Name: Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a evaluar la función cardíaca in vitro usando cardiomiocitos pielados de biopsias congeladas. Este método permite analizar la función de miofilamentos y sensibilidad al calcio para estudiar enfermedades cardíacas.

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Los autores agradecen a la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT), a la Unión Europea, al Quadro de Referencia Estratégico Nacional (QREN), a Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) y a la unidad de investigación Factores Operacionales de Competitividad (COMPETE) por financiar la unidad de investigación UnIC (UID/IC/00051/2013). Este proyecto cuenta con el apoyo de FEDER a través de COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalizao (POCI), el proyecto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), apoyado por el programa operativo regional Norte Portugal (NORTE 2020), en el marco del acuerdo de colaboración Portugal 2020, a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), el proyecto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), apoyado por los Fondos Estructurales y de Inversión Europeos, el programa operativo regional de Lisboa 2020. Patrícia Rodrigues fue financiada por FCT (SFRH/BD/96026/2013) y Joao Almeida-Coelho fue de la Universidade do Porto/FMUP y FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programación Operacional Operación Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Dorais).

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<li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li>
<li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflicto de intereses.

La evaluación in vitro de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados representa una técnica importante para aclarar las modificaciones que se producen a nivel de cardiomiocitos en contextos fisiológicos (por ejemplo, estiramiento) y patológicos (por ejemplo, isquemia). Esta metodología tiene varias ventajas como exigir una cantidad mínima de miocardio para evaluar la función en cardiomiocitos obtenidos a partir de muestras descongeladas; utilizando cardiomiocitos de una amplia gama de especies (ratones13, rata1,14,15, conejo16, cerdo17, perro18, conejillo de indias19 y humano20) y diferentes lugares cardíacos, incluyendo las aurículas, ventrículos izquierdo y derecho o una región específica del corazón infarto. Además, esta técnica permite la entrega de concentraciones específicas de Ca2+ y energía (ATP) mientras mide la función de las estructuras regulatorias y contráctiles en su configuración nativa.
A pesar de la simplicidad de esta técnica, hay algunos pasos críticos. Es esencial garantizar la calidad de cada paso desde el principio, incluida la recogida de muestras. Las proteínas de miofilación son susceptibles a las proteasas21. Por lo tanto, es obligatorio almacenar las muestras en nitrógeno líquido inmediatamente después de su recogida. Las muestras frescas, que no estaban previamente congeladas, desarrollarán fuerzas significativamente más altas, por lo que no es aconsejable mezclar la medición realizada en muestras frescas y congeladas en el mismo protocolo. El segundo paso más crítico es la extracción de los cardiomiocitos. Durante este procedimiento, es crucial mantener la muestra sobre hielo la mayor parte del tiempo. Se puede utilizar un cóctel inhibidor de la proteasa para reducir el riesgo de degradación de proteínas durante la extracción/permeabilización22. En tercer lugar, las muestras deben cortarse en trozos más pequeños utilizando movimientos precisos del bisturí, ya que observamos cardiomiocitos de calidad reducida cuando se descartó este paso. Otro paso crítico es lavar los cardiomiocitos ya que es difícil tener el equilibrio adecuado entre lavar Tritón (permeabiliza la célula pero promueve su desencolado) y mantener tantas células en el sobrenadante como sea posible. Es importante probar primero la extracción y el número de lavados para cada muestra, especie o protocolo. Por ejemplo, en nuestras manos, observamos que las extracciones de tejido de rata obesos ZSF1 tienen un aspecto "graso", lo que hizo que estas células fueran más resbaladizas durante el encolado, pero no más difíciles de medir. La forma en que eludimos este problema fue realizando más experimentos para tener un número razonable de células por animal. Además, es crucial seleccionar una buena celda para pegar, a saber, con buena estrías y longitud razonable. Si el cardiomiocitos no tiene estas características, en su mayoría se desprenderá de las puntas de la aguja o desarrollará una fuerza baja o nula. También es importante utilizar el pegamento correcto para la fijación de cardiomiocitos, teniendo en cuenta el tiempo de encolado y su eficacia para pegar la célula a la aguja. En nuestras manos, el pegamento de silicona (Tabla de Materiales) cura rápido (10-15 min) y lo suficientemente fuerte. Finalmente, el último paso crítico está relacionado con levantar cuidadosamente el cardiomiocitos 5 min después de pegar la célula (para evitar pegar la célula al cubreobjetos) y antes de moverla a los pozos (para evitar que la célula sea arrastrada por la etapa del microscopio). La Tabla 7 resume la solución de problemas asociada con esta técnica, sus causas subyacentes y las posibles soluciones para superar problemas frecuentes.
La principal limitación de este método es que no puede responder a todas las preguntas relacionadas con la contractilidad de miofilament, como la rapidez con la que se activan/desactivan los miofilamentos. En el entorno in vivo, la despolarización de membrana, el aumento intracelular de Ca2+ y su difusión a misofilamentos deben ocurrir para que los miocitos se contraigan, mientras que en cardiomiocitos despellejados Ca2+ difusión a misofilamentos se produce inmediatamente cuando la célula está sumergida en la solución Ca2+. Esta velocidad más rápida de difusión de Ca2+ sesgará miofilamentos de activación / desactivación23.
Estos experimentos están influenciados por diferentes factores, incluyendo la temperatura, el pH de la solución, la perturbación mecánica (slack-re-stretch vs. slack) y los procedimientos de fijación de celdas (pin tie vs. glue), todas estas variables que tienen en cuenta las discrepancias de la literatura en términos de ktr y el aumento dependiente de la longitud de los sarcomere en la fuerza4,12.
El progreso futuro de la técnica incluye la realización de estudios funcionales en intacto en lugar de cardiomiocitos permeabilizados. Esta técnica tiene la desventaja de depender de cardiomiocitos recién aislados (no previamente congelados). Otra cuestión importante que no está directamente relacionada con esta metodología, pero que puede afectar significativamente a ella está relacionada con el período máximo de almacenamiento congelado de muestras. Específicamente, es obligatorio establecer el grado de degradación del miofilamento a lo largo del tiempo de almacenamiento (es decir, durante cuánto tiempo se pueden almacenar muestras congeladas con el fin de asegurar datos funcionales de buena calidad derivados de los cardiomiocitos extraídos).

Tradicionalmente, la evaluación de las propiedades mecánicas del miocardio se ha intentado principalmente en preparaciones multicelulares, tales como músculos papilares y trabeculae1,2. Las tiras de músculos cardíacos multicelulares incluyen una población heterogénea de células, incluyendo cardiomiocitos contráctiles con un patrón desconocido de orientación y generación de fuerza, actividad eléctrica y distribuciones de estrés/deformación, así como una matriz de tejido conectivo circundante3,4. Una preparación sin colágeno y que contenga un solo cardiomiocitos permitiría medir la longitud de los sarcomos y las propiedades contráctiles de puente cruzado de una manera muy precisa y controlada5,6. Por lo tanto, en las últimas cuatro décadas, se desarrollaron varias metodologías que permitieron investigar las propiedades mecánicas, contráctiles y de relajación de un solo cardiomiocitos6,7. La función contráctil de estas células depende en gran medida de la longitud de los sarcomos y de la cinética ciclista de puente cruzado3. Por lo tanto, es deseable investigar la función muscular directamente en células cardíacas aisladas individuales, teniendo en cuenta que permite evaluar la longitud y el rendimiento de los sarcomos, así como la función de puente cruzado y las propiedades contráctiles. Sin embargo, aislar y conectar cardiomiocitos funcionales con una resolución de sarcomere óptico razonable, mientras que la medición de la fuerza de grabación a nivel de N sigue siendo difícil y evoluciona3,6. Otros desafíos son la logística que debe instalarse para aislar los cardiomiocitos de las biopsias recién recolectadas. La imprevisibilidad de la recolección de biopsias humanas, por ejemplo, puede poner en peligro la viabilidad de los experimentos.
Además, las preocupaciones éticas relativas a la sustitución, reducción y refinamiento de la experimentación animal para procedimientos científicos (principios de los 3R) han promovido cambios de estudio a nivel celular y tisular, preferiblemente en biopsias humanas, o en muestras de animales más pequeños. De hecho, un refinamiento progresivo de las metodologías para evaluar la función cardíaca in vitro en un nivel más pequeño de complejidad permite una adecuada integración de los resultados a todo el cuerpo y traducirlos al escenario clínico7. En conjunto, el uso de muestras almacenadas a -80 oC para extraer cardiomiocitos puede ser una alternativa atractiva.
El tejido miocárdico se corta en trozos pequeños y se homogeneiza con un mortero y un pestillo. El resultado de esta homogeneización es una suspensión de células agrupadas y aisladas con diferentes grados de daño sarcolemmal, en la que el mioplasmo se expone al medio de baño y se lavan todos los componentes celulares. Se conservan estructuras como las miofibrils que están más lejos del sarcolemma. Así, el acortamiento de los sarcomos y las propiedades funcionales asociadas con el aparato miofibrilar se mantienen intactas y se pueden registrar8,9.
El sistema de medición de la fuerza del cardiomiocitos consiste en un motor electromagnético, utilizado para ajustar la longitud de los cardiomiocitos, y un transductor de fuerza, que mide la contracción isométrica del cardiomiocitos. Un cardiomiocitos permeabilizado o despellejado se coloca en una cámara experimental que contiene una solución relajante ([Ca2+] < 10 nM) y está pegado al silicio a 2 agujas delgadas: una unida al motor y la otra al transductor de fuerza. Un sistema óptico se utiliza para determinar la morfología de los cardiomiocitos y la longitud de los sarcomeres. El protocolo experimental a menudo consiste en una serie de grabaciones de fuerza sobre soluciones tampón que contienen diferentes concentraciones de Ca2+, la determinación de la cinética de puente cruzado de actina-miosina y la medición de la tensión pasiva de los cardiomiocitos montados a longitudes de sarcomer predefinidas (Figura 1). El aislamiento de cardiomiocitos permeabilizados a partir de muestras miocárdicas congeladas en nitrógeno líquido (y almacenadas posteriormente a -80 oC) es una técnica que utiliza mecánica celular y bioquímica de proteínas para medir la fuerza máxima de Ca2+activada (activa) por área transversal (Tactivo,kN-m-2),Ca2 +Tensión independiente (pasiva) (Tpasiva,kN-m-2), miofilamentos Ca2+-sensibilidad (pCa50),miofilamentos cooperatividad (nHill), la tasa de reurbanización de fuerza (ktr) así como las dependencias de longitud de sarcomere de Tactivo, Tpasivo,pCa50, nHill y ktr.
El objetivo de este protocolo es ilustrar y resumir el potencial del sistema de medición de la fuerza cardiomiocitos como un procedimiento fiable para evaluar las propiedades mecánicas funcionales de los cardiomiocitos de una sola piel aislados de muestras congeladas de diferentes especies.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Sigma</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sódico sódico hidratado (Na2ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de calcio (CaCO3)</td><td>Merck</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2.6H2O)</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio (MgCl2 1M)</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Bis(2-hidroxietil)taurina (BES)</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina disódica sal hidrato (Na2PCr)</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Merck</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiónico (C3H6O2)</td><td>Merck</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de compresión de silicona</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Tritiplex (EGTA)</td><td>Merck</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>Triton&reg; X-100 10%</td><td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos (GKH GT Motor Control)</td><td>Terre Haute Glas-col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Length Controller (Modelo 315C-I)</td><td>Transductor de Fuerza Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Modelo 403 A)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ASI 600A</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sotware VSL (Modelo 900B)</td><td></td> Microscopio invertido Aurora Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>(IX51)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación in vitro de la función cardíaca usando cardiomiocitos pielados

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

En este artículo, describimos los pasos necesarios para aislar un solo cardiomiocito permeabilizado ("piel") y conectarlo a un aparato de medición de fuerza y un motor para realizar estudios funcionales. Estos estudios permitirán medir la rigidez cardiomiocitos (fuerza pasiva) y su activación con diferentes soluciones que contienen calcio (Ca2+)para determinar, entre otros: desarrollo de fuerza máxima, sensibilidad a miofilamento Ca2+(pCa50),cooperatividad (nHill) y la tasa de reurbanización de fuerza (ktr). Este método también permite determinar los efectos de los fármacos que actúan directamente sobre los miofilamentos y de la expresión de proteínas recombinantes exógenas en las propiedades activas y pasivas de los cardiomiocitos. Clínicamente, los estudios de cardiomiocitos despellejados ponen de relieve la fisiopatología de muchas enfermedades miocárdicas y permiten la evaluación in vitro del impacto de las intervenciones terapéuticas dirigidas a los miofilamentos. En conjunto, esta técnica permite la clarificación de la fisiopatología cardíaca mediante la investigación de correlaciones entre parámetros in vitro e in vivo en modelos animales y tejido humano obtenido durante la cirugía de corazón abierto o trasplante.

Este protocolo tiene como objetivo describir paso a paso la técnica de extracción y evaluación de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados. Esta metodología permite la medición y la agudomodulación de la función de miofilamento utilizando pequeñas biopsias congeladas que se pueden recoger de diferentes lugares cardíacos, desde ratones hasta hombres.

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Esta técnica permite clarificar la fisiopatología de las enfermedades cardíacas a través de la investigación de la correlación entre los parámetros in vitro e in vivo en modelos animales y humanos. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la función del miofilamento profundo utilizando biopsias muy pequeñas o muestras que se almacenaron congeladas. Esta técnica permite evaluar in vitro el impacto de las intervenciones terapéuticas sobre los miofilamentos.Antes de intentar un experimento, es aconsejable practicar la extracción de cardiomiocitos unas cuantas veces para aprender a seleccionar, pegar y activar los cardiomiocitos con buen tamaño, estrías y forma. Antes de comenzar el procedimiento, ajuste la temperatura del aparato de prueba en la cámara a 15 grados centígrados y encienda el transductor de fuerza y el motor. Descongele de tres a cinco microgramos de muestra miocárdica en una placa de Petri que contenga 2,5 mililitros de solución ISO relajante y use un bisturí para cortar con precisión el tejido en trozos pequeños sin causar daño celular innecesario.Cuando se haya cortado todo el tejido, use una punta de pipeta cortada para transferir todo el volumen de solución y fragmentos de tejido a un vaso Potter-Elvehjem y use un molinillo para interrumpir mecánicamente el tejido a 30 a 40 rotaciones por minuto. Cuando se haya obtenido una buena suspensión celular, agregue 250 microlitros de Triton a un tubo de 15 mililitros que contenga 2,25 mililitros de ISO relajante y agregue la suspensión celular a la solución resultante. Invierta suavemente el tubo tres veces para mezclar y deje reposar el tubo a temperatura ambiente durante un minuto, seguido de una incubación de cuatro minutos en hielo.Al final de la incubación del hielo, aumente el volumen final del tubo a 15 mililitros con ISO relajante adicional y mezcle los tubos tres veces por inversión como se demuestra, luego centrifugue las celdas, luego elimine con cuidado casi todo el líquido excepto los últimos tres mililitros del sobrenadante. Después del último lavado, retire el sobrenadante hasta un volumen de cinco a 10 mililitros de suspensión celular. Para la selección de cardiomiocitos con piel, agregue una gota de suspensión celular en un cubreobjetos colocado encima de un portaobjetos de vidrio en un soporte de portaobjetos de microscopio invertido y use el objetivo 20X para seleccionar un solo cardiomiocito en forma de bastón con un buen patrón de estría y tamaño.Use las dos manos para girar el cubreobjetos hasta que el cardiomiocito seleccionado se coloque horizontalmente con sus extremos alineados con la aguja del transductor de fuerza y el motor, y use una punta de pipeta para colocar una línea delgada de pegamento a lo largo del costado del cubreobjetos. Para pegar la célula en su lugar, sumerja las puntas de la aguja del transductor de fuerza y el motor en la línea de pegamento para crear un halo de pegamento alrededor de ambas puntas y mueva rápidamente la punta de la aguja del transductor de fuerza hacia abajo para que se pegue a un borde del cardiomiocito. Repita este procedimiento con la punta del motor y la otra extremidad de la célula.Después de cinco a ocho minutos, mueva ambos micromanipuladores simultáneamente para levantar las agujas unos 15 micrómetros para evitar pegar la celda al cubreobjetos. Para medir las fuerzas activas y pasivas y la sensibilidad al calcio, llene el primer pocillo experimental con 55 a 100 microlitros de solución relajante y llene el segundo pocillo experimental con 55 a 100 microlitros de solución activadora. Con el software de la cámara, establezca la región de interés en un área del cardiomiocito con un patrón claro de estrías y establezca la longitud del sarcómero en 2,2 micrómetros.Mida la distancia entre los dos extremos del cardiomiocito y registre el valor como la longitud del miocito dentro del software. A continuación, mueva las agujas un poco más arriba y mueva suavemente la platina del microscopio para que la célula pase del cubreobjetos al pocillo que contiene la solución relajante en la parte posterior de la platina. Seleccione el protocolo que contiene dos acortamientos celulares que ocurrirán cuando la célula emerge secuencialmente en las soluciones de calcio y relajación.Para provocar una contracción isométrica, mueva la platina del microscopio de modo que el cardiomiocito pase de la solución relajante a la activadora. Al llegar a la meseta de fuerza, comience a registrar los datos de fuerza. Después de 10 segundos, cambie la celda a la solución relajante y registre los datos hasta que se detenga la prueba.Para determinar la sensibilidad al calcio, reemplace la solución activadora con 55 a 100 microlitros de cada solución de calcio y registre los datos como se acaba de demostrar. Al final de la medición, estire las puntas del transductor de fuerza y el motor para quitar las agujas de la celda y use un hisopo de algodón empapado en acetona para eliminar con cuidado el halo de pegamento de las puntas de la aguja. Aunque se espera un cierto grado de deterioro y disminución de la fuerza después de experimentos prolongados, los valores de tensión activa dentro de los cardiomiocitos permeabilizados funcionales deberían ser relativamente estables.Aquí, se muestran trazas de fuerza representativas de tres de los ocho registros de fuerza necesarios para llevar a cabo un protocolo de sensibilidad al calcio del miofilamento. Al transferir la célula a un pocillo que contiene la solución activadora, los cardiomiocitos comienzan a desarrollar fuerza hasta que alcanzan una meseta. Después de una prueba rápida de holgura, se pueden obtener los valores de referencia de fuerza cero.La pendiente de la última parte de esta curva se puede utilizar para determinar el valor de la tasa de redesarrollo de fuerzas, que es una medida de la tasa aparente de unión y desconexión de puentes cruzados. Después de transferir la célula de nuevo a un pozo que contiene la solución relajante, la célula se relaja y su fuerza disminuye. Además de la sensibilidad al calcio del miofilamento y las mediciones de activación dependientes de la longitud, se pueden calcular las dependencias de la longitud del sarcómero de la tensión pasiva y las dependencias de la longitud del sarcómero de la fuerza activada por calcio por área de sección transversal y la tensión independiente del calcio.Por último, es importante tener en cuenta que la forma en que se aíslan los cardiomiocitos impacta significativamente en los resultados. El uso de cardiomiocitos skinned para evaluar la función cardíaca in vitro es una técnica importante para aclarar los cambios que se producen a nivel celular, así como para estudiar los mecanismos de los miofilamentos en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Este método tiene la ventaja de requerir una cantidad mínima de muestra miocárdica y permitir el uso de cardiomiocitos de una amplia gama de especies, localizaciones cardíacas y patologías.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

El epicardio es una fuente esencial de células progenitoras cardiovasculares multipotentes y factores paracrinos que son necesarios para el desarrollo y la regeneración cardiovascular. Describimos aquí un método para cultivar células epicárdicas embrionarias de ratón.

Cultivo in vitro de células a partir de epicárdicos del corazón de embriones de ratón

Aquí, se muestra la generación de tejido del corazón ingeniería humana a partir de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) derivada de los cardiomiocitos. Se presenta un método para analizar la fuerza de contracción y la alteración ejemplar de patrón de contracción por el hERG inhibidor del canal E-4031. Este método muestra alto nivel de robustez y la idoneidad para la detección de drogas cardíaco.

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Presentamos un modelo de cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos, junto con un método para la evaluación cuantitativa del daño tisular causado por la isquemia. Este modelo puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades cardíacas isquémicas.

Modelo de cardiopatía isquémica y comparación basada en vídeo de la contracción de cardiomiocitos utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSC

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de...

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

El análisis de los cambios en la función contráctil y la integridad celular de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC es de inmensa importancia para el desarrollo de fármacos no clínicos. Un sistema híbrido de análisis celular de 96 pocillos aborda ambos parámetros en tiempo real y de manera fisiológica para obtener resultados confiables y relevantes para el ser humano, necesarios para una transición segura a las etapas clínicas.

Sistema de análisis de células híbridas para evaluar cambios estructurales y contráctiles de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC para la evaluación preclínica del riesgo cardíaco

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.

Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aquí, demostramos un método no invasivo de evaluación de contractilidad de dispositivos médicos cardíacos utilizando monocapas 2D de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM), chapadas en un sustrato flexible, junto con microscopía basada en video. Esta herramienta será útil para la evaluación in vitro de las propiedades contráctiles de los dispositivos de electrofisiología cardíaca.

Evaluación de la terapia de modulación de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos derivados de células madre humanas 2D

Aprende a evaluar la función cardíaca in vitro usando cardiomiocitos pielados de biopsias congeladas. Este método permite analizar la función de miofilamentos y sensibilidad al calcio para estudiar enfermedades cardíacas.

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

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