Native Polyacrylamidde Gel Electrophesis Análisis de la dimerización endógena IRF5
6 de octubre de 2019
Se describe un método nativo de mancha occidental para analizar la dmerización del factor regulador de interferón endógeno 5 en la línea de células dendríticas plasmáticas CAL-1. Este protocolo también se puede aplicar a otras líneas de celda.
Este protocolo utiliza una técnica ampliamente utilizada junto con reactivos y herramientas que se pueden adquirir comercialmente para evaluar la activación endógena de IRF5 durante los primeros eventos de estimulación. Se puede aplicar fácilmente para sondear la biología IRF5 en otro contexto celular. Mientras que PAGE nativo es una técnica ampliamente utilizada, obtener resultados claros, robustos, interpretables y reproducibles puede ser técnicamente difícil.
El uso de un sistema de amortiguación y gel de funcionamiento comercial ayuda a minimizar la variabilidad. Y prestar atención a los detalles es esencial, y la experiencia es clave para el éxito en la obtención de buenos resultados. Este protocolo PAGE nativo modificado implica muchos pasos con detalles sutiles que son clave para el éxito.
La demostración visual puede mostrar estos detalles que serían beneficiosos para los investigadores. Mantenga el cultivo celular CAL-1 en un matraz T75 a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono, con un medio completo rpmI 1640. Cuando esté listo para estimular las células, transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugarlas a 200 x g durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio para obtener una suspensión homogénea de una sola célula. Luego cuenta las células con un hemocitometro, y sembrarlas a una densidad de 1.000.000 celdas por pozo en una placa de seis pozos con cuatro mililitros de medio precalentado en cada pozo. Incubar las células durante 20 a 24 horas para permitir que la confluencia llegue a 90 a 95%Al día siguiente, estimular las células mediante la adición de cuatro microlitros de un miligramo por mililitro R848 por pozo, asegurándose de dejar un control bien con las células y sin tratamiento R848.
Mece suavemente la placa de lado a lado para dispersar uniformemente el R848, luego incubar las células durante 2 a 16 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Después de la incubación, transfiera las suspensiones celulares de la placa a tubos centrífugos de 5 mililitros. Centrifugar las células a 200 x g durante cinco minutos, luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros y gírela a 12.000 x g durante 30 a 60 segundos a 4 grados centígrados y, a continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante. Prepare el búfer de lelisis de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y manténgalo en hielo hasta que esté listo para usar. Vuelva a suspender el pellet celular en 30 microlitros de tampón de lysis helada, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Luego incubar el tubo sobre hielo durante 15 a 20 minutos. Aclare el analia centrifugando a 12.000 x g durante 15 a 20 minutos a 4 grados centígrados, y transfiera el sobrenadante a un tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros, asegurándose de mantener los extractos en hielo en todo momento. A continuación, mida la concentración de proteínas con Bradford Reagent.
Preparar los tampones de electroforesis de la cámara superior e inferior de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y enjuagar un gel PAGE 3-12% nativo a fondo con agua, sin distorsionar los pozos Se debe tener especial cuidado al manipular el desoxicolato de sodio. Se requiere EPI para la protección, como la capa de laboratorio, las gafas de seguridad y la máscara, para manipular el producto químico. A continuación, coloca el gel en el Mini Gel Tank, retira el peine, añade los tampones de electroforesis de cámara superior e inferior preparados y pre-ejecutarlo en una sala fría de 4 grados Celsius o en hielo a 150 voltios durante 30 minutos.
Mientras tanto, prepare las muestras para la carga mezclando las proteínas celulares en hielo con 4X Native Sample Buffer. Una vez completada la pre-ejecución, cargue de 10 a 15 microgramos de proteína en cada pozo, y ejecute el gel durante 30 minutos a 85 voltios, seguido de dos horas a 150 voltios. A continuación, remoje el gel en el tampón de funcionamiento SDS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Activar la membrana de difluoruro de polivinilideno empapándola en metanol durante aproximadamente cinco minutos. Haga un corte en una esquina de la membrana para indicar su orientación, y montar el sándwich de transferencia de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque el cassette de transferencia en el tanque y transfiera a 20 voltios durante una hora sobre hielo.
A continuación, retire la membrana del cassette con fórceps de plástico y bloquee la membrana en el tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 45 minutos en una coctelera mecedora. A continuación, incubar la membrana con el anticuerpo primario a 4 grados centígrados durante la noche o a temperatura ambiente durante dos horas y lavarla con un tampón de lavado 1XTBST durante tres minutos mientras se balancea. A continuación, incubar la membrana con el anticuerpo secundario de nuevo utilizando el tampón de lavado 1XTBST a temperatura ambiente durante 45 minutos, repitiendo los lavados.
A continuación, escanee la mancha utilizando un sistema de documentación de gel adecuado. Usando este protocolo, las células CAL-1 que fueron estimuladas o no estimuladas con R848 fueron analizadas con un inmunoblot. En las células CAL-1 no estimuladas, IRF5 se detectó como una sola banda en la pagina nativa correspondiente a su forma monomérica.
Para las células estimuladas, el nivel de monómero IRF5 disminuyó, mientras que el nivel del dimer aumentó. Se realizó un inmunoblot con anticuerpo anti-IRF5 en IRF5 sobre-expresando 293 células T transfectadas con varias construcciones. No se detectó IRF5 en el control no infectado, lo que demuestra la especificidad del anticuerpo anti-IRF5.
Una sola banda correspondiente al IRF5 monomérico sólo se detectó en las 293 células T que sobre-expresan IRF5. Cuando las construcciones que codifican las proteínas activadores IRF5 fueron co-transfectados, apareció una banda de migración lenta correspondiente a la forma dimerica de IRF5. Sin embargo, NMDA5, una proteína relacionada con RIG-I, no indujo dimerización IRF5.
El uso de geles de gradiente Bis-Tris es crucial, probablemente debido al pH específico y la composición química de este gel de sistemas electroforéticos que permitieron la separación de las formas monoméricas y dimericas de IRF5. Además, el alizado y la preservación de los litos celulares en el tampón de muestra nativo no desnaturalizado retiene las estructuras de proteínas nativas. Aquí utilizamos uno disponible comercialmente que está diseñado para ácidos PAGE nativos.
Un método adicional que se complementa en gran medida con esto es utilizar el sistema de citometría de flujo de imágenes ImageStream para evaluar la translocación nuclear IRF5, que es la sustancia que en la activación de IRF5 después de la dimerización. Cuando se combina con nuestro protocolo, sirve como otro tipo de prueba para validar los pasos involucrados en la activación de IRF5. Siendo un regulador clave de la respuesta inflamatoria, IRF5 desempeña un papel importante en la infección y la inmunidad, enfermedades autoinmunes, cáncer, y muchas otras enfermedades importantes para la salud humana.
También hay esfuerzos en el desarrollo de terapias para dirigirse a IRF5 y factores de transcripción relacionados. Este protocolo permitirá a los investigadores de diversos campos comprender y sondear la biología IRF5.
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Descripción general
Este artículo describe un método de inmunotransferencia nativa para analizar la dimerización del factor regulador del interferón 5 (IRF5) endógeno en la línea celular de células dendríticas plasmocitoides CAL-1. El protocolo es adaptable para su uso en otras líneas celulares, facilitando el estudio de la biología del IRF5 en diversos contextos celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- IRF5 desempeña un papel crucial en la respuesta inmunitaria.
- Comprender la dimerización de IRF5 es importante para elucidar su función.
- La electroforesis nativa en gel de poliacrilamida puede ser técnicamente difícil, pero es esencial para obtener resultados confiables.
- Los reactivos comerciales pueden ayudar a estandarizar el proceso experimental.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo confiable para evaluar la activación de IRF5.
- Mejorar la comprensión de la biología de IRF5 en diferentes contextos celulares.
- Minimizar la variabilidad en los resultados experimentales.
Métodos Utilizados
- Técnica de inmunotransferencia western nativa.
- Uso de tampones de corrida y sistemas de geles comerciales.
- Atención al detalle en la ejecución del protocolo.
- Enfoque paso a paso para asegurar la reproducibilidad.
Resultados principales
- Éxito en el análisis de la dimerización de IRF5 en células CAL-1.
- El protocolo proporciona resultados claros e interpretables.
- Se demostró la aplicabilidad a otras líneas celulares.
- Se destacó la importancia de la precisión técnica.
Conclusiones
- El protocolo de PAGE nativo modificado es efectivo para estudiar IRF5.
- La atención al detalle es fundamental para obtener buenos resultados.
- Este método puede adaptarse para aplicaciones más amplias en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de los estados de activación de factores de transcripción, como la dimerización de IRF5, proporciona una comprensión mecanicista de las vías de señalización inflamatoria relevantes para la validación de dianas en enfermedades autoinmunitarias y oncología. Este método de inmunotransferencia con electroforesis nativa permite la detección de cambios conformacionales endógenos de proteínas sin artefactos por sobreexpresión, apoyando pruebas de hipótesis en etapas tempranas dentro de programas de descubrimiento centrados en inmunología. El ensayo ofrece lecturas cuantitativas y reproducibles que orientan decisiones de avance o interrupción del proyecto, alclarar el compromiso de la diana y la modulación de la vía en sistemas celulares relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación del mecanismo de activación de IRF5 mediante la detección directa de la formación de dímeros endógenos en respuesta a la estimulación de la vía TLR-MyD88.
- Valor operativo: Utiliza reactivos comercialmente disponibles y condiciones estándar de electroforesis en geles nativos para reducir la variabilidad y mejorar la transferibilidad del ensayo entre laboratorios.
- Valor predictivo: Distingue las formas monomérica y dimérica de IRF5 para correlacionar las condiciones de estimulación con los estados funcionales de activación, lo que apoya la reducción de riesgos del objetivo.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Proporciona un formato de inmunotransferencia validado para monitorear la activación de IRF5 como lectura farmacodinámica en cascadas de cribado de compuestos.
- Reproducibilidad: Enfatiza condiciones estandarizadas de lisis, electroforesis y transferencia para asegurar una separación consistente de complejos proteicos nativos.
- Escalabilidad: Adaptable a múltiples líneas celulares, incluidas pDCs CAL-1 y HEK293T, lo que permite la validación cruzada del blanco en diferentes modelos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Relaciona la dimerización de IRF5 con la inducción de citocinas proinflamatorias, conectando la activación molecular con resultados funcionales en inmunidad y autoinmunidad.
- Continuidad traslacional: Complementa los ensayos de translocación nuclear (por ejemplo, ImageStream) para validar toda la cascada de activación, desde la dimerización hasta la señalización nuclear.
- Reducción mecanicista de riesgos: Confirma la especificidad de la activación de IRF5 al demostrar que proteínas relacionadas como MDA5 no inducen dimerización, reduciendo las preocupaciones por efectos fuera del blanco.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se encaja dentro del continuo de descubrimiento temprano en el que la validación del blanco precede a la identificación del fármaco líder, ofreciendo un punto de control bioquímico para la modulación de vías antes del cribado fenotípico celular. Apoya los esfuerzos de desarrollo de ensayos que requieren detección cuantitativa de proteínas en su estado nativo para evaluar la interacción con moléculas pequeñas o biológicos. El flujo de trabajo genera relaciones claras entre dímeros y monómeros que sirven como entradas analíticas para comparar la eficacia de compuestos o los efectos de perturbaciones genéticas en proyectos de inmunología.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis mecanicistas sobre la activación de IRF5 downstream de agonistas de TLR como R848, aclarando relaciones causales en la señalización inmune.
- Tamizaje: Permite el desarrollo de ensayos de ligandos o inhibidores en los que la dimerización de IRF5 sirve como punto final medible para la modulación del blanco.
- Análisis: Genera datos cuantitativos de inmunotransferencia para comparar estados de activación entre diferentes condiciones, apoyando análisis de respuesta a dosis y curso temporal.
- Investigación Traducional: Relaciona la activación bioquímica (dimerización) con la localización subcelular (translocación nuclear) cuando se combina con métodos complementarios de imagen.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma nativa de inmunotransferencia transferible, aplicable a otros factores de transcripción o proteínas de señalización que requieran análisis en estado nativo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al visualizar directamente los cambios conformacionales del IRF5 endógeno sin desnaturalización ni sobreexpresión.
- Valor operativo: Promueve la estandarización mediante el uso de sistemas comerciales de tampón y controles procedimentales detallados, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en el blanco al proporcionar evidencia directa de la activación de la vía, lo que orienta la priorización de terapéuticos dirigidos al IRF5.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo al confirmar la interacción con el blanco en modelos humanos de pDC relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de proteínas nativas y en electroforesis no desnaturalizante para preservar los complejos proteicos durante la preparación de muestras.
- Depende del acceso a sistemas de geles de PAGE nativo compatibles, tampones de corrida y equipos de electroforesis a bajas temperaturas para mantener la resolución.
- Necesita la estandarización de las condiciones de lisis y de los tampones de muestra entre diferentes equipos para garantizar una detección consistente de monómeros y dímeros.
- Debe tener en cuenta los niveles de expresión específicos de cada tipo celular y la optimización del estímulo al adaptarse a modelos que no sean de pDC.
- Está limitado por la necesidad de anticuerpos específicos de alta calidad capaces de detectar IRF5 nativo en lisados complejos sin reactividad cruzada.
