Name: Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a medir la permeabilidad intestinal en Caenorhabditis elegans usando un sistema de imagen de alto rendimiento. Este método permite evaluar efectos de bacterias y productos químicos en la salud intestinal.

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Este estudio fue apoyado por una beca de investigación intramuros del Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea (2E29563).

1. Preparación de P. aeruginosa PAO1 y Escherichia coli OP50 Cultura
<ol><li>Preparar 500 ml de medio esterilizado Luria-Bertani (LB)(Tabla 1) e inocular una sola colonia de P. aeruginosa en el medio. Incubar el cultivo durante 14 a 15 h a 37oC con una velocidad de agitación de 150 rpm.</li>
	<li>Distribuir igualmente el cultivo bacteriano en dos tubos centrífugos de 500 ml y centrifugar los tubos a 3.220 x g a 4 oC durante 30 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante hasta que el volumen sea de 50 ml (una décima parte del volumen inicial) y vuelva a suspender el pellet bacteriano.</li>
	<li>Conservar el cultivo bacteriano concentrado a 4oC hasta su uso. El período de almacenamiento del cultivo de P. aeruginosa puede ser de hasta 1 mes, pero el cultivo fresco es mejor para inducir daño intestinal. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Además de las bacterias vivas enteras, el sobrenadante del cultivo bacteriano se puede utilizar para probar los efectos de las bacterias intestinales19.</li>
	<li>Para preparar E. coli OP50, el cultivo E. coli OP50 en el medio DYT(Tabla 1)y luego aplicar pasos similares a los descritos anteriormente, pero disminuir el volumen a una sexta parte del volumen original. Por ejemplo, si el volumen inicial es de 500 ml, después de eliminar el sobrenadante, el volumen restante es de aproximadamente 83 ml. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>2. Preparación de Enterococcus faecalis KCTC 3206 Cultura
<ol><li>Preparar 500 ml de caldo de infusión esterilizada del corazón cerebral (BHI) (Tabla 1).</li>
	<li>Inocular una colonia en 500 ml de caldo BHI e incubar el cultivo durante 14-15 h en una incubadora de temblores a 37 oC y 150 rpm.</li>
	<li>Distribuir igualmente el cultivo bacteriano en dos tubos centrífugos de 500 ml y centrifugar los tubos a 3.220 x g a 4 oC durante 30 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante hasta que el volumen sea de 50 ml (una décima parte del volumen inicial) y vuelva a suspender el pellet.</li>
	<li>Conservar el cultivo bacteriano concentrado a 4oC hasta su uso. El cultivo fresco es mejor para probar los efectos sobre la permeabilidad intestinal. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>3. Preparación de Cultivos De E. coli OP50 y Cultivos de P. aeruginosa PAO1 inactivados por calor
<ol><li>Cultivo y cosecha de las bacterias como se describió anteriormente (pasos 1.1–1.3).</li>
	<li>Inactivar el calor del cultivo E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 como se describió anteriormente20,21,22. Para la inactivación del calor, incubar las bacterias resuspendidas a 65 oC (baño de agua) durante 30 min.</li>
	<li>Enfriar el cultivo bacteriano concentrado a temperatura ambiente y almacenarlo a 4 oC hasta su uso. El período de almacenamiento puede ser de hasta 1 mes. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>4. Preparación de placas de nematodo de crecimiento medio (NGM) para probar los efectos de diferentes bacterias en la permeabilidad intestinal de C. elegans
<ol><li>Colocar 1,25 g de peptona, 1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, agitador magnético y 487,5 ml de agua destilada en una botella de vidrio de 500 ml(Tabla 1).</li>
	<li>Mezclar bien la mezcla, autoclave la mezcla durante 15 min a 121 oC y enfriar la mezcla a 55 oC en un baño de agua durante 30 min.</li>
	<li>Retire el medio del baño de agua, agregue los componentes (0,5 ml de 1 M CaCl2, 0,5 ml de colesterol, 0,5 ml de MgSO4,12,5 ml de KPO4) (Tabla 1) al NGM, y mezcle bien. NOTA: Todos los componentes individuales deben ser autoclavedos excepto el colesterol (disuelto en etanol absoluto), y cada paso experimental debe llevarse a cabo en un banco limpio.</li>
	<li>Distribuya 20 ml de NGM a cada plato petri de 90 x 15 mm y deje que el agar se solidifique en un banco limpio a temperatura ambiente (aproximadamente 20 oC). Las placas NGM se pueden almacenar durante un mes a 4 oC. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las placas NGM utilizadas para la tinción FITC-dextran fueron preparadas por el mismo procedimiento (de los pasos 4.1–4.3). 10 ml de NGM se distribuyeron a cada plato Petri de 60 x 15 mm y se permitió solidificar en un banco limpio a temperatura ambiente (aproximadamente 20 oC).</li>
	<li>Retire el cultivo bacteriano del refrigerador de 4oC y vórtice el cultivo a fondo antes de extender el cultivo sobre las placas NGM.</li>
	<li>Añadir un total de 800 sl del cultivo bacteriano a cada placa NGM fresca, y dejar que las placas se sequen en una incubadora de 20 oC durante la noche. NOTA: Para el primer experimento(Figura 1), se prepararon dos placas NGM con E. coli OP50, una placa NGM con P. aeruginosa PAO1 y una placa NGM con E. faecalis KCTC3206. Para el segundo experimento(Figura 2),se prepararon dos placas NGM con E. coli OP50 vivo, una placa NGM con PAO1 vivo P. aeruginosa y una placa NGM con P. aeruginosa PAO1 inactivada por calor.</li>
</ol>5. Preparación de placas NGM para el ensayo de los efectos de un producto químico (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans Fed con P. aeruginosa
<ol><li>Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 ml de agua destilada, agitador magnético y 6,8 g de agar a una botella de vidrio de 500 ml (agar NGM).</li>
	<li>Añadir 0,5 g de peptona, 0,6 g de NaCl, 195 ml de agua destilada y un agitador magnético sin agar a otra botella de vidrio de 500 ml (caldo NGM).</li>
	<li>Autoclave las dos botellas (de los pasos 5.1–5.2), una botella de vidrio vacía de 100 ml y una botella de vidrio vacía de 500 ml durante 15 min a 121 oC. A continuación, deje que el medio que contiene botellas se enfríe a 55 oC en el baño de agua durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir los productos químicos aditivos al caldo NGM: 0,4 ml de 1 M CaCl2, 0,4 ml de colesterol en etanol (ml), 0,4 ml de 1 M MgSO4 y 10 ml de 1 M KPO4 (todos estos componentes deben esterilizarse aparte del colesterol en etanol). A continuación, revuelva bien la mezcla con un agitador magnético a 55 oC.</li>
	<li>Etiquete la botella de vidrio vacía autoclave de 500 ml con dimetil sulfóxido (DMSO) y la botella de vidrio vacía de 100 ml autoclave con DIM.</li>
	<li>Transfiera 50 ml de caldo NGM a la botella de 100 ml con etiqueta DIM. Añadir 500 ml de stock DIM de 20 mM en la botella y mezclar bien. NOTA: DIM se disuelve en DMSO (20 mM DIM stock).</li>
	<li>Retire rápidamente el medio de agar NGM del baño de agua, agregue 50 ml del medio de agar NGM en la botella etiquetada con DIM y mezcle bien.</li>
	<li>Coloque una alícuota de 20 ml de medio NGM que contiene DIM en cada plato Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente cinco placas NGM que contienen DIM se pueden hacer a partir de este paso. NOTA: La concentración final de DIM en cada placa NGM será de 100 m.</li>
	<li>Para preparar la placa NGM que contiene DMSO, transfiera 150 ml de caldo NGM a la botella de 500 ml con etiqueta DMSO. Añadir 1,5 ml de DMSO a la botella y mezclar bien.</li>
	<li>Agregue 150 ml del medio de agar NGM a la botella con etiqueta DMSO y mezcle bien.</li>
	<li>Coloque una alícuota de 20 ml de medio NGM que contiene DMSO en cada plato Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente quince placas NGM que contienen DMSO se pueden hacer a partir de este paso. NOTA: La concentración final de DMSO en cada placa NGM será del 0,5%.</li>
	<li>Solidificar las placas a temperatura ambiente durante al menos 3 h y almacenarlas a 4oC hasta su uso. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	<li>Retire el cultivo E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 del refrigerador de 4oC (del paso 1.4) y vórtice el cultivo correctamente antes de extenderse a las placas NGM.</li>
	<li>Poner 800 l del cultivo bacteriano E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 en cada placa de agar NGM fresca y dejar que las placas se sequen en una incubadora de 20 oC durante la noche. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Para el tercer experimento(Figura 3), se prepararon dos placas NGM que contienen DMSO recubiertas con E. coli OP50 vivo, una placa NGM que contiene DMSO recubierta con P. aeruginosa PAO1 vivo y una placa NGM que contiene DIM recubierta con P. aeruginosa PAO1 vivo.</li>
</ol>6. Preparación de C. elegans sincronizados por la edad
<ol><li>Cultivar gusanos en una placa sólida de NGM y alimentarlos con E. coli OP50 hasta que se alcance la población deseada.</li>
	<li>Sincronice los huevos utilizando el método de puesta de óvulos cronometrados o el tratamiento de la solución de blanqueo como se describió anteriormente20,23,24.</li>
</ol>7. Tratamiento de bacterias o DIM y FITC-dextran Feeding
<ol><li>Incubar los huevos sincronizados por la edad a 20 oC durante 64 h en placas NGM complementadas con E. coli OP50 vivo como alimento.</li>
	<li>Lavar la larva L4 sincronizada por la edad con S-buffer y transferirlas (más de 500 gusanos) al tratamiento de placas NGM que contienen diferentes bacterias y productos químicos (descrito en NOTA siguiendo los pasos 4.6 y 5.14,). Incubarlos a 20oC durante 48 h. NOTA: El tiempo de tratamiento puede variar de 24 a 72 h, de acuerdo con las bacterias y productos químicos utilizados. El efecto terapéutico o preventivo de DIM también se puede evaluar pretratando los gusanos con patógenos y luego tratando los gusanos con DIM (el efecto terapéutico) o pretratando los gusanos con DIM y luego tratando con patógenos (el efecto preventivo)19.</li>
	<li>Para preparar las placas suplementadas con FITC-dextran, mezcle 2 ml de E. coli OP50 inactivado sin calor con 4 mg de FITC-dextran. A continuación, divida 100 sl de la mezcla FITC-dextran y E. coli OP50 en veinte placas de agar NGM frescas (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio. NOTA: La concentración final de FITC-dextran en cada placa NGM será de 20 g/ml.</li>
	<li>Prepare cinco placas NGM que contienen E. coli OP50 sin FITC-dextran para el tratamiento de control del vehículo. Para ello, divida 100 l de E. coli OP50 con inactivada sin calor a cada placa de agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) y deje que las placas se sequen durante 1 h en un banco limpio. NOTA: Para cada experimento independiente, se requieren quince placas NGM suplementadas con FITC-dextran y cinco placas NGM sin FITC-dextran.</li>
	<li>Después de 48 h de tratamiento (del paso 7.2), lavar los gusanos con S-buffer, transferir los gusanos a las placas suplementadas FITC-dextran y las placas NGM sin FITC-dextran, e incubar las placas durante la noche (14-15 h). NOTA: Para cada grupo de tratamiento, se requieren 5 réplicas de la tinción FITC-dextran (o alimentación de control del vehículo).</li>
	<li>Lave los gusanos con S-buffer y permítales arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante 1 h. NOTA: Para cada experimento independiente, se necesitan un total de 20 placas NGM frescas. En este paso, puede utilizar la placa NGM suplementada sin o con E. coli OP50.</li>
	<li>Añadir 50 sl de solución de formaldehida al 4% a cada pocal de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos. Transfiera aproximadamente 50 gusanos de cada placa NGM a cada pocal para mediciones de fluorescencia. Después de 1 a 2 min, retire a fondo todo el formaldehído de cada poca y agregue 100 s de medio de montaje para recubrir los pozos. NOTA: Solución de formaldehide (4%) se utiliza para inmovilizar y arreglar los gusanos. Para cada grupo de tratamiento, se utilizan 5 pozos (5 réplicas) para el análisis de imágenes.</li>
</ol>8. Imaging C. elegans con el sistema de imágenes de Operetta y la determinación de la permeabilidad intestinal mediante la medición de la absorción de fluorescencia de la fluorescencia FITC-dextran
NOTA: La estereomicroscopía fluorescente se puede utilizar para el análisis de imágenes en lugar del sistema Operetta.
<ol><li>Capture imágenes de fluorescencia y mida la intensidad de la fluorescencia utilizando el sistema de imágenes de alto contenido de Operetta y analice las imágenes con el software Harmony.</li>
	<li>En el software Harmony, pulse el icono Abrir tapa para abrir la tapa y colocar la placa en la máquina.</li>
	<li>Configure los parámetros.</li>
	<li>Haga clic en Configurar, seleccione el tipo de placa (96 pocillos de fondo plano) y agregue los canales (canales de campo brillante y EGFP).</li>
	<li>Ajuste el diseño. Vaya a la selección Diseñoy, a continuación, seleccione Pista y ajuste los parámetros (primera imagen a 1 m, el número de planos es de 10, la distancia es de 1 m).</li>
	<li>Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura y pulse Prueba para comprobar si las imágenes son satisfactorias en la sección Ejecutar experimento.</li>
	<li>Si las imágenes son satisfactorias, vuelva a la sección Configurar y pulse el icono Restablecer al final de la pantalla. A continuación, seleccione todos los pozos de destino y un número adecuado de campos de captura.</li>
	<li>Vaya a Ejecutar experimento de nuevo e introduzca el nombre de la placa y, a continuación, presione Iniciar para comenzar a procesar.</li>
	<li>Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección de análisis de imagen e introduzca la imagen. Encuentre la celda eligiendo el canal EGFP y el método B. Ajuste el umbral común a 0,5, el área a >200 m2, el factor de división a 3.0, el umbral individual a 0.18 y el contraste a más de 0.18. A continuación, calcule las propiedades de intensidad y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración.</li>
	<li>Vaya a la sección Evaluación para medir la intensidad obteniendo un mapa de calor y una tabla de datos. Establezca el parámetro Readout en Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well e inicie la evaluación. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	<li>Para extraer los datos de Operetta, haga clic en el botón Configuración y elija Gestión de datos.</li>
	<li>Elija Write archive (Escribir archivo)y, a continuación, abra la exploración y seleccione el archivo.</li>
	<li>Para seleccionar el archivo, haga clic en la señal pequeña + en la esquina izquierda y, a continuación, haga clic en Medición y elija Nombre de placa.</li>
	<li>Seleccione el archivo y haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Seleccione la ruta para guardar el archivo haciendo clic en la señal Examinar en la ruta activa.</li>
	<li>Haga clic en Iniciar para guardar el archivo de datos. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>9. Análisis estadístico de la fluorescencia FITC-dextran de C. elegans
<ol><li>Importe los datos y calcule la media y la desviación estándar (SD) utilizando un software de estadísticas.</li>
	<li>Analice la diferencia significativa con el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mediante la utilización de este nuevo método para determinar la permeabilidad intestinal en C. elegans, que combina la microscopía de fluorescencia automatizada y el análisis cuantitativo de imágenes, las diferencias causadas por microorganismos intestinales o productos químicos se pueden determinar in vivo, específicamente en el intestino de C. elegans. Este protocolo es útil para las investigaciones de permeabilidad intestinal y aplicable a muchas tareas, como la determinación reactiva de especies de ...

La permeabilidad intestinal se considera como una de las principales barreras relacionadas con la microbiota intestinal y la inmunidad a la mucosa y es probable que se vea afectada por varios factores, como modificaciones de la microbiota intestinal, deterioro epitelial o alteraciones de la capa de moco1. Documentos recientes han reportado protocolos eficaces para medir la permeabilidad intestinal de las células intestinales humanas cultivadas mediante el análisis de las tasas de flujo de fluorescencia a través de la capa de células intestinales2, pero menos documentos de investigación presentan un procedimiento adecuado para medir la permeabilidad intestinal en los nematodos, particularmente en C. elegans,mediante el uso de la tinción FITC-dextran.
Existen dos protocolos representativos para medir la permeabilidad intestinal en C. elegans utilizando Rojo nilo3 y erioglaucina disódico (o el ensayo Pitufo)4,5. En este protocolo, utilizamos FITC-dextran (peso molecular medio 10.000), que tiene un peso molecular mucho mayor que el rojo del Nilo (MW 318,37) y el erioglaucina disódico (MW a 792,85). FITC-dextran es más similar a los colorantes disódicos rojos del Nilo o erioglaucina a nutrientes macromoleculares reales como los carbohidratos, que se absorben a través de la capa intestinal. La permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con erioglaucina disódico (tinte azul pitufo) se puede evaluar fácilmente sin microscopía de fluorescencia. Sin embargo, en el ensayo Pitufo, el análisis cuantitativo de la permeabilidad intestinal es difícil debido a la falta de estandarización y debe evaluarse manualmente4,5. En el caso del ensayo rojo del Nilo, el rojo del Nilo también tiñe las gotas de lípidos en las células, lo que puede interferir con la determinación exacta de la permeabilidad intestinal en C. elegans6. Los protocolos actuales permiten un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C. elegans tratados con diversas bacterias intestinales y productos químicos evitando la tinción de lípidos inespecíficos.
C. elegans es un modelo típico en campos biológicos debido a su precio asequible, fácil manipulación, problemas de ética animal limitada, y corta vida útil, que es beneficioso para la experimentación rápida7. En particular, después de que se publicó todo el genoma de C. elegans, casi el 40% de los genes en el genoma de C. elegans fueron encontrados como ortologos a los genes que causan enfermedades humanas8. Además, el cuerpo transparente permite la observación dentro del organismo, lo que es ventajoso para la investigación de eventos celulares y para aplicaciones de fluorescencia en biología celular, por ejemplo, la tinción de células madre con DAPI o inmunohistoquímica9. C. elegans se utiliza a menudo como un animal experimental para estudiar la interacción entre la microbiota intestinal y el huésped; además, C. elegans se utiliza para la pantalla de bacterias probióticas que promueven la salud10,11,12, así como productos químicos dietéticos que promueven la salud intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis son bacterias intestinales bien conocidas que afectan negativamente el sistema gastrointestinal, especialmente las células epiteliales colónicas del tracto intestinal15,16. Por lo tanto, medir la permeabilidad intestinal desencadenada por estas bacterias es necesario para el cribado y desarrollo de nuevos fármacos que pueden recuperar y reducir el daño causado por la inflamación bacteriana y la infección. En este protocolo, probamos los efectos de estas bacterias intestinales en la permeabilidad intestinal de C. elegans.
También informamos de un protocolo optimizado para probar productos químicos sobre la permeabilidad intestinal de C. elegans. Para este propósito, utilizamos 3,3'-diindolylmethane (DIM) como un modelo químico porque DIM es un compuesto metabolito bioactivo derivado de indol-3-carbinol, que está presente en las plantas de alimentos Brassica, y se ha informado que tiene efectos terapéuticos sobre la EII en ratones17,18. Además, recientemente descubrimos que DIM mejora la disfunción de la permeabilidad intestinal tanto en las células intestinales humanas cultivadas como en el nematodo modelo C. elegans19.
En este estudio, utilizamos tres condiciones experimentales diferentes. En primer lugar, medimos los efectos de las diferentes bacterias, P. aeruginosa y E. faecalis, en la permeabilidad intestinal(Figura 1). En segundo lugar, medimos los efectos de P. aeruginosa en la permeabilidad intestinal(Figura 2). En tercer lugar, medimos los efectos de DIM (un modelo químico) en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con P. aeruginosa (Figura 3).
El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos optimizados que midan la permeabilidad intestinal de C. elegans,que se cambia por el tratamiento con diversas bacterias intestinales, así como con productos químicos.

<table><tbody><tr><td>3,3'-diindolilmetano&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9568</td><td></td></tr><tr><td>90&veces; Placas de Petri de 15 mm</td><td>SPL Life Sciences, Corea del Sur</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>60&times; Placas de Petri de 15 mm</td><td>SPL Life Sciences, Corea del Sur</td><td>10060</td><td></td></tr><tr><td>Bactor Agar</td><td>Beckton Dickinson</td><td>REF. 214010</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Infusión Cerebro-Corazón (BHI)&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF. 237500</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Tipo salvaje&nbsp;</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Costa Placa de ensayo, 96 pocillos negros con fondo plano transparente sin tratar, sin tapa Poliestireno</td><td>Corning incorporado</td><td>REF. 3631</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Enterococcus faecalis KCTC 3206</td><td>Colección coreana para cultivo tipo</td><td>KCTC NO. 3206</td> Escherichia coli <td>anaeróbica falcutiva</td></tr><tr><td>OP50</td><td>Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína - dextrano</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Software Harmony&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>verson 3.5</td></tr><tr><td>Luria-Bertani LB medio</td><td>Merck</td><td>VM743185 626&nbsp; 1.10285.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2213-1</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje acuoso de montaje fluorado</td><td>Sigma</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Operetta CLS Sistema de análisis de alto contenido</td><td>PerkinElmer</td><td>&nbsp; </td><td></td>HH16000000</tr><tr><td>Peptona</td><td>Merck</td><td>EMD 1.07213.1000</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PA01</td><td>Colección Coreana para Cultivo Tipo</td><td>KCTC NO. 1637</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Sodio</td><td>Fisher Biorreactivos</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon, Japón</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF. 212750</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

En los organismos vivos, la hiperpermeabilidad intestinal es un síntoma grave que conduce a muchas enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Caenorhabditis elegans es un modelo animal no mamífero que es ampliamente utilizado como un sistema de ensayo debido a su corta vida útil, transparencia, rentabilidad y falta de problemas de ética animal. En este estudio, se desarrolló un método para investigar los efectos de diferentes bacterias y 3,3'-diindolylmethane (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans con un sistema de análisis de imagen de alto rendimiento. Los gusanos fueron infectados con diferentes bacterias intestinales o cotratados con DIM durante 48 h y alimentados con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran durante la noche. Luego, se examinó la permeabilidad intestinal comparando las imágenes de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia dentro de los cuerpos de gusanos. Este método también puede tener el potencial de identificar bacterias intestinales probióticas y patógenas que afectan la permeabilidad intestinal en el modelo animal y es eficaz para examinar los efectos de los productos químicos nocivos o que promueven la salud en la permeabilidad intestinal y la salud intestinal. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones considerables a nivel genético, especialmente para determinar qué genes se alteran para controlar la enfermedad, ya que este método se utiliza principalmente para la determinación fenotípica. Además, este método se limita a determinar exactamente qué sustratos patógenos causan inflamación o aumentan la permeabilidad de los intestinos de los gusanos durante la infección. Por lo tanto, se requieren más estudios en profundidad, incluida la investigación del mecanismo genético molecular utilizando bacterias y nematodos mutantes, así como el análisis de componentes químicos de bacterias, para evaluar completamente la función de las bacterias y los productos químicos para determinar la permeabilidad intestinal.

Después de la incubación con P. aeruginosa PAO1, C. elegans mostró un aumento significativo en la fluorescencia FITC-dextran en el cuerpo del gusano en comparación con la fluorescencia mostrada después de la incubación con las otras dos cepas bacterianas(Figura 1). Las intensidades de fluorescencia de los gusanos alimentados con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 y E. faecalis KCTC3206 fueron de 100,0 a 6,6, 369,7 a 38,9 y 105,6 a 10,6%, respectivam...

Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.

Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Este método será útil para estudios biológicos básicos relacionados con la interacción entre la microbiota intestinal y la salud intestinal. Además, Este protocolo se puede utilizar para la detección de posibles probióticos y nutracéuticos para curar problemas de salud intestinal, como síndrome intestinal con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales. Este protocolo utiliza un sistema de imágenes de alto rendimiento para permitir un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C.elegans tratados con diversas bacterias y productos químicos.Recomendamos que un científico que no esté familiarizado con esta técnica limite el número de muestras para evitar el etiquetado incorrecto y otros errores. Este procedimiento consta de muchos pasos que requieren demostración visual, como la transferencia de gusanos a placas de 96 pozos y el uso de la máquina Operetta, así como el software Harmony. Comience preparando 500 mililitros de medio LB estéril.Inocular una sola colonia de P.aeruginosa en el medio, e incubar el cultivo durante 14 a 15 horas a 37 grados celsius mientras se agita a 150 rpm. Al día siguiente, distribuya uniformemente el cultivo bacteriano en dos tubos de 500 mililitros, y centrifugarlos a 3, 220 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Retire el sobrenadante, dejando 25 mililitros en cada tubo, para un volumen restante total de 50 mililitros, luego resuspender el pellet bacteriano.Almacene el cultivo bacteriano a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar. Para probar los efectos de las bacterias en la permeabilidad intestinal de C.elegans, retire los cultivos del refrigerador, y vórtice a fondo. Agregue un total de 800 microlitros a cada placa NGM fresca, y deje que las placas se sequen en una incubadora de 20 grados Celsius durante la noche.Para preparar las placas DIM, agregue 50 mililitros de medio de agar NGM en una botella de caldo de DIM que contenga caldo NGM, y mezcle bien. Luego, vierta 20 mililitros del medio en cada plato Petri de 90 por 15 milímetros. Prepare las placas DMSO añadiendo 20 mililitros de DMSO que contengan el medio NGM a cada plato Petri, y deje las placas a temperatura ambiente durante al menos tres horas para solidificarse.Esparza 800 microlitros de cultivo de E.coli o P.aeruginosa con vórtice en cada placa NGM fresca, y deja que las placas se sequen en una incubadora de 20 grados Celsius durante la noche. Lave las larvas L4 sincronizadas por la edad con S-buffer y transfiera aproximadamente 500 gusanos a las placas NGM que contienen diferentes bacterias y productos químicos. Luego, incuba las placas a 20 grados centígrados durante 48 horas.Prepare las placas suplementadas con FITC-dextran mezclando dos mililitros de E.coli termoactivado con cuatro miligramos de FITC-dextran. Agregue 100 microlitros de la mezcla a cada una de las 20 placas de agar NGM frescas, y deje que las placas se sequen durante una hora en un banco de laboratorio limpio. Después de 48 horas de tratamiento, lave los gusanos con S-buffer, transfieralos a placas suplementadas con FITC-dextran y a placas NGM sin FITC-dextran, e incubar las placas durante la noche.Al día siguiente, lave los gusanos con S-buffer y déjelos arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante una hora. Agregue 50 microlitros de 4%formaldehído a cada pozo de una placa negra de 96 bien, de fondo plano, y transfiera aproximadamente 50 gusanos a cada pozo. Después de uno a dos minutos, retire todo el formaldehído y agregue 100 microlitros de medio de montaje en cada pozo.El formaldehído es un producto químico tóxico y debe manipularse con cuidado. Para capturar imágenes fluorescentes, pulse el icono Abrir tapa dentro del software de imágenes e inserte la placa en la máquina. Haga clic en Configuración, seleccione el tipo de placa y agregue los canales brightfield y EGFP.Para ajustar el diseño, vaya a la selección Diseño y seleccione Seguimiento. Establezca la primera imagen en un micrómetro, el número de planos a 10 y la distancia a un micrómetro. Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura, y pulse Probar en la sección Ejecutar experimento.Si las imágenes son satisfactorias, vuelva a la sección Configuración y pulse el icono Restablecer. A continuación, seleccione todos los pozos de destino y un número adecuado de campos de captura. Vaya a Ejecutar experimento, introduzca el nombre de la placa y pulse Inicio.Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección Análisis de imagen, introduzca la imagen y busque la celda eligiendo el canal EGFP y el método B.Ajuste los parámetros según las direcciones del manuscrito y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración. Para obtener un mapa de calor y una tabla de datos, vaya a la sección Evaluación y ajuste el parámetro de lectura y, a continuación, inicie la evaluación.C.elegans mostró un aumento significativo de la fluorescencia FITC-dextran después de la incubación con P.aeruginosa en comparación con las otras dos cepas bacterianas, lo que indica que P.aeruginosa causó más daño vital a la barrera intestinal epitelial y mayor permeabilidad intestinal. P.aeruginosa vivo e inactivado por calor desencadenó efectos muy diferentes sobre la permeabilidad intestinal en C.elegans. Tras la inactivación del calor, tanto las imágenes de fluorescencia como los datos estadísticos indican que P.aeruginosa no desencadenó toxicidad para los nematodos.Un co-tratamiento de 48 horas con DIM disminuyó significativamente la intensidad de fluorescencia FITC-dextran dentro de las tripas de los gusanos expuestos a P.aeruginosa, lo que demuestra que DIM puede considerarse un buen producto natural para curar la disfunción de la permeabilidad intestinal causada por infecciones bacterianas. Es importante recordar que durante la preparación de las placas recubiertas FITC-dextran, es necesario minimizar la exposición a la luz debido a la sensibilidad a la luz de FITC-dextran. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos patógenos y probióticos de las bacterias intestinales y sus componentes activos mediante la prueba de las bacterias, así como su composición química.

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Este video presenta un método para visualizar y medir la integridad de la luz intestinal de C. elegans alimentando gusanos con dextrano marcado con FITC. El protocolo de ejemplo muestra el ensayo realizado con gusanos tratados con 3,3'-diindolilmetano (DIM) y alimentados con patógenos.

Alimentación con dextrano FITC: un método para cuantificar la permeabilidad intestinal en C. elegans

Fuente: Anderson, Q. L., et al. Un patosistema de C. elegans de alto rendimiento, alto contenido y base líquida. J. Vis. Exp. (2018)El video demuestra un ensayo a base de líquido donde las larvas de C. elegans modificadas genéticamente se exponen a bacterias patógenas en una microplaca. Las toxinas bacterianas secretadas en el medio inducen el estrés y la muerte del huésped. Un tinte fluorescente tiñe los gusanos muertos, lo que permite la cuantificación de la mortalidad basada en imágenes para...

Evaluación de la mortalidad inducida por bacterias patógenas en larvas de C. elegans

Fuente: Taylor, M. N., et.al. Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones entre Caenorhabditis elegans y bacterias. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra la exposición de gusanos Caenorhabditis elegans libres de gérmenes y de la misma edad a una cepa bacteriana para la colonización intestinal. Explica la eliminación selectiva de bacterias externas y no adheridas, dejando solo bacterias viables adheridas al epitelio intestinal para su cuantificación.

Evaluación de la colonización bacteriana intestinal en C. elegans libre de gérmenes

Fuente: Le, T. A. N. , et al., Medición de los efectos de bacterias y químicos sobre la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra un ensayo basado en fluorescencia para cuantificar la permeabilidad intestinal en C. elegans expuesto a Pseudomonas aeruginosa. En comparación con los controles alimentados con Escherichia coli, los gusanos tratados con patógenos muestran una mayor fuga de fluoróforos hacia la cavidad corporal, lo que indica daño en...

Evaluación de la permeabilidad intestinal en C. elegans tras la exposición bacteriana

Un ensayo de huevo-en-gusano (EIW) es un método útil para cuantificar el comportamiento de puesta de huevos. Las alteraciones de la postura de huevos pueden ser una respuesta de comportamiento del organismo...

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

Se describe un protocolo básico para evaluar la toxicidad de productos químicos en un animal modelo, elegans de Caenorhabditis. El método es conveniente y útil para el desarrollo de productos farmacéuticos, así como para la evaluación del riesgo de diversos contaminantes ambientales.

Medir el efecto de productos químicos sobre el crecimiento y reproducción de Caenorhabditis elegans

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

Los efectos trans y multigeneracionales de los productos químicos persistentes son esenciales para juzgar sus consecuencias a largo plazo en el medio ambiente y en la salud humana. Proporcionamos métodos detallados novedosos para estudiar los efectos trans y multigeneracionales utilizando nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans.

Uso de Caenorhabditis elegans para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.

Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un ensayo para cuantificar la tasa de alimentación de Caenorhabditis elegans basado en la medición del aclaramiento de bacterias en cultivo líquido.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Aprende a medir la permeabilidad intestinal en Caenorhabditis elegans usando un sistema de imagen de alto rendimiento. Este método permite evaluar efectos de bacterias y productos químicos en la salud intestinal.

Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes

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