Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado
14 de octubre de 2019
Los tumores neuroendocrinos (NET) se originan a partir de células neuroendocrinas de la cresta neural. Son de crecimiento lento y desafiantes para la cultura. Presentamos una estrategia alternativa para cultivar NETs desde el intestino delgado cultándolos como esferoides. Estos esferoides tienen marcadores de red intestinal pequeña y se pueden utilizar para pruebas de drogas.
Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y difíciles de propagar. Las pocas líneas celulares establecidas no están fácilmente disponibles para los investigadores. Para superar estas limitaciones, desarrollamos este protocolo de cultura 3D.
La ventaja de esta técnica sobre el método tradicional de establecer una línea celular SBNET es que se pueden obtener cultivos 3D y se pueden realizar pruebas de drogas en tres semanas. Este método se puede aplicar a otros tumores neuroendocrinos como tumores neuroendocrinos del páncreas. Después de obtener una muestra SBNET de paciente resegurado, córtela en cubos de cinco milímetros y guárdela en 25 mililitros de DMEM F12 medio en un tubo cónico para el transporte.
Incubar los tumores en medio de lavado preparado según las instrucciones del manuscrito durante 15 minutos. Luego transfiéralos a un nuevo plato y picarlos a menos de un milímetro usando tijeras curvas estériles. Transfiera los tejidos picados a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medio de lavado, luego centrifugar la muestra a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets en 10 mililitros de medio de lavado con colagenasa y DNase. Permita que los tumores picados digieren a 37 grados Celsius con temblor lento durante 90 minutos. Es importante no digerir en exceso las muestras del tumor.
Demasiada enzima o tiempo de incubación más largo matará a las células SBNET. Una vez finalizada la digestión, centrifuga el tubo a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 15 mililitros de medio de lavado.
Coloque un colador celular de 70 micrómetros encima de un nuevo tubo de 50 mililitros y transfiera 10 mililitros del tampón de lavado a través del colador. Gire el tampón de lavado dentro del tubo para evitar que las células se peguen a los lados. A continuación, filtre la suspensión celular a través del colador.
Centrifugar las células a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 microlitros de medio de lavado. Coloque el tubo sobre hielo y utilice cinco microlitros de las células para el recuento celular con un hemocitoómetro.
Calcular el número de células, luego repetir la centrifugación para eliminar el sobrenadante y resuspender las células en ECM líquido a una concentración de un millón de células por mililitro. A continuación, transfiera de cinco a 20 microlitros de esferoides SBNET en ECM a una placa de 96 pozos y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius para permitir que el ECM líquido se solidifique. Añadir 200 microlitros de medio de cultivo SBNET a cada bien que contenga esferoides o cultivo de los organoides en los medios de células madre como se describió anteriormente.
Utilice una pipeta P1000 para transferir los organoides a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugar el tubo a 1.500 veces g durante un minuto para extraer el sobrenadante. Lave el cultivo con un mililitro de PBS y centrífuga de nuevo para eliminar el sobrenadante. A continuación, fije los organoides añadiendo 500 microlitros de paraformaldehído e incubando durante 15 minutos.
Después de la incubación, lave el cultivo dos veces con un mililitro de PBS. Añadir 500 microlitros de PBS con 3%BSA y 0.1%Triton X-100 para permeabilizar el cultivo. Incubar el tubo durante cinco minutos, luego lavar los organoides tres veces con un mililitro de PBS y 3%BSA.
A continuación, incubar el cultivo con anticuerpos primarios durante una hora y luego repetir los lavados con PBS y BSA. Incubar con los anticuerpos secundarios y repetir los lavados asegurándose de aspirar y desechar todo sobrenadante. Para tomar una imagen de los esferoides, agregue cinco microlitros de medio de montaje que contengan DAPI y utilice una pipeta P20 para transferir cinco microlitros de los esferoides a un portaobjetos de vidrio.
Selle la diapositiva con un cubreobjetos y una imagen con un microscopio de fluorescencia utilizando los objetivos 10, 20 y 40X. Romper mecánicamente el ECM con una pipeta P1000 y transferirlo a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 1.000 g a cuatro grados centígrados.
A continuación, retire todo el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo. Añadir de dos a cuatro veces el volumen del nuevo ECM al pellet y mezclar el contenido del tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces asegurándose de evitar la introducción de burbujas de aire. Transfiera de cinco a 20 microlitros de la mezcla ECM y SBNET a una nueva placa de 96 pozos y permita que el ECM se solidifique.
A continuación, cubra el ECM solidificado con el nuevo medio SBNET y coloque la placa en la incubadora. Si envía esferoides SBNET a otro laboratorio, transfiera los esferoides con el nuevo ECM a un matraz T25 y permita que el ECM se solidifique. Llene el matraz con el medio esferoide SBNET, atornille bien la tapa y prepare el paquete de envío.
Al recibir el cultivo de esferoides, retire el medio de cultivo y repita los pasos anteriores para volver a poner los esferoides en el cultivo. La tasa de crecimiento del esferoide SBNET fue monitoreada con imágenes microscópicas. Los esferoides SBNET tardan aproximadamente 14 días en duplicarse en tamaño cuando los medios de referencia cultural se cambian una vez a la semana.
Después de 14 días en la cultura, los esferoides SBNET no aumentan de tamaño. Los esferoides se tiñeron con anticuerpos específicos contra la sinaptofisina, la cromogranina A y el SSTR2 y se fueron imageinados con microscopía de inmunofluorescencia. Los datos mostraron que estos marcadores están localizados en el citoplasma y en la membrana de las células SBNET.
Para garantizar la especificidad de los anticuerpos, se realizaron los mismos procedimientos de tinción en una línea organoides a partir de un tumor de páncreas que no expresa sinaptofisina, cromogranina A y SSTR2 y no se detectó ninguna señal verde. La principal ventaja de las imágenes de inmunofluorescencia es que se puede realizar en cuatro horas y dar información de tinción similar a la inmunohistoquímica. Culturing SBNET as spheroids es una técnica valiosa para identificar fármacos que pueden inhibir el crecimiento de SBNET.
Los esferoides fueron tratados con rapamicina e inhibidor de mTOR. Después de cinco días, el esferoide tratado con rapamicina formó una estructura similar a la uva y se volvió apoptótico o necrótico. Al intentar este procedimiento, es importante pre-mojar el colador celular y el tubo de recolección con medio de lavado.
Esto evitará que las células SBNET se peguen al colador celular y al tubo de plástico. Con este protocolo, los científicos y clínicos pueden establecer cultivos esferoides SBNET a partir de tumores resecados, compartirlos con otros laboratorios y usarlos para probar medicamentos aprobados por la FDA.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio presenta un nuevo protocolo de cultivo tridimensional para el crecimiento de tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNETs) bien diferenciados a partir de muestras de pacientes. Este método permite realizar pruebas de fármacos en tres semanas, superando las limitaciones del establecimiento tradicional de líneas celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Tumores neuroendocrinos
- Técnicas de cultivo celular
- Metodologías de pruebas farmacológicas
Antecedentes
- Los tumores neuroendocrinos (NETs) se originan a partir de células neuroendocrinas.
- Los SBNETs crecen lentamente y son difíciles de cultivar.
- Las líneas celulares establecidas son escasas y no están ampliamente disponibles.
- Las técnicas de cultivo en 3D pueden mejorar la propagación y las pruebas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para el cultivo de SBNETs.
- Facilitar la prueba de fármacos en NETs cultivadas.
- Proporcionar un protocolo aplicable a otros tipos de tumores neuroendocrinos.
Métodos Utilizados
- Las muestras de SBNET resecadas de pacientes se cortaron en cubos de cinco milímetros.
- Las muestras se almacenaron en medio DMEM F12 para su transporte.
- Se implementó un protocolo de cultivo 3D para el crecimiento celular.
- Las pruebas con fármacos se realizaron dentro de las tres semanas posteriores al cultivo.
Resultados principales
- Los cultivos 3D exhibieron marcadores de NET del intestino delgado.
- Se realizó con éxito la prueba de fármacos en esferoides cultivados.
- El método mostró potencial para su aplicación en NET pancreáticos.
- Los resultados indican una alternativa más rápida para el establecimiento tradicional de líneas celulares.
Conclusiones
- El método de cultivo 3D es efectivo para la propagación de SBNET.
- Este enfoque puede acelerar los plazos de las pruebas de fármacos.
- Investigaciones futuras podrían ampliar su aplicación a otros NET.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de modelos preclínicos confiables para cánceres raros como los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNETs) sigue siendo un cuello de botella importante en el desarrollo de fármacos oncológicos debido a la disponibilidad limitada de líneas celulares derivadas de pacientes y a tasas de proliferación lentas. Este método de cultivo en esferoides tridimensionales permite la generación rápida de modelos de SBNET fisiológicamente relevantes a partir de tumores resecados, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas y la validación de dianas dentro de un plazo de tres semanas. Al mantener la expresión de marcadores neuroendocrinos y las características de respuesta a fármacos, este enfoque mejora la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento y apoya la priorización de carteras para terapias dirigidas a tumores neuroendocrinos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante esferoides de SBNET derivados de pacientes que conservan la expresión de marcadores neuroendocrinos (sinaptofisina, cromogranina A, SSTR2).
- Valor operativo: Proporciona un sistema de cultivo 3D reproducible para la validación funcional de dianas, sin los plazos prolongados necesarios para el establecimiento tradicional de líneas celulares.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico al mantener condiciones similares al microambiente tumoral mediante la encapsulación en matriz extracelular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayos: Genera esferoides SBNET estandarizados adecuados para cribado de compuestos, con la posibilidad de realizar pruebas farmacológicas dentro de las tres semanas posteriores al inicio del cultivo.
- Resultados cuantitativos: Permite medir respuestas citotóxicas mediante cambios estructurales (por ejemplo, morfología tipo racimo) y marcadores de apoptosis/necrosis tras el tratamiento con agentes como la rapamicina.
- Escalabilidad y reutilización: Los esferoides pueden criopreservarse, enviarse en matriz extracelular (ECM) y reestablecerse en laboratorios receptores, lo que posibilita la estandarización de ensayos entre diferentes laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Mantiene los biomarcadores clave de SBNET en cultivo de esferoides, apoyando la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite la evaluación de inhibidores de la vía mTOR en un modelo 3D de NET clínicamente relevante antes de los estudios in vivo.
- Avance ajustado al riesgo: Facilita decisiones tempranas de avance o interrupción basadas en los perfiles de respuesta a fármacos en esferoides, reduciendo el riesgo de fracaso en etapas avanzadas.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento al proporcionar un modelo preclínico rápido para la validación de dianas y la identificación de compuestos iniciales, conectando la biología temprana con el cribado mecanicista antes de la validación in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis y la aclaración de vías mediante esferoides de SBNET derivados de pacientes que reflejan la biología tumoral nativa.
- Tamizaje: Permite la producción de esferoides listos para ensayos para evaluar bibliotecas de compuestos con lecturas cuantificables de citotoxicidad.
- Análisis: Genera datos de inmunofluorescencia y morfológicos para evaluar la interacción con el blanco y las respuestas fenotípicas.
- Investigación Traducional: Conserva el fenotipo neuroendocrino, permitiendo estudios alineados con biomarcadores desde esferoides hasta modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de esferoides de SBNET compartible y reproducible, aplicable entre equipos de descubrimiento y colaboradores externos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación de dianas al preservar la identidad neuroendocrina y la respuesta a fármacos en un modelo tridimensional derivado de pacientes.
- Valor operativo: Proporciona cultivos estandarizados y escalables de esferoides con cinética de crecimiento definida (duplicación en aproximadamente 14 días) y compatibilidad con protocolos de inmunofluorescencia.
- Valor estratégico: Acelera los plazos preclínicos, permitiendo una desviación mecanicista más rápida y una mayor eficiencia del capital en el descubrimiento de fármacos para cánceres raros.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos a tumores neuroendocrinos mediante cribado fenotípico temprano en un modelo clínicamente relevante.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el procesamiento estéril de tejidos, digestión enzimática y manipulación de matrices extracelulares tridimensionales.
- Depende del acceso a centrifugación, filtración celular, microscopía de fluorescencia y incubadores estándar de cultivo celular.
- Necesita la preparación estandarizada de medio de lavado y de matriz extracelular entre diferentes centros para garantizar la integridad de los esferoides y la retención de marcadores.
- Requiere la optimización de paneles de anticuerpos y condiciones de permeabilización para lograr una detección consistente mediante inmunofluorescencia de marcadores de SBNET.
- Está limitado por la disponibilidad de tejido SBNET resecado fresco y la necesidad de evitar la sobredigestión durante el tratamiento con colagenasa/DNasa.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Small Bowel Neuroendocrine Tumor (SBNET) Collection and Cell Dissociation
2:10
Culture of SBNET as Tumor Spheroids in ECM
4:02
Characterization of SBNET Spheroids by Immunofluorescence
5:50
Splitting SBNET Spheroids
7:23
Results: Immunofluorescence Imaging and Drug Testing of SBNET Spheroids
9:02
Conclusion
