Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Hemos desarrollado un método de montaje para la toma de imágenes de lapso de tiempo que permite el crecimiento sin restricciones de embriones frágiles de peces cebra y al mismo tiempo los mantiene en una posición completamente fija. Este método de montaje es rápido, fácil y barato y funciona para imágenes de laboratorio en cualquier microscopio invertido. Desarrollamos este método para la toma de imágenes de embriones vivos de peces cebra, pero podría ser modificado para la toma de imágenes de otros pequeños modelos de animales acuáticos.

Comience por la cría del pez cebra adulto. Por la tarde, coloque los peces en tanques de cría en una proporción de hombre a mujer de uno a dos. A continuación, prepare una solución de stock de 1% de agarosa fundible baja en medios embrionarios y disuelva calentándola en un horno microondas.

Aliquot la solución de agarosa en tubos de 1,5 mililitros. Hacer una solución de stock de 4%tricaína en agua destilada y almacenar la agarosa y tricaína a cuatro grados centígrados. La tricaína es tóxica y tiene que ser pesada y preparada en una campana de humo.

Después del apareamiento, cosecha los embriones de pez cebra en E3 en un plato de Petri e incubarlos a 26,5 grados centígrados durante unas 28 horas antes del montaje. Anesthetizar los embriones con 0.02%tricaína y descorionarlos bajo un microscopio agarrándolos suavemente y separando la tarea para liberar el embrión. Justo antes del montaje, calentar la solución de agarosa a 65 grados Celsius y luego dejar enfriar a aproximadamente 30 grados Celsius para que el embrión no se dañe por el calor y añadir tricaína a la solución de agarosa.

Utilice platos de fondo de cristal de 35 milímetros con un fondo de cubierta cero número. Coloque suavemente un embrión descorionado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato con una pipeta de vidrio o una micropipeta, luego retire cuidadosamente cualquier E3 restante con una micropipeta. Añadir la primera solución de agarosa a la pequeña bien creada por el vaso de cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión asegurándose de que la agarosa cubre el pozo pequeño, pero no lo desborda.

Cubra el pozo pequeño con un cubrecubos para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre las dos cubiertas. Coloque una capa de 1% de solución de agarosa en la parte superior del vidrio de la cubierta por toda la parte inferior del plato que mantendrá el vaso en su lugar a medida que se solidifica. A continuación, llene la porción restante del plato con E3 que contenga 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado.

Para identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno, monte los embriones en concentraciones crecientes de agarosa y realice imágenes de lapso de tiempo para identificar la concentración que minimiza la distorsión embrionaria y la motilidad, luego pruebe un rango más fino de concentraciones basadas en los resultados. El paso más crítico de este protocolo es identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno. Probar diferentes nano concentraciones de agarosa como 0.030%0.032%etc.

para encontrar la concentración óptima. Para realizar imágenes de lapso de tiempo de los embriones, utilice una etapa de microscopio con una incubadora establecida en 28,5 grados centígrados y una imagen de hasta 55 horas. Para tomar imágenes simultáneas de varios embriones, utilice un adaptador de etapa que sostenga varios platos y gire los platos uno por uno para que los embriones se coloquen horizontalmente.

Seleccione un objetivo de bajo aumento, luego localice los embriones usando el ocular y finalmente alinee horizontalmente girando los platos. Registre la ubicación de los embriones en el software y cree un nombre de archivo para guardar automáticamente los datos. Establezca el tamaño del agujero, la velocidad de escaneo, el tamaño de la imagen y el zoom.

A continuación, seleccione un aumento más alto para capturar imágenes y los canales de fluorescencia que se van a tomar imágenes. Para cada canal, ajuste la potencia del láser y el detector de alto voltaje asegurándose de recoger el mejor rango dinámico posible evitando la saturación y limitando el blanqueo fotográfico. A continuación, para crear imágenes de todo el embrión con un objetivo 10X, establezca los ajustes de captura de imágenes grandes en el software para crear una imagen de varios campos de visión y unirlos ajustando la posición del embrión para asegurarse de que se ajuste dentro de esta gran área de imagen.

Configure los ajustes para capturar pilas Z de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Con el fin de mantener el enfoque de múltiples embriones durante la toma de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice un enfoque automatizado y ajuste los niveles de desplazamiento individuales para que cada embrión se enfoque en el plano de referencia. A continuación, configure los parámetros de lapso de tiempo en el software del microscopio para crear una imagen durante una duración de 55 horas a intervalos de una hora.

En cada ciclo, capture dos conjuntos de datos embrionarios secuencialmente y guarde los datos automáticamente. Utilice el software del microscopio para procesar las imágenes. Si se ha creado una imagen de más de un embrión, cree archivos independientes para cada embrión dividiendo los conjuntos de datos en función de la ubicación de la imagen.

Convierta los datasets de tiempo 3D en datasets de tiempo 2D utilizando proyecciones de intensidad máxima o una herramienta similar. Por último, cree archivos de película guardando como AVI y seleccionando la opción sin compresión con intervalos de 200 milisegundos para una velocidad de reproducción de cinco fotogramas por segundo. Este método de montaje en capas permite crear imágenes de embriones de pez cebra, al tiempo que les permite crecer pero al mismo tiempo restringir su movimiento.

Si la concentración de agarosa es demasiado alta, los embriones se distorsionan. Pero si es demasiado bajo, se moverán fuera del campo de visión durante la microscopía de lapso de tiempo. Se encontró que la concentración óptima de agarosa estaba entre 0,028 y 0,034% pece cebra transgénica viva que expresaba RFP en todo el embrión y la GFP en las células endoteliales de la vasculatura durante 55 horas durante las cuales el recipiente intersecumental brotó, se desarrolló la vastura subintestinal y de la cabeza, y se produjo condensación de venas caudales con extensión de tronco.

Los embriones que expresaban GFP y las neuronas motoras fueron imágenes para visualizar el desarrollo de las neuronas motoras. Los axones de neurona motora brotan del tubo neural ventral sobre las somitas hacia el lado ventral del embrión. El co-desarrollo de la brotación dorsal de los axones de neuronas motoras en relación con la posición de los vasos intersegmentales se hizo una imagen utilizando un aumento más alto.

Esto hizo posible visualizar los detalles más finos de la brotación de axón ventral, así como el axón dorsal que brota del tubo neural. A medida que aumentaba el número de somitas, las somites también se extienden en longitud y anchura. Este proceso se hizo con imágenes utilizando embriones transgénicos que expresan la GFP en los músculos.

Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, es muy sensible a pequeñas variaciones en las mediciones al preparar la solución de agarosa y necesita ser redefinida para cada nuevo lote de solución de agarosa. Es importante establecer cuidadosamente los parámetros de imagen, incluyendo el tamaño y la resolución de la imagen, la velocidad de escaneo, el zoom, el detector de alto voltaje y la potencia del láser para garantizar la consistencia entre los experimentos y también para reducir la posibilidad de toxicidad fotográfica y blanqueo fotográfico durante imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Utilizando este método de montaje para embriones de pez cebra transgénicos seguido de imágenes de lapso de tiempo extendidas de todo el organismo, podemos visualizar cómo se desarrollan juntos diferentes tejidos.