Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas
25 de octubre de 2019
Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.
La síntesis de proteínas libres de células es una tecnología emergente en sistemas y biología sintética para la producción in vitro de proteínas. Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células no tienen pared celular, por lo que tenemos acceso directo a metabolitos. En este protocolo, cuantificamos las mediciones absolutas de 40 metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía, lo que nos permite caracterizar el metabolismo libre de células.
El protocolo se basa en la metástasis de los compuestos con anilina, lo que permite una mejor separación y una mayor resolución de espectrometría de masas. Además, utilizamos estándares internos con un isotópico que etiquetamos anilina, para la cuantificación absoluta de los metabolitos. Los metabolitos etiquetados coelute, que elimina los efectos de la supresión del hierro.
Permite la cuantificación precisa de los compuestos. Trabajando en una campana, combine 550 microlitros de la anilina, con 337,5 microlitros de agua de grado LC-MS. Y 112.5 microlitros de 12 molares de ácido clorhídrico en un tubo centrífugo.
Vortex bien, y almacenar la solución de seis anilina molar a pH 4.5 y cuatro grados Celsius. Para preparar una solución de seis molares de carbono-13 anilina, a pH 4,5, combine 250 miligramos de carbono-13 anilina con 132 microlitros de agua y 44 microlitros de 12 ácidos clorhídricos molares. Vórtice bien, y almacenar a cuatro grados Centígrados.
Para preparar 200 miligramos por mililitro solución EDC, disolver dos miligramos de EDC en 10 microlitros de agua para cada muestra a etiquetar. Y vórtice bien. Para preparar muestras, apagar y precipitar las proteínas en una reacción de síntesis de proteínas libres de células, añadiendo un volumen igual de hielo-frío 100%etanol a la reacción de síntesis libre de células.
Centrifugar la muestra a 12.000 veces g, durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante de la muestra a un nuevo tubo de centrífuga. Para etiquetar la muestra con solución de anilina de carbono-12, transfiera seis microlitros de la muestra a un nuevo tubo de centrífuga y lleve el volumen a 50 microlitros con agua.
Añadir 5 microlitros de 200 miligramos por mililitro de solución EDC, mezclar bien la solución de anilina de carbono-12 y transferir 5 microlitros al tubo. Vórtice la reacción con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente. Después de dos horas, retire los tubos de la coctelera y transfiéralos a una campana de humo.
Añadir 1,5 microlitros de trietilamina a cada reacción para detener la reacción de etiquetado de anilina y estabilizar los compuestos. Centrifugar a 13,500 veces g durante tres minutos. Y salva al sobrenadante.
Para etiquetar las normas internas con solución de anilina de carbono-13, diluya la solución de stock interno a 80 micromolares con un volumen final de 50 microlitros. Añadir cinco microlitros de la solución de EDC de 200 miligramos por mililitro, y cinco microlitros de la solución de anilina de carbono-13 bien mezclada. Vórtice la reacción con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente.
Después de dos horas, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 microlitros de trietilamina a la reacción en una campana de humo. Centrifugar a 13.500 g durante tres minutos y guarde el sobrenadante. Para adivinar el estándar interno etiquetado, y la muestra etiquetada, mezclar 25 microlitros de cada uno en un vial de autosampler.
Y analizar por el procedimiento LC-MS. A continuación, para crear una curva estándar para metabolitos sin etiquetar, primero, diluir la solución de stock de metabolitos sin etiquetar a diferentes concentraciones, con un volumen de 50 microlitros. Añadir cinco microlitros de la solución de EDC de 200 miligramos por mililitro, y cinco microlitros de solución de anilina de carbono-12 a cada concentración.
Vórtice la reacción con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente. Y proceder con el tratamiento de trietilamina. Y centrífugalización antes de analizar por la LC-MS como antes.
Después de inicializar LC-MS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inyecte cinco microlitros de la muestra en la columna. Y adquiera las intensidades apropiadas de m sobre z ion para la muestra etiquetada con anilina de carbono-12. A continuación, vuelva a inyectar cinco microlitros de la misma muestra.
Y adquirir las intensidades de iones m sobre z para los estándares etiquetados de carbono-13 anilina. En este protocolo, se cuantificaron metabolitos que expresaban proteína fluorescente verde en una síntesis de proteínas libres de células a base de E.coli. Se detectaron y cuantificaron 40 metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía utilizando normas internas.
Mientras que una curva estándar para cinco de los metabolitos que no fueron etiquetados con anilina también se desarrolló. Los diversos metabolitos involucrados en estas vías eran una clase de azúcares fosforilados, ácidos fosfo-carboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleótidos y cofactores. Además, el método permitió la separación de pares de isómeros estructurales, como el fosfato de glucosa-seis, y el fosfato fructosa-seis en una sola ejecución LC-MS.
El paso más importante es etiquetar la muestra des prote proteinizada con anilina. Dado que la solución de anilina se separa, es importante trabajar de forma rápida y eficaz, manteniendo al mismo tiempo buenas prácticas de seguridad. Este método ayuda a caracterizar el metabolismo libre de células con la cuantificación de 40 metabolitos.
Pero, compuestos adicionales están en la mezcla libre de células, como aminoácidos que se pueden cuantificar. Esto ayudaría a proporcionar una mirada más completa en el metabolismo libre de células. Este método reveló que los sistemas libres de células tienen metabolismos complejos, todavía funcionando que pueden ser potencialmente explotados para una mejor eficiencia energética y rendimiento de carbono.
El protocolo se basa en etiquetar los compuestos con anilina con el uso de EDC como catalizador. Ambos reactivos son peligrosos y deben utilizarse con precaución.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo describe un método para cuantificar 40 metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía durante la síntesis de proteínas sin células. Mediante el uso de anilina para la derivatización, el protocolo mejora la separación en cromatografía líquida de fase reversa y emplea espectrometría de masas para una cuantificación precisa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Síntesis de proteínas libres de células
- Metabolómica
- Espectrometría de masas
Antecedentes
- La síntesis proteica libre de células permite el acceso directo a los metabolitos.
- Comprender el metabolismo central del carbono y la energía es crucial para caracterizar los sistemas libres de células.
- La derivatización con anilina mejora la separación y la resolución en el análisis.
- Los estándares internos marcados isotópicamente facilitan la cuantificación absoluta.
Objetivo del estudio
- Cuantificar los metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y energético.
- Mejorar la comprensión de los procesos metabólicos libres de células.
- Proporcionar un protocolo robusto para investigadores en biología sintética.
Métodos Utilizados
- Derivatización de metabolitos con anilina.
- Cromatografía líquida de fase reversa para la separación.
- Espectrometría de masas para la cuantificación utilizando estándares marcados isotópicamente.
- Coelución de metabolitos marcados para minimizar los efectos de supresión iónica.
Resultados principales
- Cuantificación exitosa de 40 metabolitos.
- Mejora en la separación y resolución en espectrometría de masas.
- Eliminación efectiva de los efectos de supresión iónica mediante coelución.
- Establecimiento de un protocolo confiable para estudios futuros.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método integral para la cuantificación de metabolitos.
- Mejora la comprensión de las vías metabólicas en sistemas libres de células.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a diversos proyectos de biología sintética.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de metabolitos centrales de carbono y energía en la síntesis de proteínas sin células permite evaluar de forma predictiva el rendimiento, el rendimiento final y la eficiencia energética del sistema. Esta capacidad facilita la eliminación mecanicista de riesgos en plataformas libres de células para la fabricación de biológicos bajo demanda, al identificar cuellos de botella metabólicos y limitaciones de cofactores. El método proporciona lecturas metabólicas análogas a biomarcadores traslacionales que orientan las decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento y del desarrollo preclínico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación del flujo de metabolitos con la producción de síntesis proteica en sistemas libres de células.
- Valor operativo: Proporciona un perfil metabólico cuantitativo para reducir los riesgos en la validación de dianas a través de la clarificación de rutas metabólicas y la evaluación funcional.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona una cuantificación estandarizada y reproducible de 40 metabolitos para apoyar la preparación del ensayo en plataformas de cribado basadas en sistemas libres de células.
- Valor operativo: Facilita flujos de trabajo de LC/MS compatibles con alto rendimiento y tiempos de análisis de 10 minutos, lo que permite el cribado escalable de metabolitos en distintas condiciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante la caracterización de la continuidad metabólica desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Valor operativo: Genera confianza predictiva en la identificación de compuestos activos al vincular la eficiencia metabólica con el rendimiento y la productividad proteica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos de flujo metabólico que orientan la selección de objetivos y la optimización de vías antes de la identificación del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de rutas metabólicas mediante la cuantificación absoluta de intermediarios de la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico y la ruta de las pentosas fosfato.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante normalización con estándares internos y eliminación de la supresión iónica basada en coelución.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (concentraciones de metabolitos en un rango de 2-3 órdenes de magnitud) que permiten comparaciones entre condiciones y evaluación estadística.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al establecer puntos de referencia metabólicos para la eficiencia energética y el rendimiento de carbono en sistemas libres de células.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma metabolómica reutilizable basada en LC/MS para la caracterización repetida de condiciones libres de células en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en el rendimiento del sistema libre de células mediante la cartografía metabólica exhaustiva y la reducción de la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante la corrección con estándar interno y corridas cromatográficas rápidas de 10 minutos.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la identificación temprana de limitaciones metabólicas.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en métricas cuantificables del metabolismo energético y de la regeneración de cofactores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en derivatización de metabolitos, operación de LC/MS y manejo de reactivos peligrosos (anilina, EDC, HCl).
- Depende de infraestructura de cromatografía líquida de fase reversa con espectrometría de masas y capacidad de ionización por electrospray.
- Exige estandarización entre equipos en cuanto al enfriamiento de muestras, precipitación de proteínas y temporización de la derivatización para asegurar la coelución y precisión en la cuantificación.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la extensión del método a aminoácidos y otros metabolitos no centrales de carbono presentes en mezclas libres de células.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de un control cuidadoso del pH durante la derivatización y la posible interferencia de matrices de muestra complejas, a pesar de las medidas para mitigar la supresión iónica.
