Name: Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a analizar el transporte y la morfología mitocondrial en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas para estudiar la paraplejia espástica hereditaria y otras enfermedades neurodegenerativas.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Paraplejia Espástica, la Fundación Blazer y la NIH (R21NS109837).

1. Generación de neuronas glutamatérgicas telencéfalas a partir de ISCs
NOTA: El protocolo detallado para mantener los iPSC y su diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas son similares a los descritos anteriormente18. Aquí, se introduce y resalta el proceso crítico durante la diferenciación de células madre pluripotentes humanas.
<ol><li>IPSCs de cultivo en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en un medio de células madre embrionarias humanas (hESC) complementados con factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF, 4 ng/mL).</li>
	<li>Después de la incubación con dosis (1 mg/ml) durante 3 min, disociar los IPSC en pequeños grumos. A continuación, cultivo de los agregados iPSC en suspensión en el medio hESC durante 4 días. Consulte este punto de tiempo, cuando los iPSC comienzan como el cultivo de suspensión, como el día 1 (D1). Cambie el medio diariamente durante 4 días.</li>
	<li>En D5, recoja los agregados iPSC después de la centrifugación a 200 x g durante 2 min y el cultivo en medios de inducción neuronal (NIM) durante 3 días. Cultivo de los agregados de celda en suspensión durante 3 días cambiando la mitad de los medios cada 2 días. Agregue DMH-1 (2 m) y SB431542 (2 m) al medio NIM para aumentar la eficiencia de inducción neuronal.</li>
	<li>En D8, recoja los agregados iPSC después de la centrifugación a 200 x g durante 2 min y déjelos adherirse a 6 placas de pozo (alrededor de 20-30 agregados por pozo de la placa) mediante el cultivo en NIM con 10% FBS (o con placas recubiertas de laminina) durante la noche. Al día siguiente, retire el medio antiguo y cambie a NIM cada 2 días hasta D17. NOTA: La generación de células neuroepiteliales, que se indica mediante la formación de células columnares con estructuras de roseta, se observa en este período.</li>
	<li>En D17, aislar mecánicamente las células neuroepiteliales en el centro de las colonias (levantar directamente aplicando una pequeña presión al centro de las colonias) o enzimáticamente (tratada con dispensa). Transfiera las células neuroepiteliales aisladas al matraz T25 de cultivo t25 no tratado que contiene 8 ml de NIM con adición de B27 (1x), campo (1 m) e IGF (10 ng/ml). NOTA: El cultivo de suspensión permite a las células formar neuroesferas enriquecidas con progenitores neuronales de proyección cortical.</li>
	<li>Después de D35, placa las neuroesferas en la poliornitina y lDEV libre de factor de crecimiento reducido matriz de membrana sótano(Tabla de materiales)platos de fondo de vidrio recubiertos 35 mm para generar neuronas glutamatérgicas telencéfalas (neuronas de proyección cortical). Antes del revestimiento, disociar las neuroesferas a pequeños racimos incubando con 1 mg/ml de solución de desprendimiento celular durante 2 min a 37oC.</li>
	<li>Retire la solución de desprendimiento celular por centrifugación y resuspenda en 1 ml de medio de diferenciación neuronal (NDM). Células de placa en el plato inferior de vidrio (alrededor de cinco racimos en 100 s de medio por plato) para dejarlas acoplar. A continuación, agregue NDM (1 mL por plato) y el cultivo de las células en NDM que contienen B27 (1x), cAMP (1 m), IGF (10 ng/mL), hBDNF (10 ng/mL) y GDNF (10 ng/mL). NOTA: Los pequeños racimos están chapados porque sobreviven bien y dan lugar a neuronas de proyección larga. Alternativamente, las células se pueden disociar y chapar a una densidad alrededor de 20.000 células por plato para una mejor separación.</li>
	<li>Caracterizar las neuronas glutamatérgicas telencéfalas inmunomanchando los marcadores Tbr1 y III-tubulina.</li>
</ol>2. Examen del transporte mitocondrial a lo largo de axones de neuronas glutamatérgicas telencéfalas
<ol><li>Caliente el NDM y encienda la incubadora para el microscopio de fluorescencia a 37oC y 5%CO2.</li>
	<li>Para visualizar las mitocondrias a lo largo de los axones de las neuronas forebrain, incubar las neuronas con un tinte fluorescente rojo de 50 nM a las mitocondrias de manchas en células vivas (por ejemplo, MitoTracker CMXRos) en NDM durante 3 min a 37 oC. A continuación, lave las células 2veces con NDM caliente. Las neuronas se incuban en NDM.</li>
	<li>Para grabar el transporte mitocondrial a lo largo de los axons, tome imágenes de lapso de tiempo del movimiento mitocondrial utilizando el objetivo 40x con un microscopio de fluorescencia. NOTA: Para estabilizar el cultivo, realice la imagen de células vivas cuando las células se incuban en la incubadora durante 20 minutos después de la tinción mitocondrial.</li>
	<li>En el campo de fase, identificar los axons en función de las características morfológicas (directamente emergen del cuerpo de las células neuronales, neurites largos delgados constantes sin ramificación). Las mitocondrias se mueven en anterogrado (del cuerpo celular al axón distal) y direcciones retrógradas (desde el terminal axonal hasta el cuerpo celular). Para distinguir la dirección del movimiento mitocondrial a lo largo de los axons, identifique claramente los cuerpos celulares de las neuronas. En este paso, enfoque axons en el campo de fase para reducir el fotoblanqueo.</li>
	<li>Después de distinguir el cuerpo celular y el axón, ajuste el tiempo de exposición y el enfoque de las mitocondrias en los axones. A continuación, capturar el transporte de las mitocondrias dentro de los axons cada 5 s para una duración total de 5 min, produciendo 60 fotogramas. Captura aleatoriamente al menos cinco ubicaciones para cada plato y repite 3 veces para cada grupo.</li>
</ol>3. Análisis de datos del transporte mitocondrial y morfología en neuronas corticales
NOTA: Analizar los datos recogidos sobre el transporte mitocondrial utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ o MetaMorph19). Dado que ImageJ está fácilmente disponible, realice el análisis del transporte mitocondrial y la morfología utilizando ImageJ con los plugins MultiKymograph, Macrosy Analyze particles.
<ol><li>Análisis del transporte mitocondrial con ImageJ<ol><li>Después de capturar las imágenes de lapso de tiempo de la motilidad mitocondrial, analiza la velocidad y el movimiento de las mitocondrias usando el plugin MultiKymograph. Las imágenes se guardan como archivos de formato .tiff, que son analizados por el software de Fiji siguiendo un método reportado previamente20.</li>
		<li>Descargue el software Fiji. Descarga plugins que serán necesarios para analizar la velocidad de movimiento mitocondrial de los kymographs. Descargue el paquete de formatos biológicos y kymograph Plugin junto con estos cuatro plugins .class, incluidos: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class y WalkingAverage.class (Tabla de materiales). Mueva estos archivos a la carpeta de plugins de Fiji. Descargue los plugins "tsp050706.txt" en la carpeta plugins. Reinicie el software Fiji cuando los archivos se muevan a la carpeta de plugins.</li>
		<li>Abra el software Fiji. Elija pluginsy, a continuación, importe imágenes de la serie .tiff a través de Bio-Formats Importer en Bioformatos. Asegúrese de elegir Standard ImageJ en Stack viewing, elija Open all series, marque Autoscaley, a continuación, haga clic en OK . Tome nota del número de fotograma y el tamaño de las imágenes en píxeles, que se muestran en la parte superior de la imagen. NOTA: Tome 60 fotogramas por imagen.</li>
		<li>Considere la posibilidad de hacer las imágenes más claras ajustando el brillo/contraste en el menú Imagen para los 60 fotogramas.</li>
		<li>Haga clic con el botón derecho del botón derecho en la herramienta de línea para elegir la línea segmentada y dibuje una línea segmentada a partir del cuerpo de la celda y terminando en el axón terminal. Genere el kymograph eligiendo MultipleKymograph en Plugins. La selección del ancho de línea se solicita después de elegir el MultipleKymograph. Asegúrese de que este es un número impar. Elija 1 para el ancho de línea. Después de este paso se genera un kymograph. NOTA: Se pueden leer varias piezas importantes de información del kymograph. El eje Y del kymograph es el tiempo de duración (5 min) para los 60 fotogramas. El eje x representa la posición de los axones seleccionados.</li>
		<li>Utilice una línea diagonal en el kymograph para determinar la dirección de movimiento de las mitocondrias (anterogradas, retrógradas o estables). Por ejemplo, una línea que baja a la derecha a lo largo del eje Y indica un movimiento anterogrado, y una línea que baja a la izquierda a lo largo del eje Y indica un movimiento retrógrado. Una línea vertical indica que no hubo movimiento en el mitocondrion.</li>
		<li>Mida la distancia, los valores de tiempo y la velocidad de las mitocondrias en movimiento utilizando el plugin Macros en el software Fiji. Ir a Plugins ? Macros de la página de macros de la Instalar ? tsp050607.txt. Dibuje una línea segmentada sobre el rastro del movimiento mitocondrial en el cimagrafo, y siempre dibuje la línea de la región superior a inferior (eje y).</li>
		<li>Después de dibujar la línea, vaya a Plugins Macros de la página de macros de la leer las velocidades de tsp. Puesto que se dibuja una línea segmentada a lo largo del trazado, el plugin lee las velocidades segmentadas correspondientes a la línea. NOTA: La unidad para todos los datos es píxeles. dy sum es el tiempo consumido desde el punto de partida, y dx sum indica la distancia del mitocondrion moviéndose en el eje X. dy now y dx ahora muestra el período de tiempo y la distancia de movimiento para cada segmento, respectivamente. velocidad real muestra la velocidad para cada segmento (dx now/dy now). la velocidad media indica la velocidad media para el movimiento mitocondrial (suma dx/suma de dy).</li>
		<li>Cambie la unidad de dx ahora de píxel a m como la proporción de píxeles en m midiendo la barra de escala. Convierta la unidad para la distancia de píxel a m midiendo las barras de escala en las imágenes. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de la barra de escala y medir la longitud de la línea seleccionando Medir' en "Analizar. Cambia el tiempo de píxel a segundos, como 1 píxel a 5 segundos en este experimento.</li>
		<li>En el archivo de hoja de cálculo, calcule la velocidad media y etiqueta el movimiento retrógrado o anterogrado correspondientemente. Promedio de la velocidad de movimiento anterograda o retrógrada.</li>
		<li>Determinar el porcentaje de mitocondrias estacionarias y móviles a partir del kymograph. Las mitocondrias móviles anterogradas o retrógradas se definen como moviéndose 5 m hacia adelante o hacia atrás desde el origen durante todo el período21. Las mitocondrias se consideran estacionarias si no se movieron más de 5 m durante los 5 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la morfología mitocondrial utilizando ImageJ NOTA: Determine la morfología mitocondrial mitocondrial midiendo la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto utilizando ImageJ. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.<ol>
<li>Para analizar la longitud mitocondrial y el área dentro de los axons, descargue el plugin Straighten_.jar desde el sitio web de ImageJ (consulte Tabla de materiales)y muévalo a la carpeta de plugins. Reinicie el software ImageJ.</li>
		<li>Abra la imagen a través de la función abrir en Archivo y convierta la imagen de 32 bits a 8 bits usando Tipo en Imagen.</li>
		<li>Dibuja una línea segmentada a lo largo de los axons. Elija Enderezar en Plugins y establezca 50 píxeles para Anchura de filamento/Línea ancha. Esto generará un axón enderezado.</li>
		<li>Ajustar el umbral en Imagen y establecer la medida en Analizar seleccionando "Area ? Perímetro de la página de perímetro de la Ajustar la elipse ? Descriptores de forma.</li>
		<li>Mida la barra de escala utilizando la función de línea y establezca la escala en Analizar rellenando la distancia en píxeles,conocer la distanciay la unidad de longitud. A continuación, elija Global para establecer esta configuración de escala.</li>
		<li>Utilice Analizar partículas en Analizar para determinar el área. Los parámetros de la solicitud son el tamaño (píxel 2) a 0,20–infinito, la circularidad de 0,00 a 1,00 y se muestran a las elipses. Seleccione Mostrar resultados. NOTA: La medición producirá los resultados de múltiples parámetros de morfología mitocondrial, incluidos el área, los perímetros, la longitud (mayor), la anchura (menor) y la relación de aspecto (AR). También se muestra el número mitocondrial correspondiente.</li>
		<li>Calcule el número mitocondrial por axón (m) utilizando el número mitocondrial dividido por la longitud axonal.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+robust+method+for+automated+analysis+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+%3A+EBJ%22%5BJournal%5D)">A fast and robust method for automated analysis of axonal transport.</a> European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).</li>
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</ol>

Los autores no declaran intereses financieros en competencia.

Este artículo describe un método para analizar el transporte mitocondrial y la morfología en axones neuronales utilizando tinte fluorescente rojo y software ImageJ, que proporcionan una plataforma única para estudiar la degeneración axonal y la morfología mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas. Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluyendo la tinción de las mitocondrias, la creación de imágenes de células vivas y el análisis de las imágenes. En este método, se utilizó un tinte fluorescente para manchar l...

La motilidad mitocondrial y la distribución juegan un papel vital en el cumplimiento de las demandas energéticas variables y especializadas en las neuronas polarizadas. Las neuronas pueden extender axónes extremadamente largos para conectarse con objetivos a través de la formación de sinapsis, que exigen altos niveles de energía para Ca2+ amortiguación y corrientes ióndas. El transporte de mitocondrias de soma a axón es fundamental para apoyar la función axonal y sináptica de las neuronas. El movimiento mitocondrial dinámica espacial y temporal se lleva a cabo mediante un transporte axonal rápido a velocidades de varios micrómetros por segundo1.
Específicamente, las proteínas motoras o adaptadoras, como la cinaína y la dinanina, participan en el transporte rápido de orgánulos a lo largo de los microtúbulos para controlar el movimiento de las mitocondrias2,3. La actividad neuronal normal requiere el transporte adecuado de las mitocondrias recién ensambladas desde el soma neuronal al axón distal (transporte axonal anterogrado) y el transporte inverso de mitocondrias desde el axón distal de vuelta al cuerpo celular (transporte retrógrado). Estudios recientes han indicado que la asignación mitocondrial inadecuada está fuertemente asociada con defectos neuronales y enfermedades degenerativas de neuronas motoras4,5. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración, es importante establecer métodos para examinar el movimiento mitocondrial a lo largo de los axons en cultivos vivos.
Hay dos desafíos principales en el examen y análisis del seguimiento de las mitocondrias: (1) identificar las mitocondrias desde el fondo en cada fotograma, y (2) analizar y generar las conexiones entre cada fotograma. Para resolver el primer desafío, se utiliza ampliamente un enfoque de etiquetado de fluorescencia para distinguir las mitocondrias del fondo, como el tinte MitoTracker o la transfección de la proteína de orientación mitocondrial fusionada con fluorescencia (por ejemplo, mito-GFP)6,7,8. Para analizar la asociación entre fotogramas, en estudios anteriores9se han descrito varios algoritmos y herramientas de software. En un artículo reciente, los investigadores compararon cuatro herramientas automatizadas diferentes (por ejemplo, Volocity, Imaris, wrMTrck y Difference Tracker) para cuantificar el transporte mitocondrial. Los resultados mostraron que, a pesar de las discrepancias en la longitud de la pista, el desplazamiento mitocondrial, la duración del movimiento y la velocidad, estas herramientas automatizadas son adecuadas para evaluar la diferencia de transporte después del tratamiento10. Además de estas herramientas, un plugin integrado "Macros" para ImageJ (escrito por Rietdorf y Seitz) ha sido ampliamente utilizado para analizar el transporte mitocondrial11. Este método genera kymographs que se pueden utilizar para analizar el movimiento mitocondrial, incluyendo la velocidad en direcciones anterogradas y retrógradas.
Las mitocondrias son orgánulos altamente dinámicos que cambian constantemente en número y morfología en respuesta a condiciones fisiológicas y patológicas. La fiscalidad mitocondrial y la fusión regulan estrechamente la morfología mitocondrial y la homeostasis. El desequilibrio entre la fission mitocondrial y la fusión puede inducir redes mitocondriales extremadamente cortas o largas, lo que puede afectar la función mitocondrial y dar lugar a actividades neuronales anormales y neurodegeneración. El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están implicados en diversas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la paraplejia espástica hereditaria (HSP)12,13,14,15. El HSP es un grupo heterogéneo de trastornos neurológicos hereditarios caracterizadopor la degeneración del tracto corticoespinal y la posterior falta de control de los músculos inferiores de las extremidades16,17. En este estudio, las neuronas forebrain derivadas de iPSC se utilizan para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en HSP. Este método proporciona un paradigma único para examinar la dinámica mitocondrial de los axons neuronales en cultivos vivos.

<table><tbody><tr><td>Solución de desprendimiento de células Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Campana de bioseguridad</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 SERIES A2</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)</td><td>Centrífuga Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R/ </td><td></td>75004261</tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>AMP cíclico (cAMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Selleckchem</td><td>S7146</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco con mezcla de nutrientes F12 (DMEM/F12)</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16141-002</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2, bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex Factor de crecimiento reducido sin LDEV Matriz de membrana basal</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>Gem21 NeuroPlex Suplemento sin suero</td><td>Gemini</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio de 9''</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado de glial (BDNF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento insulínico 1 (IGF1)</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Gibco</td><td>A31815</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos No Esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 N2 NeuroPle Sin Suero Suplemento</td><td>Gemini</td><td>400-163</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX83</td><td>Olympus</td><td>IX83-ZDC2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase</td><td>Olympus</td><td>CKX41/ IX2-SLP</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-ornitina (poliornitina))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SB431542 Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío desechable estéril de 50 ml 0.22 &mu; m Millipore Express&reg; Plus Membrana</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 &mu; M PVDF</td><td>Millipore SCGVU10RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo Tbr1 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Gibco</td><td>17075029</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 50 ml</td><td>Phenix</td><td>SS-PH50R</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 ml</td><td>Phenix</td><td>SS-PH15R</td><td></td></tr><tr><td>Matraces T25 (sin tratar)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td><fuerte> Plugins para softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-formats Package</td><td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kymograph Plugin</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultipleKymograph.class<</td><td>a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultipleOverlay.class<</td><td>a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WalkingAverage.class</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>StackDifference.class<</td><td>a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straighten_.jar</td><td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tsp050706.txt</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Las neuronas tienen intensas demandas de alta energía con el fin de apoyar sus funciones. Se ha observado un deterioro del transporte mitocondrial a lo largo de los axones en las neuronas humanas, que puede contribuir a la neurodegeneración en varios estados de la enfermedad. Aunque es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos, estos paradigmas son críticos para estudiar el papel de las mitocondrias en la neurodegeneración. Aquí se describe un protocolo para analizar el transporte mitocondrial y la morfología mitocondrial en axónicos de neuronas forebrain derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Los IPSCse se diferencian en neuronas glutamatérgicas telencéfalas utilizando métodos bien establecidos. Las mitocondrias de las neuronas están manchadas con MitoTracker CMXRos, y el movimiento mitocondrial dentro de los axones se captura mediante un microscopio de imágenes de células vivas equipado con una incubadora para el cultivo celular. Las imágenes de lapso de tiempo se analizan utilizando software con plugins "MultiKymograph", "Bioformat importer" y "Macros". Se generan kymographs de transporte mitocondrial, y la velocidad mitocondrial promedio en las direcciones anteroógradas y retrógradas se lee en el kymograph. En cuanto al análisis de morfología mitocondrial, la longitud mitocondrial, el área y la relación de aspecto se obtienen utilizando el ImageJ. En resumen, este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axons y el análisis de su morfología para facilitar los estudios de enfermedades neurodegenerativas.

Aquí, los IPSC humanos se diferenciaron en neuronas glutamatérgicas telencéfalas, que se caracterizaban por inmunostaining con marcadores de tubulina Tbr1 y III(Figura 1A). Para examinar el transporte axonal de las mitocondrias, estas células se teñían con un tinte fluorescente rojo y se realizaban imágenes de lapso de tiempo. Dado que ImageJ está fácilmente disponible y es más fácil de obtener, el transporte mitocondrial se analizó más a fondo con los plugins "MultiKymograp...

El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad neurodegenerativa.

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

La disfunción mitocondrial subyace a muchas enfermedades neurodegenerativas. Nuestro protocolo proporciona una herramienta importante para examinar la dinámica mitocondrial en los axones, facilitando el estudio de enfermedades neurológicas que implican la degeneración axonal. Mediante la combinación de etiquetado mitocondrial, imágenes de células vivas y tecnología de células madre pluripotentes inducidas, nuestro protocolo se puede utilizar para caracterizar el tráfico mitocondrial a lo largo de los axones humanos y analizar sus morfologías.El transporte mitocondrial deteriorado y la morfología se pueden observar en cultivos con células madre y modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que proporcionan posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de estas enfermedades. Después del año treinta y cinco de cultivo, disociar las neuroesferas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano en pequeños racimos con 1 mg/ml de solución de desprendimiento celular durante dos minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación recoger los cúmulos celulares por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de NDM.Placa de unos cinco grupos de células en cien microlitros de medio por poliornitina y lactosa deshidrogenasa elevando la matriz de membrana de sótano de factor de crecimiento reducido libre de virus recubierta 35 milímetros de vidrio platos inferiores. Luego agregue un mililitro de NDM complementado con B27, monofosfato de adenosina cíclico, factor de crecimiento insulina-like, factor neurotrófico derivado del cerebro humano y factor neurotrófico derivado de células gliales a cada cultivo. Para visualizar las mitocondrias a lo largo de los axones de las neuronas del antebrado, primero manchar las neuronas con 50 nanomolares rojos fluorescentes en NDM durante tres minutos a 37 grados Celsius seguido de dos lavados en NDM caliente.A continuación, coloque el cultivo en el escenario de un microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo 40X. En el campo de fase, identifique los axones en función de sus características morfológicas. Para distinguir la dirección del movimiento mitocondrial a lo largo de los axones identificar claramente los cuerpos celulares de las neuronas.Después de distinguir el cuerpo celular y el axón, ajuste el tiempo de exposición y el enfoque de las mitocondrias en los axones y capture el transporte mitocondrial dentro de los axones cada cinco segundos durante un total de cinco minutos. Para analizar el transporte mitocondrial en ImageJ, abra Fiji y seleccione el plugin Bio-Formats. Utilice el importador de biotemos para importar las imágenes de lapso de tiempo de la serie tiff y seleccione las series estándar ImageJ y Open all.Compruebe la escala automática de canales divididos y haga clic en Aceptar teniendo cuidado de anotar el número de fotograma y el tamaño de las imágenes en píxeles. Después de ajustar el brillo y el contraste de los 60 fotogramas, utilice la línea segmentada para dibujar una línea desde el cuerpo de la celda hasta el axón terminal. Para generar el Kymograph seleccione el plugin Kymograph múltiple y seleccione el ancho de línea.Para medir la distancia, los valores de tiempo y la velocidad de las mitocondrias móviles abiertas tsp050607. txt en el plugin macros. Y dibuje una línea segmentada sobre el rastro del movimiento mitocondrial en el cifógrafo de la región superior a inferior.Después de dibujar la línea abierta leer velocidades de tsp en el plugin macros para leer las velocidades segmentadas correspondientes a la línea. A continuación, abra la imagen original y utilice la herramienta de línea para dibujar una línea a lo largo de la barra de escala. Seleccione analizar para medir la longitud de la línea y convertir el dx ahora y las unidades de distancia de píxeles a micrómetros.A continuación, cambia el tiempo de píxel a segundo. Para analizar la longitud mitocondrial y el área dentro de los axones en ImageJ, instale el plugin JAR de punto de subrayado enderezar y abra la imagen de axón de interés. Convierta la imagen de 32 bits a ocho bits y utilice la herramienta de línea segmentada para trazar el axón.Seleccione el plugin JAR de subrayado Straighten y establezca el ancho de la línea ancha del filamento en 50 píxeles. Trace el axón de nuevo para generar un axón enderezado y ajustar el umbral de la imagen. Seleccione analizar los descriptores de elipse y forma de ajuste perimetral de medidas de conjunto para establecer la medida y utilizar la función de línea para medir la barra de escala en la imagen original como se ha demostrado.En Analizar y establecer la escala, introduzca la distancia en píxeles de distancia conocida y la unidad de longitud para establecer la escala. A continuación, seleccione global para establecer la configuración de escala en todas las imágenes. Finalmente seleccione analizar y analizar partículas para determinar el área y seleccione los resultados de visualización para ver la medición resultante.Después de la diferenciación en neuronas glutamatérgicas telencéfalas las células se pueden caracterizar por su T-B-R uno y beta tres expresión marcador de tubulina. La tinción con tinte fluorescente rojo y lapso de tiempo permite evaluar el transporte axonal de las mitocondrias. Un solo mitocondrión puede permanecer estático o moverse en una dirección anterograda o retrógrada dentro de un axón.La velocidad del movimiento mitocondrial a lo largo del axón se puede cuantificar como se ilustra. Por ejemplo, el uso de software de análisis disponible comercialmente el porcentaje de mitocondrias móviles se reduce significativamente en las neuronas S-P-G-3-A en comparación con las neuronas de tipo salvaje. Para analizar la longitud del área mitocondrial y la relación de aspecto axones se pueden enderezar en el software de análisis de imágenes y seleccionar mediante el ajuste del umbral.La anchura de la longitud perimetral del área mitocondrial y la relación de aspecto se pueden obtener a partir del axón enderezado. Por ejemplo, tanto la longitud mitocondrial como la relación de aspecto se reducen significativamente en los axones de neuronas S-P-G 15 en comparación con los axones de tipo salvaje de control. Es importante calentar el medio y la incubadora del microscopio para lavar las células suavemente y permitir que las células se estabilicen durante veinte minutos antes de la toma de imágenes.Después de las imágenes de células vivas, los cultivos pueden ser fijos y sometidos a inmunosuchación para examinar la expresión de otras proteínas de interés. Es difícil examinar la dinámica mitocondrial en los nervios humanos vivos. Esta técnica proporciona la herramienta única para el estudio de la dinámica mitocondrial y la degeneración nerviosa en la enfermedad neurológica.

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Investigación

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Neurociencia

Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

Este protocolo permite la conversión rápida y eficiente de células madre pluripotentes inducidas en neuronas motoras con una identidad espinal o craneal, mediante la expresión ectópica de factores de transcripción de vectores piggyBac inducibles.

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

Aquí proporcionamos un protocolo para generar NMJ in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Este método puede inducir NMJ con morfología madura y función en 1 mes en un solo pozo. Los NMJ resultantes podrían utilizarse potencialmente para modelar enfermedades relacionadas, para estudiar mecanismos patológicos o para detectar compuestos farmacológicos para la terapia.

Unión Neuromuscular In vitro inducida a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.

Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Este estudio presenta un método para analizar la morfología de las mitocondrias basado en inmunotinción y análisis de imágenes en tejido cerebral de ratón in situ. También describe cómo esto permite detectar cambios en la morfología mitocondrial inducidos por la agregación de proteínas en modelos de enfermedad de Parkinson.

Examen histológico de la morfología mitocondrial en un modelo de enfermedad de Parkinson

Los organoides cerebrales sirven como un modelo valioso para los estudios de encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), ofreciendo información sobre su fisiopatología subyacente y proporcionando una plataforma para la detección de fármacos. Los organoides derivados de líneas celulares con diferentes niveles de heteroplasmia de genes causantes de enfermedades exhiben diferencias fenotípicas significativas.

Modelado de enfermedades mitocondriales utilizando organoides cerebrales: un enfoque en la encefalomiopatía mitocondrial, la acidosis láctica y los episodios similares a accidentes cerebrovasculares

Inyecciones locales de un marcador mitocondrial con marcador mitocondrial terminal de células de Schwann en vivo para microscopía confocal. Este método utiliza pruebas de concepto demostradas en tejido muscular esquelético de ratones con músculo sano o enfermo para proporcionar una visualización mitocondrial de alta resolución.

Métodos para la cuantificación in situ de la morfología mitocondrial en células musculares y terminales de Schwann de ratones

Aprende a analizar el transporte y la morfología mitocondrial en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas para estudiar la paraplejia espástica hereditaria y otras enfermedades neurodegenerativas.

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria (Video) | JoVE Journal

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

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