escalar según sea necesario para la transfección de células en pozos adicionales.</li>
		<li>Pipetear la reacción de transfección en gota al pozo deseado que contiene 293T en 2 ml de medio y devolver el plato a la incubadora humidificada a 37 oC con 5% de CO2. NOTA: Para generar células que expresen tanto RFP-H2B como -tubulina-EGFP, genere un virus independiente para cada construcción de expresión (pasos 1.1.7- 1.1.9).</li>
		<li>Día 3: Aspirar y sustituir el medio por 2 ml de DMEM fresco complementado con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina. Devolver el plato a la incubadora humidificada a 37oC con un 5% deCO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 4: Recoger el medio que contiene partículas de virus expresadas, siendo cauteloso no interrumpir o eliminar las células 293T. Filtrar el medio que contiene partículas de virus pasándolo a través de un filtro de 0,45 m unido a una jeringa de 5 ml. Virus aliquot para almacenamiento a corto plazo a 4 oC, o almacenamiento a largo plazo a -80 oC. NOTA: Las partículas virales obtenidas de esta manera estarán presentes en un rango de 1 x 107 a 1 x 108 Unidades transductoras/ml. Como las células y células que producen virales y las células que se infectan se cultivan en el mismo medio, no se requiere concentración viral para reemplazar el medio y las partículas virales filtradas se pueden utilizar directamente para infectar las células.</li>
	<li>Semilla 2 x 105 hTERT-RPE-1 células por pozo de un plato de 6 pozos en preparación para la infección viral. Células de cultivo en 2 ml de DMEM suplementadas con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina y mantener en una incubadora humidificada a 37oC con 5% co2.</li>
	<li>Día 5: Añadir bromuro de hexadimetrina (p. ej., polibreno) a las células hTERT-RPE-1 a una concentración final de 8 g/ml. Infectar las células con una mezcla de 500 ml de virus diluido en 500 ml de medio de cultivo celular. NOTA: La solución de stock de bromuro de hexadimetrina se prepara en agua destilada estéril y luego se filtra a través de un filtro de 0,45 m.</li>
	<li>Día 6: Usando una pipeta Pasteur de vidrio desechable, aspirar el medio de los pozos que contienen las células infectadas por el virus. Reemplace el medio de cultivo celular por 2 ml de DMEM que contenga 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina y concentraciones adecuadas de antibióticos para seleccionar para la integración y expresión de plásmido. NOTA: El plásmido de expresión de tubulina-EGFP utilizado en los experimentos descritos lleva un gen de resistencia a la puromicina y el plásmido de expresión RFP-H2B conlleva un gen de resistencia a la blasticidina. Por lo tanto, se utilizan 10 g/ml de puromicina y 2 g/ml de blasticidina para la selección de células de la tubulina-EGFP, RFP-H2B que expresa las células de hTERT RPE-1. Las concentraciones de antibióticos utilizados para la selección pueden diferir para varias líneas celulares utilizadas.</li>
	<li>Mantener las células bajo selección de antibióticos durante 5-7 días, reemplazando el medio cada 3 días por un medio fresco que contenga reactivos de selección adecuados. NOTA: Las celdas deben mantenerse en la subconfluencia durante la selección y deben ampliarse según sea necesario, como se describe en los pasos 1.1.1 a 1.1.4.</li>
	<li>Utilice imágenes de inmunofluorescencia para confirmar la expresión de construcciones etiquetadas. NOTA: Si lo desea, se pueden derivar clones de una sola celda para obtener niveles de expresión uniformes dentro de la población de células. Una vez que se confirman los clones estables, las células se pueden mantener bajo las condiciones de cultivo estándar en ausencia de selección de antibióticos.</li>
</ol>2. Preparación de células para imágenes de células vivas después de perturbaciones del husillo mitotico
NOTA: Utilice técnicas asépticas y realice los pasos de un armario de seguridad BSL2.
<ol><li>Usando una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril, aspirar el medio de la placa de cultivo que contiene la línea celular que lleva la(s) construcción(es) de expresión (del paso 1.7). Lave brevemente las células con 10 ml de PBS estéril. Gire para distribuir PBS sobre el fondo de la placa, luego aspire PBS con una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril.</li>
	<li>Añadir 2 ml de 0,05% de trippsina a la placa de 10 cm. Incubar la placa a 37 oC durante 2-5 min o hasta que las células se hayan separado de la superficie de la placa.</li>
	<li>Añadir 8 ml de medio fresco a la placa que contiene trippsina. Resuspenda las células pipeteando suavemente y transfiera la suspensión a un tubo cónico estéril de 15 ml. Coloque el tubo cónico en una centrífuga equilibrada y gire a 161 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar suavemente las células.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en 10 ml de PBS pipeteando suavemente con una pipeta serológica de 10 ml. Coloque el tubo cónico en una centrífuga equilibrada y gire a 161 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar suavemente las células.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en 10 ml del medio fresco pipeteando suavemente con una pipeta serológica de 10 ml.</li>
	<li>Cuente las células, luego calcule el número de celda usando un hemacitómetro y diluya a una concentración de 1-2 x 105 células/ml en el medio de cultivo celular. Semilla de 500 l de la suspensión celular a cada pocto de una placa inferior estéril de 12 poloes. Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular y permita que las células se adhieran a la superficie de la placa. NOTA: Las imágenes de celda sin vida requieren que las celdas estén bien adheridas para que permanezcan asociadas con el plano de imagen durante la adquisición de la imagen. La duración del tiempo necesario para que las celdas se adhieran después del revestimiento puede diferir de una línea de celda a la siguiente y debe optimizarse para la línea de celda en estudio.</li>
	<li>Hasta 30 minutos antes de iniciar la toma de imágenes de lapso de tiempo, agregue una concentración relevante de un fármaco mitético a uno o más de los pozos sembrados con células. Para tener en cuenta el impacto potencial del disolvente orgánico en el comportamiento celular, agregue un volumen igual del diluyente del inhibidor a las células como controles. Por ejemplo, asegúrese de que la adición de 100 nM del inhibidor específico de la quinasa mitológica Aurora A (por ejemplo, alisertib) sea paralela a un volumen igual de DMSO, el diluyente de este fármaco, en un pozo de control de las células. NOTA: El análisis comparativo de los cambios dinámicos en la progresión mitótica requiere que se preparen pozos de células en ausencia de perturbaciones para permitir la toma de imágenes de los mitoses normales en paralelo a las condiciones experimentales.</li>
</ol>3. Microscopio configurado para imágenes de lapso de tiempo de RFP-H2B, células de expresión de la tubulina-GFP(Figura 1, Figura 2)
<ol><li>Coloque la placa de cultivo celular que contiene RFP-H2B, -tubulina-GFP que expresa las células hTERT RPE-1 que se mostrarán en un inserto de etapa apropiado en un microscopio de epifluorescencia invertido que está equipado con una cámara de alta resolución (tamaño de píxel de 0,67 m a 20x), un cámara ambiental precalentada a 37oC, y un sistema de entrega para humidificado 5% CO2. NOTA: Las cámaras ambientales cerradas o las inserciones de escenario controladas por temperatura pueden ser apropiadas siempre que se pueda entregar un 5% deCO2 humedecido y obtener un control de temperatura estable.</li>
	<li>Utilice un objetivo de aire 20x con una apertura numérica de 0,5 y equipado para la fluorescencia de alto contraste y el contraste de fase o la imagen de campo brillante. Vea las celdas con el contraste de fase o el campo brillante y ajuste el curso y el enfoque fino en el microscopio para enfocar las células.</li>
	<li>Identifique y establezca los tiempos de exposición óptimos para la adquisición de imágenes de campo brillante, GFP y RFP seleccionando el cubo de filtro respectivo con la excitación y emisión apropiadas para los fluoróforos que se crearán imágenes. También puede hacer clic en el botón de exposición automática para introducir un tiempo de exposición predeterminado. Si la señal no es lo suficientemente intensa, seleccione pixel binning para permitir tiempos de exposición más cortos haciendo clic en la pestaña de binning y seleccionando 2 x 2 pixel binning en el menú desplegable. NOTA: La fototoxicidad puede afectar la progresión mitótica y la viabilidad celular. El fracaso de las células mitoticas en las poblaciones de control para completar las mitosis normales puede ser una indicación de que los tiempos de exposición y/o la duración de las imágenes deben optimizarse aún más.</li>
	<li>Utilice un software de adquisición y análisis que permita adquirir simultáneamente imágenes multicoordenadas y multipozos y definir los parámetros para la adquisición de imágenes.<ol>
<li>Seleccione y calibre la etapa del microscopio a la placa multi-pozo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice el software de adquisición de imágenes para resaltar o seleccionar los pozos que se crearán en la imagen haciendo clic en los pozos relevantes en el diagrama del formato de placa que se está utilizando.</li>
		<li>En el panel de control GeneratedPoints (Figura 2), defina las coordenadas dentro de cada pozo que se crearán en la imagen haciendo clic en la pestaña Colocación de puntos y seleccionando la colocación de coordenadas predefinida o aleatoria de el menú desplegable. Seleccione la pestaña Area de trabajo y seleccione restringido en el menú desplegable para restringir el área de selección de coordenadas para excluir los límites del pozo. Haga clic en las fichas Recuento y Distribución para seleccionar el número y la distribución de los puntos que se van a capturar por pozo, respectivamente. NOTA: El número de coordenadas que se pueden crear imágenes por pozo dentro del incremento de 5 minutos de tiempo estará limitado por el número de pozos a crear imágenes, así como el tiempo de exposición para cada canal. Típicamente, 5-8 coordenadas por pozo son suficientes para observar al menos 50 células en cada condición progresan a través de la mitosis dentro de 4 h.</li>
		<li>Seleccione e introduzca el intervalo de tiempo y la duración para recopilar imágenes haciendo clic e introduciendo los valores en el panel de control TimeSequence. NOTA: La adquisición de imágenes cada 1 a 5 minutos es adecuada para supervisar la dinámica de la progresión mitotica. La duración total de la toma de imágenes debe reflejar el punto final deseado y la tasa de proliferación de la línea celular. Por ejemplo, 4 horas es suficiente para ver muchas células progresar a través de la mitosis, 16 horas es suficiente para ver la mayoría de las células RPE-1 en un progreso de la población asincrónica a través de la mitosis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de imagen de lapso de tiempo para determinar el tiempo metafásico y el destino de células mitoticas después de perturbaciones mitoticas del husillo
NOTA: Realice el análisis de imágenes utilizando un software de adquisiciónde imágenes (Tabla de materiales),ImageJ o un software de análisis de imágenes comparable.
<ol><li>Visualice la cromatina etiquetada RFP-H2B seleccionando las imágenes capturadas con el cubo de filtro RFP en su lugar. Identificar una célula que entra en la mitosis como se indica en la compactación inicial de la cromatina(Figura 2C, punta de flecha azul) y la envolvente nuclear se descomponen (cuando el límite nuclear ya no excluye la -tubulina-EGFP).</li>
	<li>Determinar el momento mitótico de la alineación de la metafase y el inicio de la anafásica en celdas individuales: Realice un seguimiento de la célula a través de puntos de tiempo consecutivos en la película adquirida para determinar el número de puntos de tiempo/minutos desde la entrada mitótica hasta la cromatina etiquetada con RFP-H2B completa la alineación en el ecuador de celdas durante la metafase(Figura 2C,punta de flecha amarilla).</li>
	<li>Para monitorear el tiempo mitático, la fidelidad mitotica y el destino celular, continúe rastreando la célula a través de puntos de tiempo consecutivos para identificar la coordenada de tiempo en la que la segregación del cromosoma anafásico es evidente(Figura 2C,punta de flecha blanca) y/o donde se ha producido la descomposición de la cromatina y la reforma de la envolvente nuclear (como se indica mediante la exclusión de la tubulina del núcleo). NOTA: Las perturbaciones en el ensamblaje del husillo o la progresión mitológica se pueden evaluar en función del tiempo necesario para obtener un husillo mitético bipolar y lograr una alineación cromosómica completa, o para completar la segregación del cromosoma anafásico.</li>
	<li>Visualice RFP-H2B para identificar las células de cada población que presentan defectos mitóticos, incluidos los cromosomas rezagados y los puentes de cromatina durante la segregación del cromosoma anafásico. NOTA: La fidelidad mitotica comprometida también puede dar lugar a células hijas multinucleadas o micronucleadas y se puede visualizar en las células después de la salida mitotica, como en la Figura 3.</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La resolución temporal proporcionada por las imágenes de lapso de tiempo permite la visualización y evaluación de eventos celulares secuenciales dentro de células individuales. Los enfoques que hacen uso de la sincronización celular seguido de la recopilación y fijación de celdas en puntos de tiempo secuenciales son limitados en que las comparaciones se hacen en última instancia entre poblaciones de celdas. En contextos donde la respuesta celular a las perturbaciones puede ser no uniforme, o donde el proceso que se visua...

El análisis basado en imágenes de células fijas se utiliza comúnmente para evaluar los cambios en el nivel de población celular en respuesta a diversas perturbaciones. Cuando se combina con la sincronización celular, seguida de la recopilación y la creación de imágenes de puntos de tiempo en serie, estos enfoques se pueden utilizar para sugerir una secuencia celular de eventos. Sin embargo, las imágenes de células fijas están limitadas en el sin embargo, las relaciones temporales están implícitas para una población y no se demuestran a nivel de celdas individuales. De esta manera, mientras que la creación de imágenes y análisis de células fijas es suficiente para observar fenotipos robustos y cambios en el estado estacionario, la capacidad de detectar cambios transitorios a lo largo del tiempo y cambios que afectan solo a una subpoblación de las células es imperfecta. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares y subcelulares dentro de una sola célula, o población celular, con el tiempo y sin la ayuda de enfoques de sincronización que pueden afectar el comportamiento celular 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
La formación de un husillo mitético bipolar es esencial para la segregación cromosómica adecuada durante la división celular, lo que resulta en dos células hijas genéticamente idénticas. Los defectos en la estructura del husillo mitotico que corrompen la progresión mitotica y comprometen la fidelidad de la segregación cromosómica pueden resultar en divisiones celulares catastróficas y una menor viabilidad celular. Por esta razón, los venenos mitoticos que alteran la formación del husillo son terapias prometedoras para limitar la rápida proliferación de células cancerosas7,8,9. Sin embargo, el análisis de células fijas de la estructura del husillo después de la adición de venenos mitoticos es limitado en su capacidad para evaluar el proceso dinámico de formación del husillo y puede no indicar si los cambios observados en la estructura del husillo son permanentes o son en cambio transitorio y puede ser superado para permitir una división celular exitosa.
En este protocolo, describimos un enfoque para evaluar la dinámica de la mitosis después de las perturbaciones del husillo por imágenes de células vivas. Usando la línea celular RPE-1 inmortalizada hTERT diseñada para expresar un Histone 2B con la etiqueta RFP para visualizar la cromatina, junto con una tubulina con etiqueta EGFP para visualizar microtúbulos, el tiempo de alineación del cromosoma metafase, el inicio de la anafase y, en última instancia, el destino celular mitotico se evalúa mediante señales visuales de movimiento cromosómico, compactación y morfología nuclear.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>25-510</td><td>Una serina proteasa utilizada para liberar células adherentes de placas de cultivo</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Fluor objetivo&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Para uso en imágenes de células vivas para visualizar tanto el campo brillante como la fluorescencia</td></tr><tr><td>293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Para uso en transfección retroviral; utilizado en el paso 1.1</td></tr><tr><td>a-tubulina-EGFP&nbsp;</td><td>Vector</td><td></td><td>de expresión de alfa tubulina fusionada a una etiqueta de proteína fluorescente verde; para su uso en la visualización de tubulina en imágenes de células vivas: disponible comercialmente a través de addgene y otros proveedores</td></tr><tr><td>Alisertib</td><td>Selleckchem</td><td>S1133</td><td>Inhibidor de molécula pequeña de la quinasa mitótica Aurora A. La concentración de stock se prepara a 10 mM en DMSO y se utiliza a una concentración final de 100 nM.</td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Invitrogen</td><td>A11139-03 Agente de</td><td>selección de antibióticos; utilizado para seleccionar células que expresan</td></tr><tr><td>C02</td><td>Gas</td><td></td> aéreo para uso <td>en cultivos celulares e imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td>Juego de filtros de banda única; longitud de onda de excitación 545 nm con un ancho de banda de 25 nm y emisión a una longitud de onda de 605 nm con un ancho de banda de 70 nm; para la visualización de H2B-RFP</td></tr><tr><td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td>Juego de filtros de banda única; longitud de onda de excitación 470 nm con ancho de banda de 40 nm y emisión a 525 nm longitud de onda con ancho de banda de 50 nm; para la visualización de</td></tr><tr><td>pipetas Pastuer de vidrio desechables GFP-tubulina, esterilizadas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Para uso en células aspirantes&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Gibo-Ciencias de la vida</td><td>11965-084</td><td>Medio de cultivo celular para el crecimiento de células RPE-1 y 293T</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibo-Ciencias de la vida</td><td>10438-026</td><td>Suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 y p3000 Invitrogen</td><td></td><td>L3000-015</td><td>Reactivo de transfección a base de lípidos para la transfección de plásmidos; utilizado en 1.1.4 Placas de cultivo de</td></tr><tr><td>tejidos de pocillos múltiples</td><td>Corning</td><td>varios</td><td>para su uso en cultivo celular, transfección/infección e imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon Ti-E</td><td>Microscopio de epifluorescencia invertida Nikon para uso en imágenes de células vivas</td><td></td> NIS Elements HC&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>versión 4.51</td><td>Software de adquisición y análisis de imágenes; utilizado en las secciones 3 y 4</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>31985-070</td><td>Medio sérico reducido para la transfección celular; utilizado en el paso 1.1.3</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>15140-122</td><td>antibiótico utilizado en medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>tampón de fosfatosolución salina roja (PBS)</td><td>Caisson labs</td><td>PBP06-10X1LT</td><td>solución salina estéril para uso con cultivo celular</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Construcción de expresión de envoltura lentiviral VSV-G; utilizado en el paso 1.1.4</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Polímero catiónico utilizado para mejorar la eficacia de la infección viral; utilizado en el paso 1.1.10</td></tr><tr><td>psPAX</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>plásmido de empaquetamiento lentiviral de 2ª generación; utilizado en el paso 1.1.4</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td>Agente de selección de antibióticos; utilizado para seleccionar células que expresan RFP-H2B</td></tr><tr><td>RFP- Histona 2B (H2B)</td><td>Addgene</td><td>varios números</td><td>Vector de expresión para la histona 2B marcada con proteínas fluorescentes rojas; para su uso en la visualización de la cromatina en la obtención de imágenes de células vivas: disponible comercialmente a través de Addgene y otros proveedores</td></tr><tr><td>RNAi Max</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>Reactivo de transfección a base de lípidos para la transfección de construcciones de siRNA</td></tr><tr><td>células RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td>Línea celular epitelial de pigmento de retina humana</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos 100x20mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>353003</td><td>para su uso en el cultivo de células adherentes</td></tr><tr><td>Cámara Zyla sCMOS&nbsp;</td>Cámara <td>Nikon</td><td></td><td>conectada al micrscopio, utilizada para capturar imágenes de células</td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Las imágenes de lapso de tiempo de células vivas son una herramienta importante en la biología celular que proporciona información sobre los procesos celulares que de otro modo podrían ser pasados por alto, malinterpretados o malinterpretados por el análisis de células fijas. Si bien la imagen y el análisis de células fijas son robustos y suficientes para observar el estado estacionario celular, puede ser limitado en la definición de un orden temporal de eventos a nivel celular y está mal equipado para evaluar la naturaleza transitoria de los procesos dinámicos, incluyendo progresión mitotica. Por el contrario, la imagen celular viva es una herramienta elocuente que se puede utilizar para observar procesos celulares a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo y tiene la capacidad de capturar la dinámica de procesos que de otro modo estarían mal representados en las imágenes de células fijas. Aquí describimos un enfoque para generar células que llevan marcadores etiquetados fluorescentesmente de cromatina y microtúbulos y su uso en enfoques de imágenes de células vivas para monitorear la alineación del cromosoma metafásico y la salida mitótica. Describimos técnicas basadas en imágenes para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitológica, incluida la identificación de células en varias etapas de la mitosis, la identificación y el seguimiento de defectos mitoticos, y el análisis de la dinámica del husillo y destino de células mitoticas tras el tratamiento con inhibidores mitoticos.

Evaluación de la progresión mitotica en presencia de perturbaciones del husillo La regulación del enfoque del polo del husillo es un paso esencial en la formación adecuada del husillo bipolar. Interrupción en este proceso a través de agotamiento de proteínas, inhibición de fármacos o alteraciones en el número centrosoma estructura del husillo corrupta y retrasar o detener la progresión mitológica10,11,</su...

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

La imagen de células vivas permite la observación de procesos celulares dinámicos a lo largo del tiempo dentro de una sola célula. Estos enfoques son potentes para evaluar las condiciones que afectan el proceso dinámico de división celular y revelar los impactos que los defectos en la mitosis tienen en la proliferación y viabilidad de las células hijas. La fototoxicidad que resulta de la exposición a la luz durante la toma de imágenes representa un desafío significativo asociado con este protocolo.Por lo tanto, se deben optimizar los tiempos de exposición y el intervalo y la duración de la imagen. Utilizando una técnica aséptica y un gabinete de seguridad de nivel dos de bioseguridad, utilice una pipeta Pasteur de vidrio desechable estéril para aspirar el medio de la placa de cultivo que contiene la línea celular que lleva la construcción de expresión de interés. Lavar brevemente las células con 10 mililitros de PBS estéril con remolinos y tratar las células con dos mililitros de 0.05%trypsin.Después de dos a cinco minutos a 37 grados Celsius, agregue ocho mililitros de medio fresco a la placa para detener la reacción y resuspender las células separadas con pipeteo suave. Transfiera la solución celular a un tubo estéril de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS y centrifugar las células de nuevo.Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio para contar y diluir las células a una de una a dos veces 10 a las 5a células por mililitro de concentración media de cultivo celular. Luego sembra 500 microlitros de células en cada pozo de una placa inferior de imágenes estériles de 12 pozos y coloca la placa en la incubadora de cultivo celular para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa. No más de 30 minutos antes de la toma de imágenes, añadir una concentración relevante de un medicamento mitótico a uno o más de los pozos y añadir un volumen igual del diluyente inhibidor al mismo número de pozos que los controles.Para preparar el microscopio para la toma de imágenes, coloque la placa en el escenario de un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con una cámara de alta resolución, una cámara ambiental precalentada a 37 grados centígrados y un sistema de entrega de dióxido de carbono humidificado al 5%. Seleccione un objetivo de aire 20 veces con una apertura numérica de 0,5 y equipado para la fluorescencia de alto contraste y el contraste de fase, o imágenes de campo brillante y vea las celdas para ajustar el curso y encontrar el enfoque para enfocar las células. Para establecer los tiempos de exposición óptimos para la adquisición de imágenes de campo brillante, GFP y RFP, seleccione los cubos de filtro respectivos con la excitación y emisión adecuadas para los fluoróforos que se crearán imágenes y haga clic en Reproducir.Si la señal no es lo suficientemente intensa, ajuste la exposición automática y, en cada canal de fluoróforo, seleccione el binning adecuado en el menú desplegable Formato. Seleccione y calibrar la etapa del microscopio a la antena multi-pozo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilice el software de adquisición de imágenes para resaltar o seleccionar los pozos que se van a tomar una imagen. Abra el panel de control de puntos generados y, en Zona de trabajo, seleccione Restringido y Borde para restringir el área de selección de coordenadas para excluir los límites del pozo.En el menú desplegable Restricción de área, seleccione Área completa y seleccione una ubicación aleatoria de puntos. Establezca el recuento en seis y haga clic en Aleatorizar para seleccionar el número y la distribución de los puntos que se van a capturar por pozo, respectivamente. A continuación, haga clic e introduzca los valores en el panel de control de secuencia de tiempo para seleccionar e introducir el intervalo de tiempo y la duración de la recopilación de las imágenes.Para visualizar la cromatina etiquetada RFP-H2B, seleccione las imágenes capturadas con el cubo de filtro RFP en su lugar e identifique una célula que entra en la mitosis como se indica en la compactación inicial de cromatina y la descomposición de la envolvente nuclear para determinar el tiempo mitótico de la alineación de la metafase y el inicio de la anafase en las células individuales. Realice un seguimiento de la célula de interés a través de puntos de tiempo consecutivos en la película adquirida para determinar el número de puntos de tiempo o minutos desde la entrada mitótica hasta que la cromatina etiquetada RFP-H2B complete la alineación en el ecuador de celda durante la metafase. Para monitorear el momento mitótico, la fidelidad mitótica y el destino celular, continúe rastreando la célula a través de puntos de tiempo consecutivos para identificar la coordenada de tiempo en la que la segregación cromosómica anáfasis es aparente y/o cuando se ha producido la descomposición de la cromatina y la reforma de la envolvente nuclear.Luego visualice RFP-H2B para identificar las células en cada población que presentan defectos mitóticos, incluyendo cromosomas rezagados y puentes de cromatina durante la segregación cromosómica anafásica. Al visualizar la tubulina-EGFP alfa, se puede observar que las células que experimentan interrupción del husillo experimentan cambios dinámicos a medida que se logra el enfoque de tracción del husillo y se forma un husillo mitótico bipolar en preparación para la división celular. Simultáneamente con el ensamblaje del husillo, el movimiento del cromosoma se puede visualizar con RFP-H2B para evaluar la alineación del cromosoma y la fidelidad de segregación.Utilizando enfoques de imágenes de células vivas, estos resultados representativos muestran que las células con un contenido centroomario normal son capaces de proceder de la descomposición de la envolvente nuclear a través de la alineación de la metafase y el inicio de la anafase para lograr una división bipolar en menos de 30 minutos. En presencia de centroomas adicionales, casi el 50% de las células son capaces de superar un husillo mitótico multipolar transitorio y formar un husillo bipolar en la división celular completa. Las células restantes son incapaces de lograr un husillo bipolar y, como resultado, salen de la mitosis a través de una división multipolar.Independientemente de si se logra la bipolaridad del husillo, las células con centroomas adicionales exhiben una duración significativamente mayor de la mitosis en comparación con las células con dos centroomas. Indicando que la dinámica de la progresión mitótica puede alterarse incluso cuando los cambios en el resultado mitótico no son evidentes. Al definir los tiempos de exposición para los canales fluorescentes, optimice los tiempos de exposición para limitar la fototoxicidad.También se puede seleccionar el binning de píxeles de la cámara para permitir que se utilicen tiempos de exposición más bajos. Este procedimiento tiene aplicaciones en exámenes farmacológicos, invasión y análisis de migración. Estos enfoques también se pueden emplear para examinar la eficacia de los tratamientos farmacológicos o la dinámica de la motilidad celular.

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Investigación

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Biology

Biología

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Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático (Video) | JoVE Journal

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

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