Name: Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende un método de montaje en capas para microscopía confocal de lapso de tiempo en embriones de Danio rerio. Esta técnica permite el crecimiento sin restricciones manteniendo los embriones fijos para obtener imágenes de alta calidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Albert Pan y Arndt Sieakmann por los regalos de pescado transgénico. Agradecemos a Koichi Kawakami en el Instituto Nacional de Genética, el Proyecto Nacional de Biorecursos del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón por el regalo del pez cebra transgénico HGn39b. También agradecemos a Fatima Merchant y Kathleen Gajewski por su ayuda en microscopía confocal, y a Tracey Theriault por fotografías.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Institutos Nacionales de Salud (número de subvención P30ES023512 y número de contrato HHSN273201500010C). SU fue apoyada por una beca del programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) y por Hugh Roy y Lillie Endowment Fund. La Fundación Robert A. Welch (E-0004) contó con el apoyo de j-o G.

El trabajo animal presentado aquí fue aprobado por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUCs) de la Universidad de Houston y la Universidad de Indiana.
1. Cría de pescado
NOTA: El trabajo con modelos de vertebrados requiere un protocolo aprobado por la IACUC. Debe llevarse a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes.
<ol><li>Mantener el pez cebra adulto como se describe en la literatura publicada anteriormente9.</li>
	<li>Por la tarde, coloque el pez cebra adulto en tanques de cría. Criar machos a hembras en una proporción de 1:2.</li>
</ol>2. Preparación de soluciones
<ol><li>Hacer una solución en stock de agarosa baja de fusión 1% en medios embrionarios (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, ajustado a pH 7.0). Alísgue la solución en stock en tubos de 1,5 ml y guárdelos a 4 oC.</li>
	<li>Hacer una solución en stock de 4% (p/v) tricaína (MS-222) en agua destilada. Conservar a 4oC en una botella oscura. ADVERTENCIA: La tricaína es tóxica y debe pesarse y disolverse en una campana de humos.</li>
	<li>Hacer una solución de stock de 20 mM N-feniltionea (PTU) en agua destilada. Conservar a -20oC.</li>
</ol>3. Preparación de embriones
<ol><li>Después del apareamiento, cosechar embriones en E3 en una placa de Petri e incubarlos a 26,5 oC durante unos 28 h antes del montaje. NOTA: Esto ralentiza el desarrollo de los embriones de modo que los embriones estén aproximadamente en 30 etapas de somita al comienzo de la toma de imágenes.</li>
	<li>Anestetizar embriones en 0.016-0.020% Tricaína en E3. Para inhibir la pigmentación, añada la PTU a una concentración de 200 m.</li>
	<li>Decotermir los embriones usando fórceps bajo un microscopio de disección. Usando dos fórceps, agarre y tire suavemente del coro para liberar el embrión.</li>
</ol>4. Montaje en agarosa
NOTA: El método de montaje desarrollado requiere dos concentraciones diferentes de agarosa de baja fusión en E3 con 0.02% Tricaína y PTU según sea necesario. La primera solución de agarosa contiene una concentración óptima de agarosa en la que la distorsión y la motilidad son mínimas. La optimización se describe en el paso 5 a continuación.
<ol><li>Calentar las soluciones de agarosa para las dos capas (concentración definida en el paso 5 a continuación y 1%) a 65 oC. Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 30 oC justo antes del montaje para que el embrión no se dañe por el calor. Para el montaje, utilice platos inferiores de vidrio de 35 mm con un fondo de vidrio de cubierta No. 0. El vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato crea un pozo de 10 mm poco profundo (aprox. 1,2 mm de profundidad), en el que se va a colocar el embrión. NOTA: En este caso, la concentración con la menor motilidad y distorsiones estaba entre 0.025 a 0.040% agarosa.</li>
	<li>Coloque suavemente un embrión desconfiónizado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato utilizando una pipeta de vidrio o una micropipette. Si utiliza un micropipeta, corte la parte externa de la punta para aumentar el tamaño de la abertura para que se ajuste al embrión(Figura 1A). Retire con cuidado cualquier E3 restante con un micropipeta.</li>
	<li>Añadir la primera solución de agarosa al pequeño pozo creado por el vidrio de la cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión (Capa 1)(Figura 1B). Asegúrese de que la agarosa cubra el pozo pequeño, pero no lo desbordará.</li>
	<li>Cubra el pozo pequeño con un vidrio de cubierta (22 mm x 22 mm)(Figura 1C)para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre los dos vasos de cubierta.</li>
	<li>Coloque una capa de solución de agarosa al 1% en la parte superior del cristal de la cubierta por toda la parte inferior del plato (Capa 2)(Figura 1D). A medida que esta capa se solidifica, mantiene el vidrio de la cubierta en su lugar.</li>
	<li>Llene la porción restante del plato con E3 que contiene 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado (Capa 3)(Figura 1E). NOTA: En esta configuración, el vidrio de la cubierta y el 1% de agarosa protegen la capa inferior de diluirse.</li>
</ol>5. Optimización de la solución de agarosa para la capa 1
<ol><li>Para identificar la concentración óptima de agarosa para la Capa 1, utilice un enfoque de búsqueda de cuadrícula multiescala. Monte embriones en concentraciones crecientes de agarosa que van del 0,01% al 1% seguido de imágenes de lapso de tiempo de restricción del crecimiento embrionario y motilidad en el campo de visión. Identificar las concentraciones en las que tanto la distorsión como la motilidad son mínimas.</li>
	<li>Para optimizar aún más la concentración de agarosa, monte los embriones utilizando un rango más fino de concentraciones de agarosa (por ejemplo, entre 0,025 y 0,040% agarosa) dependiendo de la concentración que se encuentre mejor en el paso 5.1 (por ejemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.). NOTA: En nuestro laboratorio, la concentración óptima de agarosa fue de alrededor del 0,03%.</li>
</ol>6. Imágenes de lapso de tiempo
NOTA: Este método de montaje funciona para cualquier microscopio invertido con funcionalidad de lapso de tiempo para fluorescencia e imágenes de campo brillante.
<ol><li>Realizar imágenes de lapso de tiempo para todo el embrión o partes del mismo durante un máximo de 55 horas. Para obtener imágenes de varios embriones, utilice un adaptador de etapa que sostenga varios platos con un embrión montado por plato. Gire los platos uno por uno para que los embriones se posicionen aproximadamente horizontalmente según lo determinado por el ojo. Para un crecimiento y desarrollo óptimo de embriones, utilice una etapa de microscopio con una incubadora establecida a 28,5 oC.</li>
	<li>Seleccione un objetivo de aumento bajo en el software del microscopio. Debajo de la pieza del ojo, localice y alinee finamente los embriones horizontalmente girando los platos utilizando la iluminación de campo brillante y registre sus ubicaciones en el software. Cree un nombre de archivo para el guardado automático de los datos. NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de plan apo 4x 0.2 NA y la pestaña XY dentro de la ventana de adquisición de ND para registrar las ubicaciones de los embriones. Los datos se guardaron en formato .nd2. El objetivo fue seleccionado haciendo clic en sus iconos en la pestaña Ti Pad.</li>
	<li>Establezca el tamaño del agujero, la velocidad de escaneado, el tamaño de la imagen y el zoom. A continuación, seleccione un objetivo de ampliación más alto para capturar las imágenes. NOTA: En este experimento, se utilizó un objetivo de na de 10 x 0,45 planos para la toma de imágenes de embriones enteros, y se utilizó un objetivo superfluor 20x 0,75 NA para la mayor magnificación de partes del embrión. El agujero se estableció en 1,2 UA (19,2 m para la lente 10x), la velocidad de escaneo se estableció para un tiempo de permanencia de píxeles de 2,4 s y el tamaño de la imagen se estableció en 1024 x 1024 píxeles con un zoom de escaneo de uno, dando un tamaño de píxel de 1,24 ám para la lente 10x y 0,62 m para la lente 20x.</li>
	<li>Seleccione los canales para la fluorescencia que se va a tomar en la imagen. Ajuste los ajustes de captura de imagen de un canal a la vez. Para cada canal de fluorescencia ajustar la potencia del láser y el detector de alto voltaje, asegurándose de recoger el mejor rango dinámico posible evitando la saturación y limitando el fotoblanqueo. NOTA: En este experimento, GFP se dio a la imagen del canal verde de 488, (láser de 488 nm y emisión entre 500 y 550 nm), y RFP con el canal rojo 561 (láser de 561 nm y emisión entre 570 y 600 nm), y la imagen de transmisión se recogió utilizando el láser de 561 nm y el detector de luz transmitida (canalTD).</li>
	<li>Para tomar imágenes de todo el embrión con el objetivo 10x, idee varios campos de visión con superposición y coselos con el software del microscopio. NOTA: Como los embriones crecerán sustancialmente en tamaño durante la toma de imágenes, asegúrese de que haya espacio en el campo de visión anterior y posterior al embrión. Utilice la pestaña Escanear imagen grande de la ventana de adquisición de ND y seleccione un patrón de 4 x 1 con una superposición del 10% para capturar cuatro campos de visión adyacentes.</li>
	<li>Configure los ajustes para capturar las pilas Z utilizando el software del microscopio. NOTA: Debido a que el embrión está montado cerca de la parte inferior de la placa de vidrio, su centro se alejará de la parte inferior a medida que crece. Utilice la pestaña Z de la ventana de adquisición ND y seleccione el rango relativo asimétrico. Con este método, el plano de enfoque actual se utiliza como plano de referencia y el resto de los planos se distribuyen asimétricamente por encima y por debajo para incluir todo el embrión dentro del volumen de la pila Z, con suficiente espacio para tener en cuenta el crecimiento de la muestra. En todos los experimentos, el intervalo se estableció en 11 m y el rango total en unos 45 planos.</li>
	<li>Para mantener el enfoque de varios embriones durante las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice un enfoque automatizado. Si toma imágenes de varios embriones, ajuste los niveles de desplazamiento individuales para que cada embrión se centre en el plano de referencia. NOTA: En este experimento, se utilizó un sistema de estabilización de enfoque basado en láser.</li>
	<li>Configure los parámetros de lapso de tiempo en el software del microscopio y la imagen para una duración de 55 h a intervalos de aproximadamente 1 h. En cada ciclo, capture dos conjuntos de datos de embriones secuencialmente y guarde los datos automáticamente después de cada ciclo.</li>
	<li>Procese imágenes utilizando una versión en línea o fuera de línea del software del microscopio. Si se ha creado una imagen de más de un embrión, cree archivos independientes para cada embrión dividiendo el conjunto de datos en función de la ubicación de la imagen. Utilice proyecciones de intensidad máxima o una herramienta similar para convertir conjuntos de datos de tiempo 3D en conjuntos de datos de tiempo 2D. Cree archivos de película mediante la opción de menú Guardar como, seleccionando .avi como formato de archivo. Seleccione la opción Sin compresión con intervalos de 200 ms para una velocidad de reproducción de 5 fotogramas /s. NOTA: El conjunto de datos original de dos embriones en este experimento se dividió utilizando la función De las ubicaciones divididas en el software (Archivo ? Importación/Exportación (Import/Export) Dividir multipuntos). Los datasets de tiempo 3D se convirtieron en conjuntos de datos de tiempo 2D mediante la función de proyección de intensidad máxima (Imagen ? Procesamiento ND Crear imagen de proyecciónde intensidad máxima en Z ).</li>
</ol>

<ol><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207(2013).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36(2014).</li>
<li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li>
<li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196(2012).</li>
<li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes%3A+tcf7+and+synembryn-like%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li>
<li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+MS-222+%28tricaine%29+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li>
<li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un método de montaje para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de peces cebra. El paso más crítico para el método de montaje es identificar la concentración óptima de agarosa que permitirá el crecimiento sin restricciones del embrión del pez cebra, y al mismo tiempo mantener los embriones en una posición completamente fija para la toma de imágenes confocales. Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, este valor es muy sensible a los errores en l...

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la biología del desarrollo, y la microscopía es el principal método para visualizar el desarrollo embrionario. Las ventajas de utilizar embriones de pez cebra para estudios de desarrollo incluyen pequeño tamaño, claridad óptica, desarrollo rápido y alta fecundidad de los peces adultos. La generación de líneas transgénicas de peces cebra que expresan fluorescencia en ciertos tejidos o células han permitido una visualización directa del desarrollo de tejidos de maneras no posibles con animales vertebrados más grandes. En combinación con la microscopía de lapso de tiempo, los detalles y la dinámica del desarrollo del tejido se pueden estudiar fácilmente.
Una dificultad con el desarrollo de peces cebra por imágenes es que los embriones crecen sustancialmente en longitud; el embrión extiende su longitud cuatro veces dentro de los primeros 3 días de vida1. Además, el cuerpo del embrión temprano es suave, y fácilmente se distorsiona si el crecimiento está restringido. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal, el embrión debe estar inmovilizado. Para mantener los embriones en una posición fija para la toma de imágenes confocales de lapso de tiempo, se anestesian regularmente y se montan en agarosa de fusión baja del 0,3-1%. Esto tiene la ventaja de permitir cierto crecimiento durante la toma de imágenes durante un cierto período de tiempo, mientras que restringe los movimientos del embrión. Partes del embrión se pueden imaginar eficientemente así. Sin embargo, cuando se utiliza este método para la toma de imágenes de todo el embrión durante períodos de tiempo prolongados, se observan distorsiones debido al crecimiento restringido causado por la agarosa. Por lo tanto, se requieren otros métodos de montaje. Kaufmann y sus colegas han descrito un montaje alternativo de embriones de pez cebra para la microscopía de láminas ligeras, como la microscopía de iluminación selectiva de plano (SPIM), montando los embriones en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) que contienen bajas concentraciones de agarosa o metilcelulosa2. Esta técnica produce una excelente visualización de la embriogénesis a lo largo del tiempo. Schmid et al. describen el montaje de hasta seis embriones en agarosa en tubos FEB para la microscopía de hoja de luz3 proporcionando visualización de varios embriones en una sesión de imágenes. Se han utilizado moldes para crear matrices de embriones para un montaje eficiente de un mayor número de embriones4. Masselkink et al. han construido moldes de plástico impresos en 3D que se pueden utilizar para hacer moldes de silicio en los que se pueden colocar embriones de pez cebra en diferentes etapas, lo que permite el montaje en una posición constante para la toma de imágenes, incluida la imagen confocal5. La impresión 3D también se ha utilizado para hacer moldes para el posicionamiento consistente de embriones de pez cebra en formato de 96 pozos6. Algunos moldes se personalizan para ciertas etapas y pueden no permitir un crecimiento sin restricciones durante largos períodos de tiempo, mientras que otros moldes son más flexibles. Recientemente, Weijts et al. publicaron el diseño y la fabricación de un plato de cuatro pozos para la toma de imágenes en vivo de embriones de pez cebra7. En este plato, la cola y el tronco de los embriones de pescado anestesiados se colocan manualmente bajo un techo de silicona transparente unido justo encima de un cristal de cubierta para formar un bolsillo. El embrión se fija entonces en esta posición mediante la adición de 0,4% de agarosa. Este montaje permite la toma de imágenes de la parte posterior de unos 2 mm de largo (tronco y cola) del embrión, y como se pueden montar hasta 12 embriones por pozo, el método permite la toma de imágenes de múltiples muestras. Del mismo modo, Hirsinger y Steventon presentaron recientemente un método donde la cabeza del pez está montada en agarose, mientras que la cola puede crecer libremente, y este método también facilita eficientemente la toma de imágenes del tronco y la región de la cola del embrión8.
Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen los movimientos de los embriones mientras permiten un crecimiento sin restricciones. Las ventajas de este método de montaje son que es un método de bajo costo, rápido y fácil para montar embriones de varias etapas para la toma de imágenes utilizando cualquier microscopio invertido. El montaje permite imágenes a largo plazo de todo el cuerpo (cabeza, tronco y cola) durante el desarrollo embrionario. Para mostrar la usabilidad de este método, se realizó la imagen del desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros en peces transgénicos. Dos embriones por sesión, a dos longitudes de onda en 3D fueron representados por microscopía de lapso de tiempo durante 55 horas consecutivas para representar películas de desarrollo de tejido.

<table><tbody><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>A9414</td><td>Almacene la solución disuelta a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio de 35 mm con cubreobjetos n.º 0 y fondo de vidrio de 10 mm de diámetro</td><td>MatTek Corporation, MA</td><td>P35GCOL-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>E10521</td><td>Almacene la solución disuelta a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>N-feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P7629</td><td>Almacene la solución disuelta a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Micro cubreobjetos 22x22 mm</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia Leica DMi8</td> Software <td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>LAS X Software</td> de <td>microscopio</td><td>Leica</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMC4500 cámara de microscopio digital</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1S Microscopio confocal</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Nikon NIS AR Versión 4.40</td><td>Nikon Instruments Inc.</td>Software <td>de</td><td>microscopio</td> NA</tr></tbody></table>

un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

La dinámica de desarrollo puede ser seguida por una microscopía confocal de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos vivos que expresan fluorescencia en tejidos o células específicos. Una dificultad con el desarrollo de embriones enteros es que los embriones de pez cebra crecen sustancialmente en longitud. Cuando se monta como se hace regularmente en 0.3-1% baja agarosa de fusión, la agarosa impone restricción de crecimiento, dando lugar a distorsiones en el cuerpo del embrión blando. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal de lapso de tiempo, el embrión debe ser inmovilizado. Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen la motilidad de los embriones mientras permiten el crecimiento sin restricciones. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones. Para demostrar la usabilidad de este método, el desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros se realizó en peces transgénicos durante 55 horas consecutivas. Este método de montaje se puede utilizar para obtener imágenes fáciles y de bajo costo de embriones enteros de peces cebra utilizando microscopios invertidos sin necesidad de moldes o equipos especiales.

Desarrollo del método de montaje El objetivo principal de este trabajo era desarrollar una técnica de montaje de bajo costo para la toma de imágenes de lapso de tiempo del desarrollo de peces cebra durante largos períodos de tiempo. El método de montaje en capas fue desarrollado para permitir el crecimiento completo del frágil cuerpo embrionario de pez cebra, al tiempo que restringe sus movimientos. Si la concentración de agarosa de la capa 1 es demasiado alta, los embriones se distorsionarán y curvar...

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Hemos desarrollado un método de montaje para la toma de imágenes de lapso de tiempo que permite el crecimiento sin restricciones de embriones frágiles de peces cebra y al mismo tiempo los mantiene en una posición completamente fija. Este método de montaje es rápido, fácil y barato y funciona para imágenes de laboratorio en cualquier microscopio invertido. Desarrollamos este método para la toma de imágenes de embriones vivos de peces cebra, pero podría ser modificado para la toma de imágenes de otros pequeños modelos de animales acuáticos.Comience por la cría del pez cebra adulto. Por la tarde, coloque los peces en tanques de cría en una proporción de hombre a mujer de uno a dos. A continuación, prepare una solución de stock de 1% de agarosa fundible baja en medios embrionarios y disuelva calentándola en un horno microondas.Aliquot la solución de agarosa en tubos de 1,5 mililitros. Hacer una solución de stock de 4%tricaína en agua destilada y almacenar la agarosa y tricaína a cuatro grados centígrados. La tricaína es tóxica y tiene que ser pesada y preparada en una campana de humo.Después del apareamiento, cosecha los embriones de pez cebra en E3 en un plato de Petri e incubarlos a 26,5 grados centígrados durante unas 28 horas antes del montaje. Anesthetizar los embriones con 0.02%tricaína y descorionarlos bajo un microscopio agarrándolos suavemente y separando la tarea para liberar el embrión. Justo antes del montaje, calentar la solución de agarosa a 65 grados Celsius y luego dejar enfriar a aproximadamente 30 grados Celsius para que el embrión no se dañe por el calor y añadir tricaína a la solución de agarosa.Utilice platos de fondo de cristal de 35 milímetros con un fondo de cubierta cero número. Coloque suavemente un embrión descorionado con uno de sus lados laterales hacia la parte inferior del plato con una pipeta de vidrio o una micropipeta, luego retire cuidadosamente cualquier E3 restante con una micropipeta. Añadir la primera solución de agarosa a la pequeña bien creada por el vaso de cubierta unido a la parte inferior del plato para cubrir el embrión asegurándose de que la agarosa cubre el pozo pequeño, pero no lo desborda.Cubra el pozo pequeño con un cubrecubos para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre las dos cubiertas. Coloque una capa de 1% de solución de agarosa en la parte superior del vidrio de la cubierta por toda la parte inferior del plato que mantendrá el vaso en su lugar a medida que se solidifica. A continuación, llene la porción restante del plato con E3 que contenga 0,02% de tricaína para mantener el sistema hidratado.Para identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno, monte los embriones en concentraciones crecientes de agarosa y realice imágenes de lapso de tiempo para identificar la concentración que minimiza la distorsión embrionaria y la motilidad, luego pruebe un rango más fino de concentraciones basadas en los resultados. El paso más crítico de este protocolo es identificar la concentración óptima de agarosa para la capa uno. Probar diferentes nano concentraciones de agarosa como 0.030%0.032%etc.para encontrar la concentración óptima. Para realizar imágenes de lapso de tiempo de los embriones, utilice una etapa de microscopio con una incubadora establecida en 28,5 grados centígrados y una imagen de hasta 55 horas. Para tomar imágenes simultáneas de varios embriones, utilice un adaptador de etapa que sostenga varios platos y gire los platos uno por uno para que los embriones se coloquen horizontalmente.Seleccione un objetivo de bajo aumento, luego localice los embriones usando el ocular y finalmente alinee horizontalmente girando los platos. Registre la ubicación de los embriones en el software y cree un nombre de archivo para guardar automáticamente los datos. Establezca el tamaño del agujero, la velocidad de escaneo, el tamaño de la imagen y el zoom.A continuación, seleccione un aumento más alto para capturar imágenes y los canales de fluorescencia que se van a tomar imágenes. Para cada canal, ajuste la potencia del láser y el detector de alto voltaje asegurándose de recoger el mejor rango dinámico posible evitando la saturación y limitando el blanqueo fotográfico. A continuación, para crear imágenes de todo el embrión con un objetivo 10X, establezca los ajustes de captura de imágenes grandes en el software para crear una imagen de varios campos de visión y unirlos ajustando la posición del embrión para asegurarse de que se ajuste dentro de esta gran área de imagen.Configure los ajustes para capturar pilas Z de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Con el fin de mantener el enfoque de múltiples embriones durante la toma de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice un enfoque automatizado y ajuste los niveles de desplazamiento individuales para que cada embrión se enfoque en el plano de referencia. A continuación, configure los parámetros de lapso de tiempo en el software del microscopio para crear una imagen durante una duración de 55 horas a intervalos de una hora.En cada ciclo, capture dos conjuntos de datos embrionarios secuencialmente y guarde los datos automáticamente. Utilice el software del microscopio para procesar las imágenes. Si se ha creado una imagen de más de un embrión, cree archivos independientes para cada embrión dividiendo los conjuntos de datos en función de la ubicación de la imagen.Convierta los datasets de tiempo 3D en datasets de tiempo 2D utilizando proyecciones de intensidad máxima o una herramienta similar. Por último, cree archivos de película guardando como AVI y seleccionando la opción sin compresión con intervalos de 200 milisegundos para una velocidad de reproducción de cinco fotogramas por segundo. Este método de montaje en capas permite crear imágenes de embriones de pez cebra, al tiempo que les permite crecer pero al mismo tiempo restringir su movimiento.Si la concentración de agarosa es demasiado alta, los embriones se distorsionan. Pero si es demasiado bajo, se moverán fuera del campo de visión durante la microscopía de lapso de tiempo. Se encontró que la concentración óptima de agarosa estaba entre 0,028 y 0,034% pece cebra transgénica viva que expresaba RFP en todo el embrión y la GFP en las células endoteliales de la vasculatura durante 55 horas durante las cuales el recipiente intersecumental brotó, se desarrolló la vastura subintestinal y de la cabeza, y se produjo condensación de venas caudales con extensión de tronco.Los embriones que expresaban GFP y las neuronas motoras fueron imágenes para visualizar el desarrollo de las neuronas motoras. Los axones de neurona motora brotan del tubo neural ventral sobre las somitas hacia el lado ventral del embrión. El co-desarrollo de la brotación dorsal de los axones de neuronas motoras en relación con la posición de los vasos intersegmentales se hizo una imagen utilizando un aumento más alto.Esto hizo posible visualizar los detalles más finos de la brotación de axón ventral, así como el axón dorsal que brota del tubo neural. A medida que aumentaba el número de somitas, las somites también se extienden en longitud y anchura. Este proceso se hizo con imágenes utilizando embriones transgénicos que expresan la GFP en los músculos.Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, es muy sensible a pequeñas variaciones en las mediciones al preparar la solución de agarosa y necesita ser redefinida para cada nuevo lote de solución de agarosa. Es importante establecer cuidadosamente los parámetros de imagen, incluyendo el tamaño y la resolución de la imagen, la velocidad de escaneo, el zoom, el detector de alto voltaje y la potencia del láser para garantizar la consistencia entre los experimentos y también para reducir la posibilidad de toxicidad fotográfica y blanqueo fotográfico durante imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Utilizando este método de montaje para embriones de pez cebra transgénicos seguido de imágenes de lapso de tiempo extendidas de todo el organismo, podemos visualizar cómo se desarrollan juntos diferentes tejidos.

a-layered-mounting-method-for-extended-time-lapse-confocal-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Este artículo describe un método para montar embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo. Este método es rentable y fácil de realizar utilizando placas de microscopía regulares con fondo de vidrio para obtener imágenes en un microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Montaje en agar en capas: preparación de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo con un microscopio invertido

Este video describe instrucciones paso a paso sobre cómo montar embriones vivos de pez cebra en una placa de 6 pocillos utilizando agarosa de bajo punto de fusión. También proporciona el proceso para adquirir imágenes de embriones vivos y analizarlas mediante software.

Montaje en agar: un método básico de montaje de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Aprende un método de montaje en capas para microscopía confocal de lapso de tiempo en embriones de Danio rerio. Esta técnica permite el crecimiento sin restricciones manteniendo los embriones fijos para obtener imágenes de alta calidad.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Explorar más videos