Name: Modelo In Vitro de Angiogénesis Coronaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo in vitro de angiogénesis coronaria utilizando cultivos de explantes de seno venoso y endocardio de embriones de ratón. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares y la respuesta al VEGF-A.

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Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Sharma por proporcionar un entorno de investigación de apoyo. Nos gusta dar las gracias especiales a Diane (Dee) R. Hoffman, que mantiene y cuida de nuestra colonia de ratones. También nos gustaría dar las gracias a los doctores Philip J. Smaldino y Carolyn Vann por revisar a fondo el manuscrito y proporcionar comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por fondos de Ball State University Provost Office y Department of Biology a B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondos a B.S, y NIH (RO1-HL128503) y The New York Stem Cell Foundation fondos a K.R.

El uso de todos los animales en este protocolo siguió las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ball (IACUC).
1. Establecimiento de criadores de ratón y detección de tapones vaginales para embarazos cronometrados
<ol><li>Establecer una jaula de cría de ratones con ratones machos y hembras de tipo salvaje. Asegúrese de que la edad de los ratones reproductores es entre 6-8 semanas. Preparar un par (1 macho y 1 hembra) o como un trío (1 macho y 2 hembras) para la cría.</li>
	<li>Compruebe si hay un tapón vaginal a la mañana siguiente. Utilice una sonda de metal en ángulo para detectar un enchufe profundo insertándolo en la abertura vaginal. Designar la mañana de un tapón vaginal positivo como día embrionario 0.5 (e0.5). NOTA: Un enchufe vaginal puede ser superficial (que es fácilmente visible, ver Figura 1) o profundo (que no es fácilmente visible). La presencia de un enchufe profundo bloqueará la inserción completa de la sonda, mientras que la ausencia de un enchufe permitirá la inserción completa sin resistencia.</li>
	<li>Mantener el embarazo cronometrado hasta que los embriones alcancen e11.5 en el que serán cosechados. Para confirmar el embarazo antes de cosechar embriones, registre el peso de los ratones hembra entre e7.5 y e11.5. NOTA: El aumento diario del peso de la madre indicará un embarazo exitoso, mientras que ningún cambio en el peso indicará un embarazo fallido.</li>
</ol>2. Cosecha de embriones de ratones embarazadas
NOTA: Antes de empezar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: una cámara de eutanasia CO2, 70% etanol, toallas de papel, fórceps regulares, fórceps finos, tijeras, 1 solución salina estéril con fosfato (PBS), platos estériles de 10 cm Petri, recipiente con hielo, cuchara perforada, estereomicroscopio de disección.
<ol><li>Coloque un ratón embarazada e11.5 en una cámara de eutanasia de CO2 limpia para sacrificarlo. Cierre la tapa de la cámara para evitar que el ratón escape.</li>
	<li>Después de fijar el ratón en la cámara de eutanasia, encienda CO2. Asegúrese de regular el caudal de CO2 por recomendaciones de la IACUC (es decir, 10-30% de desplazamiento por minuto). Después de que el ratón esté completamente eutanasiado, realice la luxación cervical para asegurar la muerte.</li>
	<li>Rocíe el ratón con 70% de etanol. Levante la piel sobre el vientre usando fórceps, haga una pequeña incisión usando un par de tijeras y extienda la incisión lateralmente. Agrandar la incisión anteriormente hasta el diafragma y exponer el cuerno uterino que contiene los embriones(Figura 2).</li>
	<li>Extraiga la cadena de embriones (cuerno uterino + embriones) agarrando el útero y cortando libremente. Coloque la cadena de embriones en hielo frío estéril 1x PBS.</li>
	<li>Diseccionar los embriones individuales del cuerno del útero despegando el músculo uterino, el saco de yema y el amnión uno por uno(Figura 3A-F)bajo un estereomicroscopio. Transfiera los embriones limpios usando una cuchara perforada a una placa Petri que contenga 1 pbS estéril en hielo. Asegúrese de mantener los embriones fríos.</li>
</ol>3. Aislar corazones de e11.5 Embriones
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: fórceps regulares, fórceps finos, 1x PBS estéril, plato Petri estéril de 10 cm, plato Petri estéril de 6 cm, recipiente con hielo, cuchara perforada, estereomicroscopio de disección.
<ol><li>Configure un nuevo plato Petri con hielo estéril 1x PBS bajo un estereomicroscopio. Transfiera un embrión del paso 2.5 al plato de Petri para diseccionar el corazón.</li>
	<li>Retire la cabeza del embrión con fórceps. Primero, apriete la cabeza entre los fórceps con una mano y luego retire la cabeza raspando con la otra mano usando fórceps cerrados(Figura 4A-C).</li>
	<li>Después de extraer la cabeza, oriente el embrión con su lado ventral hacia arriba sosteniendo el embrión con fórceps en su vientre con una mano(Figura 4D).</li>
	<li>Con la otra mano, abra la pared torácica del embrión haciendo primero una pequeña incisión en el pecho ligeramente por encima del diafragma usando fórceps finos. Luego, agrandar la incisión con mucho cuidado insertando fórceps cerrados y rompiendo la pared torácica abriendo los fórceps. Asegúrese de no empujar demasiado profundo, lo que puede dañar el corazón. Con la ayuda de los fórceps, mantenga la pared torácica abierta para exponer el corazón y los pulmones en la cavidad torácica(Figura 4E).</li>
	<li>Con fórceps finos, mueva suavemente el corazón antes (90o) y exponga la aorta/vena dorsal. Extraiga el corazón/pulmones antes capturando la aorta/vena dorsal en la base del corazón(Figura 4F-H). NOTA: Sea suave mientras saca el corazón/pulmones para evitar el desgarro del SV, que se encuentra en el lado dorsal del corazón.</li>
	<li>Enjuague el corazón/pulmones con 1 pbS frío para eliminar las células sanguíneas.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1-3.6 para extraer el corazón/pulmones de los embriones restantes. Asegúrese de mantener el corazón/pulmones aislados en hielo.</li>
</ol>4. Isolating SVs and Ventricles from e11.5 Embryonic Mouse Hearts
<ol><li>Coloque la placa Petri con corazón/pulmones del paso 3.7 bajo un estereomicroscopio para aislar los SVs y ventrículos enteros. Retire los lóbulos adheridos de los pulmones uno por uno de su raíz usando fórceps finos.</li>
	<li>Orientar el corazón en su lado dorsal y eliminar las arerias y el tejido adyacente que rodea el SV anteriormente sin romper el SV. Retire las arículas izquierda y derecha del corazón sosteniendo en su base y raspando usando fórceps finos(Figura 5B). Retire el tejido adyacente que rodea el SV utilizando una técnica similar(Figura 5C). NOTA: Tenga en cuenta que la aurícula derecha está unida al SV, así que tenga cuidado de retirar sólo la aurícula.</li>
	<li>Para aislar el SV, primero oriente el corazón con su lado dorsal hacia arriba (porque el SV está en el lado dorsal) y mantenga el corazón quieto en esta posición sosteniendo suavemente el corazón en sus ventrículos con fórceps. NOTA: El SV es un órgano de entrada de un corazón embrionario que se encuentra entre las mismas en el lado dorsal del corazón.</li>
	<li>Retire el SV despegándolo cuidadosamente del corazón donde está unido o sosteniendo el SV en la base de su accesorio con fórceps finos y raspando con fórceps cerrados(Figura 5D,E).</li>
	<li>Transfiera el SV aislado a una nueva placa Petri de 6 cm con p.pbs estéril de hielo 1x en hielo utilizando una pipeta de transferencia estéril y etiquete la placa Petri como SV.</li>
	<li>Para aislar los ventrículos enteros, retire el tracto de salida (aorta y tronco pulmonar) del corazón después de extraer el SV(Figura 5F, G).</li>
	<li>Transfiera los ventrículos enteros a una nueva placa Petri de 6 cm que contenga 1 pbS estéril en hielo utilizando una pipeta de transferencia estéril y etiquete la placa Petri como ventrículos. Mantenga el SV aislado y los ventrículos en hielo.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1-4.7 para aislar SVs y ventrículos de los corazones restantes.</li>
</ol>5. Configuración de placas de cultivo de tejido con inserciones y recubrimiento de matriz extracelular
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: solución de matriz extracelular comercial (ECM; por ejemplo, Matrigel), plaquitas de tereftalato de polietileno (PET) de 8,0 m, 24 placas de pozo, 37 oC, incubadora de CO2 al 5%.
<ol><li>Deje que la solución de ECM se desconda sobre hielo. Mantenga la solución de ECM sobre hielo para evitar la solidificación.</li>
	<li>Colocar las plaquitas de cultivo de membrana PET (tamaño de los poros a 8,0 m, área de filtración a 0,3 cm2, diámetro del filtro a 6,5 mm) en los pocillos del cultivo no tisular tratado 24 placas de pozo. Etiquete las placas como SV o ventrículos para el SV o los ensayos de angiogénesis endocardial, respectivamente. NOTA: Configure las plaquitas en placas separadas para el SV y los ventrículos al realizar ambos cultivos simultáneamente. Asegúrese de configurar suficientes pozos para todas las muestras y controles experimentales.</li>
	<li>Después de descongelar la solución de ECM, diluir inmediatamente ECM 1:2 en medio basal preenfriado (es decir, medio basal EBM-2, ver Tabla de materiales)a un volumen suficiente (100 l/insertar x número de plaquitas). NOTA: Por ejemplo, si hay seis plaquitas, el volumen total será de 100 s x 6 x 600 l. Añadir 200 l de ECM en 400 ml de medio basal.</li>
	<li>Recubrir las plaquitas con 100 l de ECM recién diluido agregándolo directamente en la parte superior de la membrana. Incubar la placa a 37 oC durante al menos 30 minutos para permitir que el ECM se solidifique. NOTA: Esto debe realizarse bajo una campana de cultivo de tejido de flujo laminar para evitar la contaminación.</li>
</ol>6. SVs y cultivos ventrículos enteros
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: 70% etanol, pipeta de transferencia, estereomicroscopio, fórceps, capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, kit de suplemento celular endotelial microvascular(Tabla de materiales),medio basal, 1x PBS estéril). La Figura 6 muestra el flujo de trabajo del cultivo SV y del ventrículo.
<ol><li>Descongelar el contenido del kit de suplemento sobre hielo. Preparar el medio completo añadiendo todo el contenido del kit de suplemento en 500 ml de medio basal bajo una capucha de cultivo de tejido de flujo laminar certificado. Mezclar bien el medio y distribuirlo en alícuotas de 50 ml.</li>
	<li>Esterilice la base del estereomicroscopio y el área de trabajo circundante con 70% de etanol.</li>
	<li>Obtenga las placas de cultivo de tejidos del paso 5.4. Con la ayuda de una pipeta de transferencia, transfiera cuidadosamente los explantes del paso 4.7 en la parte superior de la membrana de la plaquita. Bajo un estereomicroscopio y con la ayuda de fórceps limpios, coloque los explantes en el centro de las plaquitas para asegurarse de que no están atascados en la esquina de las plaquitas o unidos a las paredes laterales.</li>
	<li>Después de colocar los explantes y centrarlos en las plaquitas, retire cuidadosamente cualquier PBS adicional de las plaquitas y cierre las tapas de las placas.</li>
	<li>Bajo una capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, agregue 100 s de la media completa precalentada en la parte superior de las plaquitas y 200 l en los pozos para cultivar los explantes en la interfaz aire-líquido de tal manera que la superficie basal de la plaquita esté en contacto con el medio , pero la superficie superior está expuesta al aire. NOTA: Asegúrese de ajustar el volumen para obtener una interfaz aire-líquido si utiliza inserciones de diferentes tamaños / placas de pozo.</li>
	<li>Añadir 300 s l de PBS en los pocillos no utilizados de las 24 placas de pozo y cubrir con la tapa. Incubar la placa en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%, y cultivar los cultivos durante 5 días.</li>
	<li>En los días siguientes, observe rutinariamente los cultivos bajo un microscopio de luz invertida para evaluar el estado de los cultivos explantados. Asegúrese de que los explantes exhiben palizas contrácteas y que todos los explantes estén unidos a la parte inferior de la membrana incrustada con ECM. Tome nota de cualquier explantes flotantes. NOTA: La contracción periódica de los explantes indica que están vivos. Los explantes flotantes deben omitirse del análisis.</li>
	<li>Después de evaluar el estado de la cultura, vuelva a colocar la placa de cultivo en la incubadora y continúe creciendo la cultura durante un máximo de 5 días.</li>
</ol>7. Tratamiento de cultivos con VEGF-A (Control Positivo)
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, 1x PBS, medio basal + 1% suero bovino fetal (FBS), medio basal + VEGF-A, pipetas y puntas de pipeta.
<ol><li>Preparar el medio basal + 1% FBS y el medio basal + VEGF-A.<ol>
<li>Para preparar el medio basal + 1% FBS, primero determine el número de pozos de control necesarios. Por ejemplo, si hay tres pozos de control, entonces 300 l/bien x 3 x 900 l es el volumen total necesario. Añadir 9 l de FBS en 891 l de medio basal para hacer el medio basal + 1% FBS.</li>
		<li>Para preparar el medio basal + VEGF-A, primero determine el número total de pozos que necesitan el medio VEGF-A. Si hay tres pozos, entonces 300 l/bien x 3 x 900 l es el volumen total y 50 ng/well x 3 a 150 ng VEGF-A. Añadir 150 ng de VEGF-A en 900 l de medio basal para hacer el medio basal + VEGF-A. NOTA: Ensamble esta solución a un volumen mayor que el calculado para asegurar un número suficiente de alícuotas más pequeñas para cada experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En el día 2, retire el soporte de ambas cámaras (las inserciones y los pozos). Lave los cultivos con 300 s de 1pbS añadiendo 100 s a las plaquitas y 200 l en los pozos. Gire firmemente las placas unas cuantas veces y retire la PBS.</li>
	<li>Añadir 300 s de medio basal + 1% FBS (100 l en la plaquita y 200 l en los pozos) para matar de hambre los cultivos durante 24 h.</li>
	<li>En el día 3, después de la inanición, añadir 300 éL de medio basal + 1% FBS (100 ol en el inserto y 200 l en los pozos) en los pozos de control y medio basal + VEGF-A (50 ng/bien) en los pozos de tratamiento, respectivamente.</li>
	<li>Después del tratamiento, seguir creciendo los cultivos en la incubadora.</li>
</ol>8. Fijación e inmunomancha
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: 4% paraformaldehído (PFA), 1x PBS, anticuerpos primarios y secundarios, un agitador, un tensioactivo no iónico al 0,5% en PBS (PBT).
<ol><li>En el sexto día de cultivo, retire los cultivos de medio y lavado con 1x PBS a temperatura ambiente (RT).<ol>
<li>Corrija los cultivos añadiendo 200 sl de solución de PFA al 4% en los pozos y 100 l en las plaquitas. Arreglar cultivos en 4 oC durante 20 minutos mientras se balancea.</li>
		<li>Después de 20 minutos de fijación, retire el PFA de los cultivos en una campana de humo y lave los cultivos con 1x PBS añadiendo 200 l en los pozos y 100 l en las plaquitas.</li>
		<li>Repetir lavados 3x, 10 min cada uno, mientras se balancea. A continuación, proceda a realizar inmunomanchas. NOTA: Todos los pasos de lavado se realizan en una mesa de trabajo en RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir los anticuerpos primarios (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) en solución de bloqueo (5% suero de burro, 0.5% PBT). Añadir 300 l de solución de anticuerpos primarios (200 ml en los pozos inferiores y 100 l en las plaquitas). Incubar cultivos en anticuerpos primarios durante la noche a 4oC mientras se balancea. NOTA: Anti-VE-Cadherin se utiliza para etiquetar la membrana celular endotelial y anti-ERG 1/2/3 se utiliza para etiquetar el núcleo celular endotelial con el fin de visualizar los brotes angiogénicos de células endoteliales.</li>
	<li>Al día siguiente, lavar y mecer las placas de cultivo 10 veces en 0.5% PBT, cambiando PBT cada 10 min.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos secundarios (donkey anti-rat Alexa Fluor 488 y burro anticonejo Alexa Fluor 555) en solución de bloqueo. Añadir 300 s de los anticuerpos secundarios como en el paso 8.2 e incubar los cultivos durante la noche a 4 oC mientras se balancea. Al día siguiente, lavar los anticuerpos secundarios 10 veces en PBT, cambiando PBT cada 10 min. NOTA: Lave un mínimo de 10 veces, pero más lavados son mejores. Una vez completados los lavados, los cultivos se pueden almacenar con 1 PBS hasta que se montan en diapositivas.</li>
</ol>9. Montaje de cultivos en diapositivas, imágenes y análisis
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de tener los siguientes equipos y reactivos: fórceps finos, portaobjetos, medio de montaje con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), cubreobjetos y microscopio confocal. Después de la tinción secundaria de anticuerpos, monte los cultivos en diapositivas para obtener imágenes siguiendo los siguientes pasos.
<ol><li>Pelar la membrana cuidadosamente de la plaquita utilizando fórceps finos y transferirla a las diapositivas colocando el lado de la membrana hacia abajo y colocando los cultivos explantados hacia arriba. Coloque las muestras de réplica en las mismas diapositivas y etiquete las diapositivas como control o VEGF-A. Agregue unas gotas de medio de montaje con DAPI directamente sobre la membrana y cubra las diapositivas con resbalones de cubierta. NOTA: Asegúrese de evitar las burbujas de aire mientras coloca los labios de las cubiertas.</li>
	<li>Cierre los bordes de las diapositivas con esmalte de uñas transparente y deje secar. NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar en -20 oC para un almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Diapositivas de imagen utilizando un microscopio confocal.</li>
	<li>Realizar análisis para medir la longitud del crecimiento angiogénico. Cuantifique la longitud del crecimiento angiogénico midiendo la distancia de las células endoteliales (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) extendidas desde el límite interior de las células ERG 1/2/3+ en los cultivos ventrículos y desde el centro de los explantes SV en los cultivos SV.<ol>
<li>Para realizar la cuantificación con FIJI/ImageJ, primero descargue el software FIJI.</li>
		<li>Abrir archivos de imagen en FIJI: ir a Archivo ? Abiertos ? Carpeta ? Nombre de archivo ? Abrir.</li>
		<li>Ir a Analizar ?? Ajuste de Medidas (Set Measurements) Seleccione Perímetro.</li>
		<li>Seleccione la herramienta Línea recta en la ventana principal.</li>
		<li>Dibuje una línea a lo largo de la longitud de un brote como se sugiere en el paso 9.4.</li>
		<li>Ir a Analizar ?? Medir. NOTA: Las medidas de longitud se muestran en la nueva ventana.</li>
		<li>Realice la cuantificación en imágenes que representen al menos tres campos de visión seleccionados aleatoriamente. Promedio de las mediciones de la longitud del brote e informar de ellas como media de desviación estándar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores no declaran conflicto de intereses.

Algunos de los pasos más críticos para el crecimiento con éxito de los vasos coronarios de los tejidos progenitores SV y Endo son: 1) Identificar y aislar correctamente el tejido SV para el cultivo de SV; 2) el uso de ventrículos de embriones entre las edades de e11-11,5 para un cultivo preciso de Endo; 3) mantener condiciones estériles durante todo el período de disección y mantener los tejidos fríos en todo momento; y 4) mantener los explantes unidos a la membrana recubierta de ECM para evitar que el tejido flote en el...

Los vasos sanguíneos del corazón se denominan comúnmente vasos coronarios. Estos vasos se componen de arterias, venas y capilares. Durante el desarrollo, los capilares altamente ramificados se establecen primero, que luego se remodelan en arterias coronarias y venas1,2,3,4,5. Estos capilares iniciales se construyen a partir de células progenitoras endoteliales que se encuentran en los tejidos proepicardium, sinus venosus (SV) y endocardio (Endo)1,6,7,8. SV es el órgano de entrada del corazón embrionario y Endo es el revestimiento interno del lumen del corazón. Las células progenitoras endoteliales que se encuentran en el SV y Endo construyen la mayoría de la vasculatura coronaria, mientras que el propicaredium contribuye a una porción relativamente pequeña de ella2. El proceso por el cual la red capilar de los vasos coronarios crece en el corazón a partir de sus células precursoras preexistentes se llama angiogénesis coronaria. La enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo y, sin embargo, falta un tratamiento eficaz para esta enfermedad. Comprender los mecanismos celulares y moleculares detallados de la angiogénesis coronaria puede ser útil para diseñar terapias novedosas y eficaces para reparar y regenerar las arterias coronarias dañadas.
Recientemente, un aumento en nuestra comprensión de cómo se desarrollan los vasos coronarios se ha logrado en parte a través del desarrollo de nuevas herramientas y tecnologías. En particular, el etiquetado del linaje in vivo y las tecnologías avanzadas de imagen han sido muy útiles para descubrir las vías de origen celular y diferenciación de los vasos coronarios9,10,11,12. A pesar de las ventajas de estas herramientas in vivo, existen limitaciones en términos de velocidad, flexibilidad y accesibilidad. Por lo tanto, los sólidos sistemas de modelos in vitro pueden complementar los sistemas in vivo para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera de alto rendimiento.
Aquí, describimos un modelo in vitro de angiogénesis coronaria. Hemos desarrollado un sistema de cultivo explanta in vitro para cultivar vasos coronarios a partir de dos tejidos progenitores, SV y Endo. Con este modelo, mostramos que los cultivos explantadores de tejido in vitro crecen brotes de vasos coronarios cuando son estimulados por medio de crecimiento. Además, los cultivos explantadores crecen rápidamente en comparación con el control cuando son estimulados por el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), una proteína angiogénica muy potente. Además, encontramos que los brotes angiogénicos del cultivo SV sufren desdiferencia venosa (pérdida de la expresión COUP-TFII), un mecanismo similar a la angiogénesis SV in vivo1. Estos datos sugieren que el sistema de cultivo explanta in vitro restablece fielmente los eventos angiogénicos que se producen in vivo. Colectivamente, los modelos in vitro de angiogénesis que se describen aquí son ideales para sondear los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera accesible y de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>Plato de cultivo de tejidos de 100 x 20 MM</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>Referido en el protocolo como placa de Petri</td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo de membrana PET de 8.0 uM</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Burro anti-conejo 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-rata 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Sonda de metal en ángulo</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10088-15</td><td>Ángulo de 45 grados, utilizado para detectar tapones profundos</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ERG 1/2/3</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-VE-Cadherina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Anticuerpo primario, fabricante BD BioSciences</td></tr><tr><td>Tanque de gas CO2</td><td>Varios proveedores</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Fisher Scientific 13998223</td><td></td><td>para 37 &deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>incubación Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i Microscopio estereoscópico</td></tr><tr><td>EBM-2 medios basales Lonza</td><td></td><td>CC-3156 Solución ECM</td> de <td>medios basales de crecimiento de células endoteliales</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Conocido comercialmente como Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Kit de suplemento de células endoteliales microvasculares; Esto se mezcla con el EBM-2 para hacer el EGM-2 medios completos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Software de procesamiento de imágenes (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11412-11</td><td>Utilizadas para embriones disección</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tijeras de operación de hoja recta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo de tejidos de flujo laminar</td><td>Fisher Scientific</td><td>varios modelos disponibles</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Vectashield con DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Microscopía electrónica/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Está disponible al 32%; necesita diluirse al 4%</td></tr><tr><td>Cuchara perforada</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10370-18</td><td>Útil para extraer embriones/tejidos de una solución</td></tr><tr><td>Murina recombinante VEGF-A 165</td><td>Pinza PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>estándar, Dumont #5</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Sure-Seal para ratones/ratas</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785 Cámara de</td><td>eutanasia</td></tr></tbody></table>

modelo in vitro de angiogénesis coronaria

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Aquí, describimos un ensayo de cultivo in vitro para estudiar la angiogénesis coronaria. Los vasos coronarios alimentan el músculo cardíaco y son de importancia clínica. Los defectos en estos vasos representan riesgos graves para la salud, como en la aterosclerosis, que puede provocar infartos de miocardio e insuficiencias cardíacas en los pacientes. En consecuencia, la enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. A pesar de su importancia clínica, se ha avanzado relativamente poco en cómo regenerar las arterias coronarias dañadas. Sin embargo, se han realizado progresos recientes en la comprensión del origen celular y las vías de diferenciación del desarrollo de los vasos coronarios. El advenimiento de herramientas y tecnologías que permiten a los investigadores etiquetar fluorescentemente las células progenitoras, seguir su destino y visualizar progenies in vivo han sido fundamentales para entender el desarrollo de los vasos coronarios. Los estudios in vivo son valiosos, pero tienen limitaciones en términos de velocidad, accesibilidad y flexibilidad en el diseño experimental. Alternativamente, los modelos in vitro precisos de la angiogénesis coronaria pueden eludir estas limitaciones y permitir a los investigadores interrogar cuestiones biológicas importantes con rapidez y flexibilidad. La falta de sistemas modelo in vitro adecuados puede haber obstaculizado el progreso en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del crecimiento de los vasos coronarios. Aquí, describimos un sistema de cultivo in vitro para cultivar vasos coronarios a partir del sinusuvenosus (SV) y el endocardio (Endo), los dos tejidos progenitores de los que surgen muchos de los vasos coronarios. También confirmamos que las culturas recapitulan con precisión algunos de los mecanismos in vivo conocidos. Por ejemplo, mostramos que los brotes angiogénicos en cultivo a partir de SV downregulate EXPRESIÓN COUP-TFII similar a lo que se observa in vivo. Además, demostramos que el VEGF-A, un conocido factor angiogénico in vivo, estimula de forma robusta la angiogénesis de las culturas SV y Endo. Colectivamente, hemos ideado un modelo de cultivo in vitro preciso para estudiar la angiogénesis coronaria.

Una de las características más llamativas de la angiogénesis SV in vivo es que sigue una vía específica e implica eventos de desdiferencia celular y rediferenciación que ocurren en momentos estereotipados y posiciones1. A medida que las células SV iniciales crecen sobre el ventrículo cardíaco, dejan de producir marcadores venosos como COUP-TFII(Figura 7). Posteriormente, los brotes coronarios toman dos caminos de migración, ya sea sobr...

Los modelos in vitro de angiogénesis coronaria se pueden utilizar para el descubrimiento de los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria. Cultivos explantados in vitro de tejidos sinusales venosos y endocardio muestran un crecimiento robusto en respuesta al VEGF-A y muestran un patrón similar de expresión COUP-TFII como in vivo.

Modelo In Vitro de Angiogénesis Coronaria

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Nuestro protocolo es significativo porque permite a los investigadores investigar el mecanismo molecular de la angiogénesis coronaria fuera de un organismo. La principal ventaja de esta técnica es que modela con precisión el proceso de angiogénesis coronaria dentro de un organismo, facilitando el estudio de los mecanismos de la angiogénesis coronaria. Comience por rociar un ratón embarazada llevando embriones embrionarios del día 11,5 con 70%etanol.Levantar la piel sobre el vientre con fórceps, utilizar tijeras para hacer una piel abdominal y la incisión peritoneal lateralmente y antes hasta el diafragma para exponer el cuerno uterino. Agarrar el útero, cortar el tejido libre y sacar el cuerno uterino. Coloque la cadena de embriones en PBS estéril frío bajo un microscopio estéreo y despegue el músculo uterino, el saco de yema y la cubierta de amnion de cada embrión.A medida que cada embrión está aislado, utilice una cuchara perforada para transferir los tejidos a un nuevo plato de Petri que contenga PBS estéril en hielo. Para cosechar el tejido cardíaco embrionario, transfiera el primer embrión que se diseccione a una nueva placa Petri bajo el microscopio, y coloque el embrión en el lado ventral hacia arriba. Utilice fórceps finos para hacer una pequeña incisión en el pecho, ligeramente por encima del diafragma, e inserte los fórceps cerrados en la incisión para agrandar la incisión.Usando los fórceps para mantener la pared torácica abierta para exponer el corazón y los pulmones, usa un segundo par de fórceps para mover suavemente el corazón antes de 90 grados para exponer la aorta dorsal y la vena. Luego, agarrando estos vasos en la base del corazón, saca cuidadosamente el corazón y los pulmones antes y enjuaga los tejidos con PBS frío. Cuando se haya cosechado todo el tejido cardíaco, coloque las muestras del corazón bajo el microscopio y retire los lóbulos pulmonares de cada corazón.Orientar el primer corazón en su lado dorsal, y sosteniendo el corazón en su base, utilizar fórceps finos para raspar las aurículas izquierda y derecha en el tejido adyacente que rodea el SV desde el corazón. Para aislar el SV, oriente el lado dorsal del corazón hacia arriba. Retire cuidadosamente el SV del corazón y utilice una pipeta de transferencia estéril para colocar el tejido aislado en una nueva placa Petri de seis centímetros que contenga PBS estéril con hielo.Para aislar todo el ventrículo, retire el tracto de salida y utilice una nueva pipeta de transferencia estéril para colocar los ventrículos en un plato separado de seis centímetros de Petri que contenga PBS estéril de hielo estéril en hielo. Para configurar cultivos de SV y ventrículos enteros, primero recubre las membranas de un inserto de cultivo PET de poro de ocho micrómetros por pozo de una placa de cultivo de 24 pozos, con 100 microlitros de matriz extracelular recién diluida por cultivo durante al menos 30 minutos a 37 grados Centígrados. Cuando la matriz se haya solidificado, utilice una pipeta de transferencia para transferir una plantación a cada plaquita y mueva la placa debajo del microscopio.Usando fórceps limpios, coloque los explantes en el centro de cada plaquita para asegurarse de que no estén unidos a las paredes laterales, y retire cuidadosamente cualquier PBS adicional. A continuación, transfiera la placa con la tapa cerrada bajo una campana de cultivo de tejido de flujo laminar, y agregue 100 microlitros de medio completo precalentó a cada inserción, y 200 microlitros al pozo por debajo de cada plaquita. Luego agregue 300 microlitros de PBS a cualquier pozo no utilizado, y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cinco días.Para el tratamiento con VEGF-A en el segundo día de cultivo, retire el medio de ambas cámaras de cada cultivo y agregue 100 microlitros de PBS a cada inserción, y 200 microlitros de PBS a cada pozo. Después de agitar la placa un par de veces, reemplace el PBS con 300 microlitros de medio basal complementados con 1%suero bovino fetal para iniciar los cultivos, y devuelva la placa a la incubadora. En el tercer día después de la inanición, añadir 300 microlitros de medio basal fresco más suero a los pozos de control y medio basal más 50 nanogramos por mililitro de VEGF-A a los pozos de tratamiento, y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular.En el sexto día de cultivo, lave las cámaras con PBS como se ha demostrado, y fije los cultivos con 200 microlitros de 4%paraformaldehído en cada pozo, y 100 microlitros de fijador en cada plaquita. Después de 20 minutos a 4 grados centígrados con balanceo, lave los cultivos con 300 microlitros de PBS durante 10 minutos por lavado con balanceo a temperatura ambiente. Después del último lavado, añadir 300 microlitros de solución de anticuerpos primarios a los pozos e inserciones para un cultivo nocturno a cuatro grados centígrados con balanceo.A la mañana siguiente, lave los cultivos 10 veces en tensioactivo no iónico en PBS con balanceo, cambiando la solución de lavado cada 10 minutos antes de etiquetar los cultivos con 300 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado a cuatro grados Celsius durante la noche con balanceo. Al día siguiente, lave los cultivos 10 veces en PBS fresco con tensioactivo no iónico como se demuestra. Después del último lavado, utilice fórceps finos para pelar cuidadosamente la membrana de cada plaquita y colocar las membranas en diapositivas individuales del microscopio de vidrio, explanar hacia arriba.Cubra las muestras con un medio de montaje complementado con DAPI en un resbalón de cubierta, y selle los bordes de los resbalones de la cubierta con esmalte de uñas transparente. Cuando el esmalte de uñas se haya secado, imagine las diapositivas por microscopía confocal. A medida que las células SV iniciales crecen sobre el ventrículo cardíaco, dejan de producir marcadores venosos como Coup-TF2.Después de cinco días de cultivo, las células endoteliales SV brotan y migran a la membrana. Al igual que en el corazón embrionario, la expresión de Coup-TF2 se reduce a medida que los vasos migran lejos del SV. Cultivos estimulados con VEGF-A exhiben un mayor crecimiento de brotes angiogénicos tanto en densidad como en longitud. Otros cultivos de SV estimulados por VEGF-A demuestran un aumento casi tres veces en la longitud del brote en comparación con los controles, lo que sugiere que los brotes endoteliales de SV y endocardio responden al VEGF-A.Es importante no perder el tejido SV mientras saca el corazón y los pulmones, extirpa las aurículas y limpia el tejido adyacente que rodea la SV. Se pueden realizar experimentos de imágenes en vivo para visualizar la angiogénesis coronaria y capturar los detalles de la dinámica celular y molecular durante el proceso. Esta técnica es extremadamente útil para evaluar los mecanismos moleculares potenciales de la angiogénesis coronaria y como un sistema modelo para el estudio de la angiogénesis en general.

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