Name: Detección de transcripciones de ARN de proteína antisentido (VIH-1) de proteína antisentido (VIH-1) en pacientes por RT-PCR específico de Hebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a detectar ARN antisentido específico del VIH-1 mediante RT-PCR con cebadores biotinilados y desnaturalización térmica. Este método permite identificar la proteína ASP como nuevo antígeno terapéutico.

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Agradecemos a Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick y Matthieu Perreau por estar siempre disponibles para discutir nuestro trabajo y todas las personas en el Laboratorio de Inmunopatógenos del SIDA por su valiosa asistencia técnica. También nos gustaría dar las gracias a John y Aaron Weddle de VSB Associated Inc. que contribuyeron con excelentes obras de arte. Por último, muchas gracias especiales a todos los pacientes, sin los cuales este trabajo no habría sido posible. Este trabajo no recibió ninguna subvención específica de ninguna agencia de financiación.

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Hospitalario Universitario Vaudois (CHUV).
1. Infección de células mononucleares de sangre periférica (PPBCM) con cepaVIH-1 HXB2
<ol><li>
Día 1: ESTIMULACION DE PBMCs
	<ol>
<li>Aísle los PBL de un abrigo buffy de donante saludable.</li>
		<li>Contar y resuspender pbMUCs a una concentración de 1x106/ml en el medio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (R-10), con adición de 50 U/ml de interleucina-2 (IL-2) y 3-g/mL fitohahina(PHAglutin).</li>
		<li>Pipet hacia arriba y hacia abajo y divida las células en dos placas de seis pocillos (3 ml de suspensión/pozo de la célula).</li>
		<li>Incubar durante 3 días a 37oC y 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 3: INFECCIÓN POR PBMCs NOTA: Utilice una de las dos placas como en el paso 1.1.3 como control negativo (no infecte estas células). ADVERTENCIA: Realizar todo el procedimiento en un laboratorio de nivel III de bioseguridad (P3).<ol>
<li>Piscina PBMCs de una placa en un tubo de halcón de 50 ml y centrífuga a 300 x g durante 10 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 2,2 ml de R-10 que contengan 20 U/ml de IL-2 y 2 g/ml de polibreno.</li>
		<li>Viales de descongelación que contengan el virusVIH-1 HXB2 y añada 1,8 ml de suspensión viral (0,376 ng/L) a las células.</li>
		<li>Incubar las células durante 2 h a 37 oC, girando suavemente el tubo cada 30 minutos.</li>
		<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda las células a 1x106/mL en R-10 que contiene IL-2 (50 U/mL).</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a una placa de 24 pocillos a una concentración de 1 ml/pozo e incubar durante 5 días a 37oC y 5%CO2.</li>
		<li>Cosecha 1 pozo cada día y transfiere las células al tubo de 1,5 ml (etiquetado con el día de la infección). NOTA: Antes de la centrifugación, transfiera 150 ml de suspensión celular a un tubo de citometría de flujo para el control de calidad de la infección por PMAC (ver paso 1.3)</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 400 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Congele los gránulos celulares a -80 oC hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Infección por PBMCs: control de calidad
	<ol>
<li>Para cada día de infección, recoja 150 ml de PHC infectados y transfiéralos a un tubo de citometría de flujo.</li>
		<li>Añadir 1 ml de solución salina con fosfato (PBS) y centrífuga a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y agregue 50 ml de PBS que contenga 1 l de tinte vivo/muerto Aqua (previamente diluido 1:10 con PBS).</li>
		<li>Incubar a 4oC durante 15 min.</li>
		<li>Añadir 1 ml de PBS, centrífuga a 400 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 250 s de solución de fijación/permeabilización e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 1 ml de 1x Tampón Perm/Lavado (10x solución en stock que contenga FBS y saponina diluida 1:10) y centrifugar a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y agregue 50 l de PBS que contenga el anticuerpo conjugado conistiocianato de fluoresceína (FITC) conoceinato (FITC) conocuente de HIV Gag p24.</li>
		<li>Incubar durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 1 ml de PBS, centrífuga a 400 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 150 l de x CellFIX (solución de stock 10x que contiene 10% formaldehído, 3,55% metanol, 0,93% azida sódica diluida 1:10) y analizar las células por citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Estimulación de células T CD4+ humanas con anticuerpos anti-CD3/CD28
<ol><li>Aísle los glóbulos T CD4+ de los PPC de pacientes infectados por el VIH-1 y donantes sanos.</li>
	<li>Preparar la mezcla de anticuerpos humanos anti-CD3/CD28 diluyendo anti-CD3 (1:100) y anti-CD28 (1:50) en PBS.</li>
	<li>Recubrir una placa de 48 pocillos añadiendo 200 ml de mezcla de anticuerpos por pocto a un número adecuado de pozos e incubar a 37 oC durante 2 horas.</li>
	<li>Aspirar la solución de anticuerpos y añadir 1 ml de células CD4+T a 1x106/mL a los pozos recubiertos con anticuerpos anti-CD3/CD28. NOTA: Estimule las células T CD4+ hasta 5 días.</li>
</ol>3. Transcripción inversa
NOTA: Para obtener imprimaciones específicas del paciente, el ADN proviral aislado de las células CD4+T de cada paciente se amplificabó utilizando imprimaciones VIH-1HXB2 Pan ASP. Las imprimaciones específicas del paciente se diseñaron utilizando la secuencia proviral interna de las imprimaciones Pan ASP. Todas las imprimaciones y sondas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 2.
<ol><li>
Aislar el ARN total de las células
	<ol>
<li>Cuantifique el ARN y elimine la contaminación del ADN mediante el tratamiento de muestras con DNase.</li>
		<li>Realizar reacciones RT en un volumen de 50 l. Transfiera 0,1-1 ág de ARN total a un número apropiado de pozos de una placa PCR de 96 pocillos. Prepare la mezcla de ARN añadiendo los siguientes componentes al ARN: 5 l de imprimación inversa ASP biotinylatada (20 m) 2,5 l de trifosfatos de desoxinucleótido (dNTP) (10 mM) 25 l de agua destilada tratada con dietlpirpirinato (DEPC) (dH2O). Preparar los controles ENDógenos de RT añadiendo 5 l de agua libre de nucleasas en lugar de la imprimación inversa ASP biotinilada.</li>
		<li>Coloque la placa PCR de 96 pocillos en un termociclador y caliente la mezcla de ARN a 94 oC durante 5 min.</li>
		<li>Enfriar inmediatamente la mezcla de ARN en agua helada durante al menos 1 min.</li>
		<li>Prepare la mezcla de reacción añadiendo los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml (calcule el número total de muestras más 1): 10 l de búfer RT de 5x 2,5 l de 0,1 M de 1,4 ditiothreitol (TDT) 2,5 l de RNase (40 unidades/L) 2,5 l de enzima RT (200 unidades/L)</li>
		<li>Transfiera 17,5 l de esta mezcla a cada uno de los pozos que contienen ARN. Prepare los controles RT-menos reemplazando la transcriptasa inversa por 2,5 l de agua libre de nucleasas.</li>
		<li>Mezcle suavemente e incubar la placa a 55 oC durante 60 minutos utilizando un termociclador.</li>
		<li>Inactivar las reacciones calentando a 70oC durante 15 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Purificación de afinidad de ADNC biotinilado ASP
NOTA: No purifique las reacciones RT menos.
<ol><li>Preparar 1 L de 2tampón de lavado/unión que contenga 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y 2 M NaCl. Filtre la solución.<ol>
<li>Prepare 50 ml de 1 búfer de lavado/unión con agua de grado PCR.</li>
		<li>Para cada reacción, utilice 10 ml de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina. En función del número de reacciones, transfiera un volumen adecuado de perlas a un tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Lave las perlas añadiendo un volumen igual de 2x tampón de lavado/unión y vórtice durante 15 s.</li>
		<li>Coloque el tubo en un estante de separación magnética e incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas y agregue el mismo volumen de lavado/unión 2x tampón que el volumen inicial de cuentas.</li>
		<li>Vortex para 30 s y transferir 10 l de la suspensión de perlas a un número adecuado de tubos de 1,5 ml.</li>
		<li>Coloque los tubos en un estante de separación magnética e incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y agregue 50 s de tampón 2x de lavado/unión.</li>
		<li>Añadir 50 l de ADNc biotinilado a los tubos correspondientes que contengan las perlas.</li>
		<li>Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente girando suavemente.</li>
		<li>Separe las perlas del sobrenadante por un estante de separación de imán durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave las perlas añadiendo 200 s de 1 tampón de lavado/unión. Coloque los tubos en un estante de separación de imanes durante 3 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Repita dos veces.</li>
		<li>Resuspenda las perlas en 10 l de agua de grado PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PCR estándar
NOTA: El objetivo de la PCR estándar es amplificar todo el ORF del gen ASP. A continuación, los productos de amplificación se clonan en plásmido pCR2.1 para desarrollar curvas estándar para la cuantificación de ARN ASP mediante PCR en tiempo real (véase el párrafo PCR en tiempo real).
<ol><li>Realizar PCR estándar en un volumen total de 50 l. Preparar un volumen apropiado de mezcla maestra de PCR (número de muestras más 1). Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml: 1 l de imprimaciones ASP de 10 m (adelante y atrás) 1 L de 10 mM de dNtPs Cloruro de magnesio (MgCl2) (la concentración depende de las imprimaciones utilizadas) dH2O a un volumen final de 49 l<ol>
<li>Mezcle bien, gire rápidamente el contenido y transfiera 49 l/bien de la mezcla maestra de PCR a una placa PCR de 96 pocillos.</li>
		<li>Vórtice cuidadosamente los tubos que contienen las perlas utilizadas para la purificación de afinidad ASP cDNA para 15 s.</li>
		<li>Añadir 1 l de perlas en los pozos correspondientes y ejecutar la PCR utilizando el siguiente programa: 95 oC durante 2 min, 40 ciclos de 95 oC para 30 s, 55 oC para 30 s, y 68 oC para 40 s, luego 68 oC durante 7 min.</li>
		<li>Separe los productos pcR en un gel de agarosa del 1 %, corte las bandas y clone los productos amplificados en plásmido pCR2.1.</li>
		<li>Secuenciar y analizar las secuencias de cada clon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR)
NOTA: Desarrolle imprimaciones y sondas específicas para cada paciente utilizando el enfoque descrito en el paso 3 "Transcripción inversa". Para qPCR incluir diluciones de plásmido ASP para curvas estándar. Los plásmidos que contienen plaquitas específicas para el paciente se desarrollan como se menciona en la nota al comienzo del paso 5 "PCR estándar".
<ol><li>Prepare la curva estándar utilizando diluciones seriales de plásmido 1:10 ASP a partir de 3 x 106 copias/ l hasta 3 copias/ L.<ol>
<li>
PCR de primera ronda (preamplificador). Realizar reacciones en un volumen total de 25 l. Preparar un volumen adecuado de mezcla maestra de PCR (número de muestras más 1). Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml: 0,5 l de mezcla de imprimación DE ASP o env (concentración final de 0,2 m cada una) (adelante y atrás) 0,5 l de mezcla de dNTP (concentración final 0,2 mM cada uno) MgCl2 (la concentración depende de los pares de imprimación) dH2O a un volumen final de 24 l</li>
		<li>Transfiera 24 l de mezcla maestra de PCR a un número adecuado de pozos de una placa PCR de 96 pocillos.</li>
		<li>Reórse cuidadosamente los tubos que contienen las perlas con el ADNc durante 15 s.</li>
		<li>Añadir 1 l de perlas a los pozos correspondientes. Haga lo mismo con las diluciones de plásmido.</li>
		<li>Ejecute el PCR utilizando el siguiente algoritmo: desnaturalización durante 2 min a 95 oC ; 30 s a 95oC, 30 s a 55oC, 40 s a 68oC para 18 ciclos; extensión a 68 oC durante 7 min.</li>
		<li>Diluir las reacciones de los PRIMEROS PCR 1:5 con agua de grado PCR.</li>
		<li>
Segunda ronda qPCR. Realizar reacciones en un volumen total de 20 l. Preparar un volumen adecuado de mezcla maestra de PCR (número de muestras más 1). Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml: 1.8 imprimaciones de 1,8 M 10 m (adelante y atrás) 1 l de sonda de 5 m 6,2 l de dH2O</li>
		<li>Transfiera 19 l de mezcla maestra qPCR a un número apropiado de pozos de una placa qPCR de 96 pocillos y agregue 1 l de las reacciones de PCR de primera ronda diluidas a los pozos correspondientes. Haga lo mismo con las diluciones de plásmido.</li>
		<li>Ejecuta el qPCR con el siguiente algoritmo: desnaturalización durante 10 min a 95 oC; 15 s a 95oC, 1 min a 60oC durante 40 ciclos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

En este informe describimos un ensayo RT específico de hebra aplicado a la detección de ARN ASP en células T CD4+ aisladas de individuos infectados con VIH-1. La aparición de cebado no específico durante RT dificulta la detección de transcripciones de ARN con la polaridad derecha, lo que lleva a una interpretación errónea de los resultados. Grupos anteriores han desarrollado varias estrategias destinadas a prevenir la síntesis de ADNc independiente de imprimación durante la reacción RT. Etiquetar la imprimación inversa e...

El gen de la proteína antisentido (ASP) es un marco de lectura abierto (ORF) situado en la cadena negativa del gen de sobre de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), que abarca la unión gp120/gp411. En los últimos 30 años, varios informes han demostrado que el gen del VIH ASP es de hecho transcrito y traducido2,3,4,5,6,7,8,9. Aunque las transcripciones antisentido ASP se han caracterizado completamente in vitro,hasta hace poco faltaba información sobre la producción real de ARN ASP en pacientes.
La secuencia de ASP es inversa y complementaria a env. Esto representa un obstáculo importante al intentar detectar transcripciones para ASP. Los métodos estándar de reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) utilizan imprimaciones antisentidos específicas genéticas para sintetizar los ADN complementarios (CNNAs) de la polaridad derecha. Este enfoque, sin embargo, no permite determinar la orientación (sentido o antisentido) de la plantilla inicial de ARN, ya que las horquillas o bucles de ARN pueden preparar RT en ambas direcciones en ausencia de imprimaciones10,un fenómeno conocido como autocebado RT. La mayoría de los investigadores de ASP desvían el problema de la autocebación RT utilizando imprimaciones etiquetadas con secuencias que no están relacionadas con HIV-111,12. Esta estrategia, sin embargo, no elimina la ocurrencia del fenómeno, y puede conducir a la posible prórroga de los CDNa no específicos en el PCR11.
Recientemente hemos desarrollado un nuevo ensayo RT-PCR específico de hebra para el estudio del ARN antisentido y lo hemos utilizado para la detección de ARN ASP en una cohorte de seis pacientes infectados por el VIH, como se muestra en la Tabla 1. El procedimiento descrito a continuación ha sido publicado previamente por Antonio Mancarella et al.13. En nuestro protocolo, evitamos la producción de CDNA no específicos mediante un enfoque dual. En primer lugar, eliminamos las estructuras secundarias de ARN desnaturalizando el ARN a alta temperatura (94 oC) y, en segundo lugar, invertimos el ARN ASP mediante una imprimación biotinilada específica de ASP y purificamos la afinidad del ADNC resultante. Con este enfoque, somos capaces de amplificar sólo nuestro ADNc objetivo, ya que se impide que otros productos RT no específicos se generen (desnaturalización a alta temperatura del ARN) o se eliminen antes de la PCR (purificación de afinidad).

<table><tbody><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v1.1 Kit de secuenciación de ciclo</td><td>Biosystem aplicado, Thermo Fisher Scientific</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set (100 mM)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Célula T CD4+ humana Kit de aislamiento</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Biowest</td><td>S1010-500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de solución de fijación/permeabilización</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo de citometría de flujo HIV Gag p24 - Kc57-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>6604665</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 Humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-743</td><td></td></tr><tr><td>Lectina de Phaseolus vulgaris (PHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61764-1MG</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas amarillas fijables, para excitación de 405 nm</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>L34967</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD28</td><td>Becton Dickinson</td><td>55725</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD3</td><td>Becton Dickinson</td><td>55329</td><td></td></tr><tr><td>Imprimadores y Sondas</td><td>ADN Integrado Tecnologías (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Platino Taq ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene Reactivo de infección / transfección</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medio</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Biosistema aplicado, Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Invitrogen de transcriptasa inversa</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Mezcla maestra de expresión génica</td><td>Biosistema aplicado, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>4369016</tr><tr><td>Kit de clonación TOPO TA para subclonación, con células de E. coli químicamente competentes One Shot TOP10</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>K450001</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNasa (2 U/&micro; L)</td> <td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific 4375786</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección de transcripciones de arn de proteína antisentido (vih-1) de proteína antisentido (vih-1) en pacientes por rt-pcr específico de hebra

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

En retrovirus, la transcripción del antisentido se ha descrito tanto en el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) como en el virus t-linfotrópico humano 1 (HTLV-1). En HIV-1, el gen ASP de proteína antisentido se encuentra en la cadena negativa de env, en el marco de lectura -2, que abarca la unión gp120/gp41. En la orientación del sentido, el extremo de 3' del marco de lectura abierto ASP se superpone con las regiones hipervariables gp120 V4 y V5. El estudio del ARN ASP se ha visto frustrado por un fenómeno conocido como RT-autocebado, por el que las estructuras secundarias de ARN tienen la capacidad de primar RT en ausencia de la imprimación específica, generando cDNAs no específicos. El uso combinado de alta desnaturalización de ARN con imprimaciones inversas biotiniadas en la reacción RT, junto con la purificación de afinidad del ADNc sobre cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina, nos ha permitido amplificar selectivamente el ARN ASP en células T CD4+ derivadas de individuos infectados con VIH-1. Nuestro método es relativamente bajo costo, fácil de realizar, altamente confiable y fácilmente reproducible. En este sentido, representa una poderosa herramienta para el estudio de la transcripción antisentido no sólo en el VIH-1, sino también en otros sistemas biológicos.

La desnaturalización del ARN a alta temperatura acoplada a la purificación de afinidad de ADNc biotintilado evita la amplificación de productos ASP no específicos durante la PCR en PPBPc infectados in vitro y en células T CD4+ aisladas de pacientes. Se ha demostrado que el autocebado RT se produce durante la transcripción inversa de los ARN antisentido10,14,15,16,<sup class=...

Las horquillas y bucles de ARN pueden funcionar como imprimaciones para la transcripción inversa (RT) en ausencia de imprimaciones específicas de secuencia, interfiriendo con el estudio de transcripciones antisentido superpuestas. Hemos desarrollado una técnica capaz de identificar el ARN específico de las hebras, y lo hemos utilizado para estudiar la proteína antisentido VIH-1 ASP.

Detección de transcripciones de ARN de proteína antisentido (VIH-1) de proteína antisentido (VIH-1) en pacientes por RT-PCR específico de Hebra

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Los RT-PCR convencionales no permiten la discriminación entre las secuencias de sentido y anti-sentido cuando se utilizan para detectar ARN codificados por genes superpuestos. Este protocolo permite detectar ARN específicamente antien sentido. El uso de imprimaciones biotiliadas junto con altas temperaturas de desnaturalización del ARN permite la amplificación de los ARN antientales, evitando la formación de productos RT no específicos.Hemos utilizado este método para demostrar que ASP ya sea como un ARN anti-sentido o un precursor de proteínas, es un nuevo antígeno vih, lo hace potencialmente un nuevo objetivo de VIH para la terapia. Este método se puede aplicar a cualquier sistema, en el que se pueden detectar ARN antien sentido de genes superpuestos. Comience diseñando imprimaciones específicas para pacientes utilizando la secuencia de ADN pro-viral interna de las imprimaciones PanASP.A continuación, cuantifique el ARN y elimine la contaminación del ADN mediante el tratamiento de muestras con DNase. Transfiera entre 0,1 y un microgramo de ARN total a los pozos apropiados en una placa PCR de 96 pozos. A continuación, configure la transcripción inversa, o reacción RT, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Prepare los controles RT endógenos añadiendo cinco microlitros de agua libre de nucleasas en lugar de la imprimación inversa ASP. Ponga la placa en el termociclador y caliente el ARN a 94 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, refrésquelo inmediatamente en agua helada durante al menos un minuto.Preparar la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros como se describe en el manuscrito de texto, luego transferir 17,5 microlitros a cada uno de los pozos que contienen ARN. La desnaturalización del ARN debe realizarse a 94 grados centígrados. Sin desnaturalización total, pueden producirse síntesis de productos no específicos a partir del ARN de detección, lo que conduce a la amplificación de los ARN no específicos.Mezclar el contenido de los pozos suavemente e incubar la placa a 55 grados Celsius durante 60 minutos. Luego, inactivar las reacciones calentando la placa a 70 grados Celsius durante 15 minutos. Prepare un litro de tampón de lavado y encuadernación 2X de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y filtre la solución.A continuación, prepare 50 mililitros de tampón de lavado y unión 1X con agua de grado PCR. Transfiera el número adecuado de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina a un tubo de 1,5 mililitros y lávelos añadiendo un volumen igual de tampón de lavado y unión 2X y vórtice el tubo durante 15 segundos. Coloque el tubo en un bastidor de separación magnética e in incubarlo durante tres minutos a temperatura ambiente.A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar las perlas y agregue el mismo volumen del tampón de lavado y unión 2X que el volumen inicial de las perlas. Vórtice las perlas durante 30 segundos y transfiera 10 microlitros de la suspensión a un número adecuado de tubos de 1,5 mililitros. Coloque los tubos en el bastidor de separación magnética e incubarlos durante tres minutos a temperatura ambiente.A continuación, deseche el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de lavado y unión 2X. Añadir 50 microlitros de ADNc biotilatada a los tubos correspondientes con las perlas e incubarlos durante 30 minutos mientras gira suavemente. Después de la incubación, coloque los tubos en el bastidor de separación magnética durante tres minutos y luego lave las perlas con 200 microlitros de tampón de lavado y unión 1X, seguido de una incubación de tres minutos en el bastidor de separación.Deseche el sobrenadante y repita el lavado dos veces. Luego, resuspender las cuentas en 10 microlitros de agua de grado PCR. Preparar un volumen apropiado de PCR Master Mix de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Mezclar bien y girar rápidamente hacia abajo, a continuación, transferir 49 microlitros por pozo a una placa PCR de 96 pozos. Atrafirque cuidadosamente los tubos con el ADNc purificado durante 15 segundos y añada un microlitro de la suspensión a los pozos correspondientes. Ejecute el PCR y separe los productos en un gel de 1% de agarosa.Cortar las bandas del gel y clonar los productos amplificados en un plásmido PCR 2.1. A continuación, secuencia los clones y analiza cada secuencia. Las reacciones RT iniciales se realizaron con la imprimación antien sentido regular no biotilada y dieron lugar a una amplificación exitosa de ASP.Sin embargo, también se amplificó una banda con el mismo peso molecular y controles de imprimación menos. Para evitar este problema, la imprimación antien sentido específica fue etiquetada con biotón y el ADNn anti-detección resultante fue purificado antes de PCR. Esto hizo posible amplificar la secuencia ASP con una contaminación muy reducida del ADNc no específico en los controles de imprimación menos.La optimización adicional de este método se logró mediante la desnaturalización completa del ARN a 94 grados centígrados antes de RT, seguido de un enfriamiento inmediato en el agua helada, lo que dio lugar a una amplificación efectiva de la banda ASP y no hay productos no específicos. Se midió la cinética del ARN ASP y se aislaron las células CD4 de tres sujetos VIH positivos con viremia detectable y la ausencia de terapia tras la estimulación con anti-CD3/CD28. La cuantificación del ARN ASP también fue posible en pacientes sometidos a TAR, con viremia no detectable.En dos de cada tres pacientes, el ARN ASP se detectó en niveles bajos a los tres a cinco días después de la estimulación. Se analizaron dos pacientes para ASP y ENv RNAs, uno sin tratar y otro tratado. Para el paciente no tratado, ambos ARN podrían ser detectados.Para el paciente tratado, ASP y env fueron apenas detectables después de varios días de estimulación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la desnaturalización linealiza el ARN para que se destruyan las estructuras secundarias capaces de primar rt. Mientras que, el lavado de las cuentas elimina los cDNAs no biotilidades.Después de la purificación de los cDNAs con la polaridad correcta, qPCR se puede realizar para analizar la expresión génica. Además, los cDNAs también se pueden clonar y utilizar para el análisis de secuencias. Este método permite estudiar genes superpuestos en orientación opuesta y puede ser útil para dilucidar la regulación y la patogénesis de una bacteria y una enfermedad relacionada con el virus, incluidos algunos tipos de cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Tropismo del VIH se puede deducir de la región V3 de la envoltura viral. V3 es amplificada por PCR en triplicado, utilizando RT-PCR, secuencia, e interpretados mediante el software bioinformático. Las muestras con con la secuencia de 1 o más (s) con calificaciones bajas G2P son clasificados como no-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Varios fluoro-2'-aptámeros de ARN del VIH-1BA-L con gp120 nanomol afinidad están aisladas de la biblioteca de ARN...

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

Cuantificación de los niveles de ARN VIH-1 en plasma y la secuencia única de VIH-1 genomas de las personas con cargas virales por debajo del límite de detección (50-75 copias / ml) es difícil. Aquí se describe cómo extraer y cuantificar el ARN viral en plasma utilizando un ensayo de PCR en tiempo real que mide de manera fiable ARN VIH-1 a partir de 0,3 copias / ml y la forma de amplificar el genoma viral mediante secuenciación del genoma individual, a partir de muestras con cargas virales muy...

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Pruebas de resistencia a los medicamentos para el VIH-1 en individuos infectados no respondían al tratamiento antirretroviral (ART) puede guiar futuras terapias y mejorar los resultados del tratamiento. Optimización de los resultados de salud individual y poblacional en la alta prevalencia del VIH, sino entornos con recursos limitados, en última instancia requerirá genotipado resistencia a los medicamentos asequibles y accesibles y los métodos de interpretación.

Un método de monitoreo asequible VIH-1 Resistencia a los medicamentos para los entornos con recursos limitados

La presencia de VPH de alto riesgo en el tejido del tumor de cabeza y cuello se asocia con resultados favorables. El ARN recientemente desarrollada en la técnica de hibridación in situ llamado RNAscope permite la visualización directa de HPV E6/E7 mRNA en secciones de tejido FFPE.

RNAscope para<em&gt; In situ</em&gt; Detección de transcripcionalmente activo Virus del Papiloma Humano en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

La competencia de crecimiento entre virus casi isogénicos proporciona una medida sensible para determinar la aptitud relativa para la replicación. Los protocolos descritos aquí incluyen la construcción de clones recombinantes de VIH-1, la propagación del virus y la competencia de crecimiento y métodos de análisis optimizados para producir resultados sensibles y consistentes.

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

Provided es un protocolo para desarrollar un ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real para cuantificar la concentración inicial de muestras de ADN utilizando un termociclador o un microscopio y calentador de etapa. También se describe el desarrollo de un control positivo interno. Se proporcionan scripts para procesar datos de fluorescencia sin procesar en tiempo real.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

Aquí presentamos un enfoque de secuenciación profunda que proporciona una determinación imparcial de naciente 3'-termini, así como perfiles mutacionales de moléculas de ADN monocatenario. La principal aplicación es la caracterización de los nacientes DNAs complementarios retrovirales (cADN), los intermedios generados durante el proceso de transcripción inversa retroviral.

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Aprenda a detectar ARN antisentido específico del VIH-1 mediante RT-PCR con cebadores biotinilados y desnaturalización térmica. Este método permite identificar la proteína ASP como nuevo antígeno terapéutico.

Detección de transcripciones de ARN de proteína antisentido (VIH-1) de proteína antisentido (VIH-1) en pacientes por RT-PCR específico de Hebra (Video) | JoVE Journal

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