Name: Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende una técnica modificada de preparación de superficie coclear en ratones adultos mediante descalcificación y adhesivo celular para inmunohistoquímica. Este método mejora la visualización del órgano de Corti y facilita el estudio de patologías cocleares y regeneración de células ciliadas.

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El proyecto de investigación descrito fue apoyado por la subvención R01 DC009222 del Instituto Nacional de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo se llevó a cabo en el edificio WR de MUSC en un espacio renovado apoyado por la subvención C06 RR014516. Los animales fueron alojados en instalaciones animales MUSC CRI apoyados por la subvención C06 RR015455 del Programa de Instalaciones de Investigación Extramuros del Centro Nacional de Recursos de Investigación. Los autores agradecen al Dr. Jochen Schacht por sus valiosos comentarios y a Andra Talaska por la corrección del manuscrito.

Todos los protocolos de investigación que involucran ratones CBA/J adultos adultos a las edades de 10-12 semanas y ratones C57BL/6J a las edades de 6-8 semanas fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC). El cuidado de animales estaba bajo la supervisión de la División de Recursos Animales de Laboratorio del MUSC.
NOTA: Para los procedimientos que se presentan a continuación, los ratones se anestesian con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) mediante inyecciones intraperitoneales. Los ratones son decapitados después de que el animal ya no responde a estímulos dolorosos, como un pellizco en el dedo del dedo del sol.
1. Extracción de huesos temporales
<ol><li>Decapitar el ratón inmediatamente postmortem con tijeras quirúrgicas (17 cm de largo) y cortar el hueso del cráneo con tijeras desde el aspecto posterior hacia adelante a lo largo de la línea central del cráneo después de exponer el hueso del cráneo tirando de la piel antes.</li>
	<li>Retire el tejido cerebral usando fórceps y retire manualmente los huesos temporales con el pulgar y el dedo índice para ratones de tres meses de edad o más. Use pequeñas tijeras quirúrgicas (11 cm de largo) para cortar el hueso temporal de ratones de menos de tres meses de edad.</li>
	<li>Coloque el hueso temporal en una placa Petri (30 mm de diámetro) que contenga una solución de paraformaldehído fresco de hielo 4% (PFA) disuelta en solución salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7.4. NOTA: Preparar la solución fresca de PFA 4% y ajustar el pH a 7.4 justo antes de fijar los huesos temporales, porque el equilibrio de pH incorrecto de la solución pfA disminuirá la calidad de la inmunoetiquetado.</li>
</ol>2. Fijación y perfusión
<ol><li>Retire las estapas de la ventana ovalada y perfore la membrana de la ventana redonda con el tamaño #5 fórceps. Bajo un microscopio de disección estéreo hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclear usando una aguja de 27 G conectada a una jeringa de 1 ml.</li>
	<li>Perfumar suavemente y lentamente la cócleara con una solución de PFA al 4% a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave del pequeño agujero en el ápice. Transfiera la cócleara (una o dos coclearas por vial) a viales de centelleo de volumen de 20 ml que contengan 10 ml de solución de PFA al 4%.</li>
	<li>Agitar suavemente los viales de centelleo a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas y dejar pasar la noche en un frigorífico (4oC) en un rotador. NOTA: El tiempo de fijación se puede ajustar dependiendo del anticuerpo utilizado. Por ejemplo, limitar la fijación a 1,5 h permitirá una inmunoetiquetado exitosa de terminales postsinápticos cuando se utilice el anticuerpo GluA 2.</li>
</ol>3. Descalcificación del hueso temporal
<ol><li>Retire la solución de PFA y lave las cocleares con PBS 3x fresco durante 5 min cada una.</li>
	<li>Añadir 20 ml de solución de sal disódica de ácido etilendiaminetetraacético al 4% (PH 7.4) a los viales de centelleo y mantener en nevera durante 48-72 h en un rotador con agitación suave. Cambie la solución de EDTA diariamente hasta que las cocleares estén descalcificadas. Compruebe si las cocleares se descalcifican tocando la porción vestibular ósea con fórceps para evaluar la elasticidad o simplemente cortar una pequeña pieza desde el borde de la porción vestibular. Si tal corte da como resultado una pieza triturada, la cócleara no se descalcifica. NOTA: La solución EDTA puede interferir con la inmunorreacción de los anticuerpos primarios dependiendo de la concentración de la solución. Preparar 4% EDTA en PBS y ajustar el pH a 7.4. Para una descalcificación constante de los huesos temporales, se utiliza una solución EDTA fresca.</li>
	<li>Cambie la solución a PBS para microdisección una vez completada la descalcificación. NOTA: Si las cocleares no están suficientemente descalcificadas, no se puede realizar la disección de las cocleares.</li>
</ol>4. Microdisección del epitelio coclear
NOTA: Una vez completada la descalcificación, es necesario realizar la microdisección del epitelio coclear para el inmunoetiquetado lo antes posible. En una placa Petri limpia de 30 mm que contiene PBS, el oído interno está orientado de la siguiente manera: en referencia a la parte superior (tapa) y la parte inferior de la placa Petri, las ventanas redondas y ovaladas cocleares dan a la parte superior. En referencia al dessector, la porción coclear se orienta hacia el frente (lejos del dessector) y la parte vestibular hacia la parte posterior (cerca de dissector). A continuación se describen los pasos en detalle.
<ol><li>Sostenga la porción vestibular del hueso temporal con fórceps y corte el giro apical con el bisturí en un ángulo de 45o como se indica en la línea roja (Figura 1a).</li>
	<li>Corte verticalmente a lo largo de la línea débil entre la ventana redonda y la ventana ovalada, como se indica en la línea roja (Figura 1b) para separar la cócleara de la porción vestibular(Figura 1c). NOTA: Esta porción coclear contiene las porciones medias, basales y de gancho del epitelio.</li>
	<li>Coloque la porción coclear con el giro basal hacia la parte inferior y el giro central hacia la parte superior de la placa Petri y corte la cápsula ósea y la pared lateral del giro medio hacia el extremo desde el que se eliminó la sección apical, como indica la línea roja (Figu re 1d,e).</li>
	<li>Continúe cortando para separar completamente la parte media de las regiones basales y de gancho(Figura 1f,g). NOTA: La región de gancho de la cócleara es el final del epitelio coclear correspondiente a la sensibilidad a los tonos 48 kHz y superiores en ratones.</li>
	<li>Coloque la porción basal y de gancho con el sitio de la membrana basilar orientado hacia la parte inferior del plato y corte verticalmente el modiolus de la región del gancho para eliminar el modiolus como se indica en la línea roja vertical(Figura 1g). NOTA: El modiolus es el eje central de forma cónica de la cóclear que consiste en hueso esponjoso y nervio coclear, así como el ganglio espiral. Puede ser preferible realizar este corte con tijeras.</li>
	<li>Corte las regiones basales y de gancho como la otra línea roja indica en la Figura 1g para separar la porción del gancho(Figura 1h). NOTA: La cócleara ahora se ha separado en porciones apicales, medias, basales y de gancho. Los siguientes pasos serán la disección final de cada uno de los giros individuales, utilizando el giro medio como ejemplo.</li>
	<li>Corte las porciones relativamente grandes de la cápsula ósea y el tejido de la pared lateral del giro medio como se indica en la línea roja (Figura 1i). NOTA: La pared lateral del conducto coclear está formada por el ligamento espiral y la estría vascular.</li>
	<li>Sostenga la pared lateral con fórceps para alinear la cápsula ósea y la pared lateral con la parte inferior de la placa Petri y corte estos tejidos del lado de la membrana basilar. Luego aplanar la muestra para orientar el lado de la superficie de la célula del cabello sensorial hacia arriba. Recortar el resto de la cápsula ósea y la pared lateral(Figura 1j).</li>
	<li>Retire la membrana tectorial utilizando fórceps para separar completamente la región media(Figura 1k).</li>
	<li>Repita los pasos 4.7 a 4.9 para las secciones finales de los giros o regiones restantes, como se muestra en la Figura 1l.</li>
	<li>Preparar un cubreobjetos redondo de 10 mm para la adhesión del epitelio sensorial. Utilice una pipeta para esparcir a mano 0,5 ml de adhesivo celular y tisular en el centro de la cubierta redonda. Después del secado (3-5 min a RT), poner los labios de las cubiertas en PBS en platos Petri.</li>
	<li>Pegue las cuatro piezas del epitelio sensorial en el cubreobjetos redondo de 10 mm en el plato Petri. A continuación, sostenga un borde de la cubierta para transferirlo a un plato de cuatro pozos para inmunoetiquetado o inmunohistoquímica(Figura 1m). NOTA: La Figura 2 ilustra la ubicación de los principales cortes.</li>
</ol>5. Inmunoetiquetado para las sinapsis cocleares
NOTA: El protocolo de inmunoetiquetado para las sinapsis cocleares seguido en este estudio ha sido descrito previamente13. Las cintas presinápticas fueron etiquetadas con un anticuerpo CtBP2 (proteína de unión anticarboxilo-terminal de ratón 2 IgG1, que etiqueta el dominio B de la proteína de andamiaje RIBEYE). Los terminales postsinápticos fueron etiquetados con anticuerpos GluA2 (receptor antiglutamato de ratón 2 IgG2a, subunidades de etiquetado del receptor AMPA).
<ol><li>Lavar el epitelio sensorial con PBS 3x durante 5 minutos cada lavado en un plato de cuatro pozos y luego añadir 2 ml de surfactante no iónico 2% (es decir, Tritón-X 100) en el plato durante 30 minutos a RT en un rotador.</li>
	<li>Retire la solución tensioactivo no iónica del plato utilizando una pipeta y agregue 100 ml de solución de bloqueo que contenga un 10% de suero de cabra normal a cada pocador durante 1 h en un rotador con agitación suave en RT.</li>
	<li>Retire la solución de bloqueo de cada pocal, lave con PBS 3x durante 5 min cada lavado bajo agitación suave en RT.</li>
	<li>Añadir 100 l de los anticuerpos primarios diluidos con PBS a cada pocal: ratón anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), ratón anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Cubra cada plato de cuatro pozos con su tapa y colóquelo en un recipiente grande humidificado que proteja de la luz. Incubar a 37oC durante 24 h. NOTA: Como opción, se puede añadir antimiosina VIIa de conejo (1:400) para el inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales.</li>
	<li>Lavar 3x con PBS durante 5 min cada lavado con agitación suave a RT.</li>
	<li>Añadir 100 l de los anticuerpos secundarios Alexa 594 cabra anti-ratón IgG1a (1:1,000), Alexa 488 cabra anti-ratón IgG2a (1:1,000) diluido con PBS a cada pocto. Cubra cada plato de cuatro pozos con su tapa y colóquelo en un recipiente grande humidificado que proteja de la luz. Incubar a 37oC durante 2 h. NOTA: Si se utiliza miosina VIIa, añadir Alexa 350 cabra anticonejo (1:200).</li>
	<li>Lavar 3x con PBS durante 5 min. A continuación, transfiera el cubreobjetos redondo de 10 mm a una diapositiva con las muestras en la parte superior.</li>
	<li>Agregue con cuidado 8 ml de Fluoro-Gel con tampón Tris en el centro de la cubierta. A continuación, sostenga el borde de otro cubreobjetos redondo de 10 mm con fórceps para montar en la parte superior, emparejiendo los dos cubreobjetos juntos.</li>
	<li>Use esmalte de uñas para sellar las diapositivas, colóquelas en una carpeta de diapositivas de cartón y guárdelas en el refrigerador. NOTA: Si se filtra un poco de Fluoro-Gel entre los labios de las cubiertas durante el montaje, limpie los bordes de los labios de las cubiertas antes de sellar el portaobjetos con esmalte de uñas. Las imágenes confocales deben tomarse en un plazo de 7 días.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La microdisección coclear de preparaciones de superficie de montaje completo en combinación con el inmunoetiquetado proporciona una herramienta básica para la investigación de patologías del oído interno y mecanismos moleculares. Este método de disección coclear de ratón adulto modificado utilizando el adhesivo celular y tisular simplifica este difícil procedimiento.
Aunque este método de preparación de superficie coclear modificado es relativamente fácil y accesible, todavía requiere práctica...

La cócleara se dedica a la detección de sonido y responsable de la audición. El conducto coclear se enrolla en forma de espiral en el laberinto óseo y sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). El OC descansa sobre la membrana basilar, que compone el epitelio coclear, con una longitud de unos 5,7 mm cuando se desenrolla en ratones ADULTOs CBA/CaJ1,2. Debido a que el OC está organizado tonotópicamente con altas frecuencias detectadas en la base y frecuencias bajas en el ápice, el epitelio coclear a menudo se divide en tres partes para comparaciones analíticas: los giros apicales, medios y basales correspondientes a bajos, detección de frecuencia media y alta, respectivamente. Además de una serie de células de apoyo, la OC se compone de una fila de células pilosas internas (IHC) ubicadas medialmente y tres filas de células del cabello exteriores (OHC) ubicadas lateralmente con respecto a la espiral coclear.
El procesamiento auditivo correcto depende de la integridad de las células pilosas sensoriales en la cócleara. El daño o la pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de la pérdida auditiva adquirida, causada por numerosas etiologías como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el envejecimiento proceso3. Además, la integridad y la función de las sinapsis de la célula capilar interna/nervio auditivo pueden verse afectadas por leves insultos4. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la manipulación de genes por técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la ciencia auditiva. Aunque la cócleara de ratón adulta es minúscula y el epitelio coclear está rodeado por una cápsula ósea que resulta en microdisecciones técnicamente difíciles, preparaciones superficiales del epitelio en combinación con inmunoetiquetado o inmunohistoquímica y las imágenes confocales se han utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas sensoriales y células de apoyo, y la regeneración de células pilosas. También se han utilizado preparaciones de superficie coclear para determinar el patrón de expresión de los genes reporteros (es decir, GFP) y confirmar la transducción exitosa e identificar tipos de células transducidas. Estas técnicas se han utilizado previamente para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la pérdida auditiva inducida por ruido utilizando ratones CBA/J adultos5,6,7,8,9.
A diferencia de la inmunohistoquímica usando secciones de parafina o criosecciones para obtener pequeñas porciones transversales de la cócleara que contienen tres células del cabello exteriores (OHC) y una célula del cabello interno (IHC) en cada sección, las preparaciones de la superficie coclear permiten visualización de toda la longitud del OC para el recuento de células pilosas sensoriales y sinapsis de cinta e inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales correspondientes a frecuencias funcionales específicas. La Tabla 1 muestra el mapeo de frecuencias auditivas en función de la distancia a lo largo de la longitud de la espiral coclear en el ratón adulto CBA/J según estudios de Muller1 y Viberg y Canlon1,2. Preparaciones de superficie coclear han sido ampliamente utilizados para la investigación de patologías cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. El método de disección coclear de montaje completo fue descrito originalmente en un libro editado por Hans Engstrom en 196616. Esta técnica fue posteriormente refinada y adaptada a una variedad de especies como se describe en la literatura por un número de científicos en ciencias auditivas10,11,12,13, 15,17 y por los Laboratorios Eaton-Peabody en Massachusetts Eye and Ear18. Recientemente, Montgomery et al.19informó otro método de disección coclear. La microdisección de la cócleara es un paso esencial y crítico para las preparaciones de superficie coclear. Sin embargo, la diseción de las cocleares de ratón es un desafío técnico y requiere una práctica considerable. Aquí, se presenta un método de preparación de superficie coclear modificado para su uso en cócleares de ratón adultos. Este método requiere la descalcificación y el uso de adhesivo celular y tisular (es decir, Cell-Tak) para adherir las piezas de epitelio coclear a 10 mm de cubres redondos para inmunoetiquetado. Adhesivo celular y tisular ha sido ampliamente utilizado para la inmunohistoquímica20. Este método de microdisección coclear modificado es relativamente simple en comparación con los reportados anteriormente18,19.

<table><tbody><tr><td>10 mm Rund Coverslips</td><td>Productos de microscopía para la ciencia y la industria</td><td>260367</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra Anti-ratón IgG2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Cabra Anti-ratón IgG1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21125</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Carboard Micro Slide Bandejas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sal disódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Gel fluorado con tampón Tris</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de cuatro pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-miosina VIIa de cabra</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CtBP2</td><td>de ratón BD Biosciences</td><td>#612044</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Glu2R de ratón</td><td>Millipore</td><td>MAB397</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>VWR</td><td>100491-038</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de resorte Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>15001-08</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

El procesamiento auditivo en la cócleara depende de la integridad de las células pilosas mecanosensoriales. A lo largo de toda la vida, la pérdida auditiva se puede obtener de numerosas etiologías, como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el proceso de envejecimiento. La pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de las variedades de pérdida auditiva adquirida. Además, la sinapsis de la célula del cabello interno puede ser dañada por leves insultos. Por lo tanto, las preparaciones superficiales de la epitelía coclear, en combinación con técnicas de inmunoetiquetado e imágenes confocales, son una herramienta muy útil para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas sensoriales, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas y células de apoyo, regeneración de células pilosas y determinación de la expresión génica del informe (es decir, GFP) para la verificación de la transducción exitosa y la identificación de tipos de células transducidas. La cócleara, una estructura ósea en forma de espiral en el oído interno, sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). Las células pilosas sensoriales y las células de soporte circundantes en la OC están contenidas en el conducto coclear y descansan sobre la membrana basilar, organizadas de manera tonotópica con detección de alta frecuencia que se produce en la base y baja frecuencia en el ápice. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la capacidad de manipular genes mediante técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la investigación biológica, incluso en la ciencia auditiva. Sin embargo, la cócleara de ratón adulta es minúscula, y el epitelio coclear está encapsulado en un laberinto óseo, lo que dificulta la microdisección. Aunque las técnicas de disección se han desarrollado y utilizado en muchos laboratorios, este método de microdisección modificada utilizando adhesivo celular y tisular es más fácil y más conveniente. Se puede utilizar en todo tipo de cocleares de ratón adultos después de la descalcificación.

Las preparaciones superficiales del epitelio coclear, en combinación con el inmunoetiquetado y la imagen confocal, se han utilizado ampliamente en la audición para la investigación de patologías cocleares, como la cuantificación de sinapsis de cinta, células pilosas sensoriales, y expresión proteica en células pilosas sensoriales5,6,7,8. Aunque la disección de cócleares de ratón adultos para pr...

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Las preparaciones de superficies cocleares permiten la visualización de toda la lente del órgano de Corti utilizando inmunohistoquímica e imágenes confocales. Se ha utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares específicas de interés. Modificaremos el método de microdisección coclear.La principal ventaja de esta técnica es la adherencia de un pedazo de epitelio coclear a los cubreobjetos redondos de 10 milímetros para el procedimiento de inmunoetiquetado evitando la pérdida de tejido durante los múltiples pasos de lavado. Además de patologías cocleares, la preparación de la superficie coclear también se puede utilizar para la expresión de evaluación y la regeneración de células pilosas. Se requieren habilidades básicas de microscopio para esta técnica y la demostración visual del método puede ayudar a garantizar que cada paso se realiza correctamente.Demostrando el procedimiento estará Qiaojun Fang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para la extracción ósea temporal, inmediatamente post-mortem tirar de la piel antes para exponer el hueso del cráneo y utilizar tijeras para cortar el hueso desde el aspecto posterior hacia adelante a lo largo de la línea central del cráneo. Usa fórceps para extirpar el tejido cerebral antes de usar el pulgar y el dedo índice para extraer manualmente los huesos temporales de ratones de tres meses de edad o más.Coloque los huesos en un plato Petri de 30 milímetros de diámetro que contenga hielo fresco 4%PFA y PBS bajo un microscopio de disección y retire las estapas de la ventana ovalada. Perfore la membrana de la ventana redonda con el número cinco fórceps y utilice una aguja de calibre 27 unida a una jeringa de un mililitro que contenga 4%PFA fresco para hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclea. Perfume suavemente y lentamente la cóclea con una solución fijadora a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave fuera del pequeño orificio en el ápice.A continuación, transfiera hasta dos cócleas perfundidas en viales individuales de centelleo de 20 mililitros que contengan 10 mililitros de 4%PFA por vial y agitar suavemente las muestras durante dos horas a temperatura ambiente, seguido de un almacenamiento nocturno a cuatro grados Celsius en un rotador. A la mañana siguiente, lave la cóclea con tres lavados de cinco minutos con PBS fresco por lavado. Después del último lavado, añadir 20 mililitros de 4%EDTA a cada vial y rotar las muestras durante 48 horas a cuatro grados Centígrados con agitación suave.Al final de la incubación, toque la porción vestibular ósea de cada cóclea con fórceps para evaluar la elasticidad de las muestras. Si los huesos son elásticos en lugar de firmes, la cóclea se ha descalcificado. Sustituya el EDTA para cada muestra por PBS fresco.Para la microdisección del epitelio coclear, agarre la porción vestibular del hueso temporal con fórceps y use un bisturí para cortar el giro apical en un ángulo de 45 grados. Corte verticalmente a lo largo de la línea débil entre la ventana redonda y la ventana ovalada para separar la cóclea de la parte vestibular y orientar la porción coclear con el giro basal hacia la parte inferior y media gira hacia la parte superior de la placa Petri. Desde esta posición, corte la cápsula ósea y la pared lateral del giro medio hacia el extremo del cual se quitó la sección apical y continúe cortando para separar completamente la parte media de las regiones basales y de gancho.Colocación de la porción basal y de gancho con el sitio de membrana basilar orientado hacia la parte inferior de la placa, corte verticalmente los medialis de la región de gancho para eliminar los medialis y corte las regiones basales y de gancho para separar la porción del gancho. Para evitar la distorsión del tejido, corte los medialis de la región de gancho antes de separar la región basal de giro y gancho. Cortar las porciones relativamente grandes de la cápsula ósea y el tejido de pared lateral de la vuelta media y sosteniendo la pared lateral con fórceps para alinear la cápsula ósea y la pared lateral con la parte inferior de la placa Petri, cortar estos tejidos del lado de la membrana basilar.A continuación, aplanar la muestra para orientar la superficie de la célula del cabello sensorial hacia arriba y recortar el resto de la cápsula ósea y la pared lateral. A continuación, utilice fórceps para eliminar la membrana tectorial para separar completamente la región media y eliminar la cápsula ósea, el tejido de pared lateral y las regiones tectoriales de los giros restantes como se acaba de demostrar. Cuando todos los giros cocleares hayan sido diseccionados, esparza 0,5 microlitros de adhesivo celular y tisular en el centro de un cubreobjetos redondo de 10 milímetros y deja que el adhesivo se seque durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente.Coloque los cubreobjetos secos en la placa de Petri y pegue las cuatro piezas de cada muestra de epitelio sensorial en un cubreobjetos. A continuación, utilice fórceps para agarrar un borde de cada cubreobjetos para transferir los especímenes a pozos individuales de un plato de cultivo celular de cuatro pocús para el etiquetado inmunológico. Para el inmunoetiquetado de preparaciones de sinapsis coclear superficial, lave cada epitelio sensorial tres veces durante cinco minutos en PBS fresco por lavado, seguido del tratamiento de cada muestra con dos mililitros de 2% de tensioactivo no iónico durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador.Al final de la incubación, aspirar la solución surfactante de cada pocadura y bloquear cualquier unión no específica con 100 microlitros de solución de bloqueo por pozo durante una hora en el rotador con agitación suave a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, lave las muestras tres veces con PBS como se demuestra bajo agitación suave antes de etiquetar cada epitelio con 100 microlitros de los anticuerpos primarios de interés durante 24 horas a 37 grados Celsius protegidos de la luz. Al día siguiente, lave las muestras tres veces con PBS fresco y agitación suave por lavado y etiquete las muestras con 100 microlitros de los anticuerpos secundarios de interés apropiados durante dos horas a 37 grados Centígrados protegidos de la luz.Al final de la incubación, lave las muestras con tres lavados de cinco minutos en PBS fresco por lavado antes de colocar cada tapa en diapositivas individuales del microscopio de vidrio con las muestras hacia arriba. A continuación, agregue cuidadosamente ocho microlitros de un medio de montaje adecuado en el centro de cada cubreobjetos y utilice fórceps para montar otro cubreobjetos de 10 milímetros en cada muestra. A continuación, selle los lados de cada sándwich de cubreobjetos con esmalte de uñas transparente, coloque las muestras en una carpeta de diapositivas de cartón y guarde las diapositivas a cuatro grados centígrados.Aunque la disección de cócleo de ratón adulto para preparaciones superficiales no es simple, los investigadores nuevos en la técnica deben ser capaces de aprender el método después de practicar con 10 a 15 orejas. El inmunoetiquetado de las preparaciones superficiales de ratones CBAJ de 10 a 12 semanas de edad sin tratar con CTBP2 y GluA2 demuestra que tanto las cintas presinápticas como los terminales postsinápticos se encuentran respectivamente debajo de los núcleos de células capilares internas y se yuxtaponen indicando sinapsis funcionales. El inmunoetiquetado para la miosina 7A y la contramancha con falhalloidina y DAPI revela la presencia de células pilosas sensoriales, incluidas las células externas del cabello y las células internas del cabello y sus núcleos.El inmunoetiquetado para la miosina 7A y la contramancha con falhalloidina no muestra diferencias en inmunoreactividad o uniformidad con o sin el uso de adhesivo celular y tisular. Además, la microscopía electrónica de barrido de preparaciones superficiales de ratones C57 negros 6 de seis a ocho semanas de edad demuestran una estereocilia en forma de V bien organizada de células del cabello exteriores en tres filas de la muestra. Recuerde llenar el coclear con solución fijadora suavemente y lentamente a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave fuera del pequeño agujero en el ápice.Antes de separar la región de gancho del giro basal, tenga cuidado de cortar los medialis de la región de gancho para facilitar la eliminación de los medialis.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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