Name: Análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprende a analizar el crecimiento bacteriano bajo estrés en E. coli mediante microscopía de lapso de tiempo y citometría de flujo. Este método permite evaluar viabilidad, morfología y contenido de ADN a nivel de célula única y población.

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Los autores agradecen a F. Cornet por proporcionar la cepa hupA-mCherry, A. Dedieu por asistencia técnica con citometría, y A. Ducret por su ayuda con MicrobeJ. Financiación: C. Lesterlin reconoce las instituciones Inserm y CNRS, así como el programa ATIP-Avenir, la Fundación Schlumberger para la Educación y la Investigación (FSER 2019), la financiación de la ANR para el programa de investigación PlasMed (ANR-18-CE35-0008), así como FINOVI para la financiación de J. Cayron; Cáncer La Ligue contre le para la financiación del equipo del citómetro de flujo. Contribuciones del autor: C.L. y J.C. diseñaron el procedimiento y escribieron el documento; J.C. realizó los experimentos y analizó los datos.

1. Cultivo celular, inducción del estrés y procedimiento de muestreo
NOTA: Utilice cristalería de cultivo estéril, puntas de pipeta y medio de crecimiento filtrados a 0,22 m para evitar partículas de fondo. Aquí, los cultivos celulares se cultivan en medio definido rico en autofluorescencia baja (ver Tabla de Materiales)7,8.
<ol><li>Rayar la cepa bacteriana de interés de una culata de glicerol congelado en una placa de agarosa Deria-Broth (LB) (con antibiótico selectivo si es necesario) e incubar a 37oC durante la noche (17 h). NOTA: El ejemplo de experimento presentado aquí utiliza Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Esta cepa produce la subunidad fluorescentemente etiquetada de la proteína asociada a los nucleoides de HU, permitiendo así la visualización por microscopía ligera del cromosoma en células vivas9.</li>
	<li>Inocular 5 ml de medio con una sola colonia y crecer a 37oC con agitación a 140 rotación por minuto (rpm) durante la noche (17 h). Se deben utilizar frascos (50 ml) o tubos de ensayo de gran diámetro (2 cm) para garantizar una aireación satisfactoria del cultivo agitado.</li>
	<li>A la mañana siguiente medir la densidad óptica a 600 nm (OD600nm) y diluir el cultivo en un tubo de ensayo que contiene medio fresco a un OD600nm de 0.01. El volumen total del cultivo debe ajustarse en función del número de puntos de tiempo que se analizarán durante el experimento.</li>
	<li>Cargue una muestra de 200 l del cultivo en una microplaca (0,2 ml por pozo de volumen de trabajo con un fondo transparente claro) y colóquela en un lector de placas automatizado (consulte Tabla de materiales)para la monitorización de600 nm de OD durante la incubación a 37 oC.</li>
	<li>Incubar el tubo de ensayo inoculado a 37 oC con agitación (140 rpm) a OD600 nm a 0,2, correspondiente a la fase exponencial completa en medio rico. NOTA: Es fundamental cultivar las células durante al menos 4 a 5 generaciones antes de lograr un crecimiento exponencial adecuado. El inóculo inicial utilizado en el paso 1.3 (OD600nm a 0,01) debe adaptarse en el caso de crecimiento en un medio más pobre (es decir, cuando la fase exponencial se alcanza por debajo de la DO 0,2), o si se desean más generaciones (por ejemplo, para estudios fisiológicos específicos o para tratamientos de estrés extendido).</li>
	<li>AOD 600nm a 0,2, tome las siguientes muestras de cultivo correspondientes al punto de tiempo t0 (células de crecimiento exponencial antes de la inducción de tensión): (1) Una muestra de 150 ml que se cargará inmediatamente en el aparato microfluídico para la toma de imágenes de microscopía de lapso de tiempo (ver sección 2); (2) Una muestra de 200 ml para el ensayo de dilución y chapado (ver sección 3); (3) Una muestra de 250 l que se va a poner en hielo para el análisis de citometría de flujo (sección 4); (4) Una muestra de 10 l que se depositará inmediatamente en una diapositiva montada en agarosa para obtener imágenes instantáneas de microscopía (ver sección 5).</li>
	<li>Exponga el cultivo celular que queda en el tubo de ensayo al tratamiento de tensión específico que desea investigar e incubar a 37 oC con agitación (140 rpm). NOTA: El cultivo en el lector automatizado de placas para la monitorización de OD600nm también debe someterse al tratamiento de tensión.</li>
	<li>En los momentos pertinentes después del tratamiento de tensión (t1, t2, t3, etc.), tome las siguientes muestras celulares del cultivo estresado: (1) Muestra de 200 L para el ensayo de dilución y chapado (ver sección 2); (2) Una muestra de 250 l para poner en hielo para el análisis de citometría de flujo (sección 3); (4) Una muestra de 10 l que se depositará inmediatamente en una diapositiva montada en agarosa para obtener imágenes instantáneas de microscopía (ver sección 4). NOTA: Cada tratamiento que induce el estrés tiene una eficiencia que depende de la dosis y el tiempo. Por lo tanto, podría ser necesario realizar pruebas preliminares para determinar la dosis y la duración del tratamiento que se utilizará para obtener resultados óptimos. Esto se puede hacer mediante la realización de monitoreo de OD utilizando un lector de placas automatizado (potencialmente asociado con ensayos de chapado) de un cultivo celular tratado con una gama de dosis y tiempos de exposición. En el experimento presentado aquí, el cultivo celular fue tratado con el antibiótico inhibidor de la división celular cephalexin (Ceph.) a 5 g/ml de concentración final durante 60 min. La cefalexina fue luego lavada peletizando las células en un tubo de 15 ml utilizando centrifugación (475 g, 5 min), retirando el sobrenadante, reemplazando el pellet celular en un volumen igual de medio fresco mediante pipeteo suave, y transfiriendo a un tubo limpio. Las células lavadas se incubaron a 37 oC con agitación (140 rpm) para permitir la recuperación. La muestra se tomó a t60 (60 min después de la adición de cefalexina correspondiente a la muestra 'cephalexin-60min-treated'), t120 (60 min después del lavado) y t180 (120 min después del lavado).</li>
</ol>2. Ensayo de chapado
NOTA: El ensayo de chapado permite medir la concentración de células capaces de generar una CFU en las muestras de cultivo. Este procedimiento revela la velocidad a la que una célula se divide en dos células viables y permite detectar detenciones por división celular (por ejemplo, aumento del tiempo de generación bacteriana de la lisis celular).
<ol><li>Preparar diluciones seriales de hasta 10-7 de los 200 ml de muestra de cultivo en medio fresco. Placa 100 l de la dilución adecuada en placas de agarosa LB no selectivas para obtener entre 3 y 300 colonias después de la incubación durante la noche a 37 oC. NOTA: La dilución en serie en medio fresco debe realizarse rápidamente para limitar las divisiones bacterianas. Alternativamente, los investigadores podrían considerar el uso de una solución salina sin una fuente de carbono para prevenir las divisiones celulares durante el proceso de dilución.</li>
	<li>Al día siguiente, cuente el número de colonias para determinar la concentración de células viables (CFU/ml) en cada muestra de cultivo. Trazar la CFU/ml en función del tiempo para cultivos celulares no tratados y tratados.</li>
</ol>3. Citometría de flujo
NOTA: En la siguiente sección se describe la preparación de muestras de células para el análisis de citometría de flujo. Esta técnica de análisis revela la distribución del tamaño celular y el contenido de ADN para un gran número de células. Cuando sea posible, se recomienda procesar las muestras de citometría de flujo inmediatamente. Alternativamente, las muestras se pueden mantener en hielo (hasta 6 h) y analizarse simultáneamente al final del día, una vez que se han realizado imágenes de chapado y microscopía.
<ol><li>Diluir los 250 l de la muestra de cultivo para obtener 250 ml a una concentración de 15.000 células/L (correspondiente a un ODde 600 nm a 0,06) en un medio fresco a 4 oC. NOTA: La incubación en hielo limitará el crecimiento y la modificación morfológica de las células. Alternativamente, el usuario podría considerar realizar la fijación de las células en 75% etanol, como se recomienda normalmente para la citometría de flujo10.</li>
	<li>Para la tinción de ADN, mezcle la muestra bacteriana con una solución de 10 g/ml de colorante fluorescente de ADN (relación 1:1) e incubar en la oscuridad durante 15 minutos antes de analizar la muestra.</li>
	<li>Pase la muestra al citómetro de flujo con un caudal de 120.000 celdas/min. Adquiera la luz de fluorescencia de colorante fluorescente de ADN (FL-1) dispersada hacia adelante y de lado (SSC), así como la señal de fluorescencia de colorante fluorescente de ADN (FL-1) con los ajustes adecuados.</li>
	<li>Trazar los histogramas de densidad de células FSC y FL-1 para representar la distribución del tamaño de la célula y el contenido de ADN en la población celular.</li>
</ol>4. Imágenes por microscopía instantánea
NOTA: En la siguiente parte se describe la preparación de diapositivas de microscopía y la adquisición de imágenes para el análisis de instantáneas de población. Este procedimiento proporcionará información sobre la morfología de las células (longitud celular, anchura, forma) y la organización intracelular del ADN nucleoide.
<ol><li>Precalentar la cámara del microscopio termostatizado a 37 oC para estabilizar la temperatura antes de iniciar las observaciones. Esta cámara permite la modulación de la temperatura de la óptica del microscopio y la etapa de la muestra durante los experimentos de lapso de tiempo.</li>
	<li>Prepare las correderas montadas en agarosa como se describe en Lesterlin y Dubarry7.<ol>
<li>Retire la película de plástico de la parte inferior del marco azul (consulte Tabla de materiales), dejando la película de plástico ahuecada en el otro lado. Pegue el marco azul en una diapositiva de cristal del microscopio.</li>
		<li>Pipeta de 150 ol de solución media de agarosa derretida del 1% y verter dentro del compartimento azul del bastidor. Cubrir rápidamente con un cubreobjetos limpio para eliminar el exceso de líquido y esperar unos minutos a que la almohadilla de agarosa se solidifique a temperatura ambiente.</li>
		<li>Cuando la muestra de celda esté lista, retire el cubreobjetos y la película de plástico del marco azul. Vierta 10 ml de muestra de celda en la almohadilla de agarosa e incline el deslizamiento de vidrio suavemente para extender la gota. Cuando todo el líquido se haya adsorbido, pegue un cubreobjetos limpio en el marco azul para sellar la muestra. La corredera de microscopía ya está lista para la microscopía.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y realice la adquisición de la imagen utilizando luz transmitida (con un objetivo de contraste de fase) y con excitación de fuente de luz en las longitudes de onda adecuadas (560 nm para mCherry).</li>
	<li>Seleccione campos de visión que contengan celdas aisladas para facilitar la detección automatizada de celdas durante el análisis de imágenes. Asegúrese de que se utilizan al menos 300 celdas para permitir un análisis estadístico sólido de la población celular.</li>
</ol>5. Imágenes microfluídicas de microscopía de lapso de tiempo
NOTA: La siguiente parte explica la preparación de las placas microfluídicas (ver Tabla de Materiales),carga celular, programa de microfluídicos y adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Este procedimiento de diagnóstico por imágenes revela el comportamiento de las células individuales en tiempo real.
<ol><li>Retire la solución de conservación de la placa microfluídica y sustitúyala por un medio fresco precalentado a 37oC, como se describe en la guía del usuario del software microfluídico.</li>
	<li>Selle la placa microfluídica al sistema múltiple y haga clic en el botón Priming.</li>
	<li>Coloque la placa microfluídica con el sistema múltiple en la etapa del microscopio y precaliente a 37 oC durante 2 h antes de iniciar la adquisición de la microscopía. NOTA: Este paso de precalentamiento es fundamental para evitar la dilatación de la cámara microfluídica, lo que alteraría el enfoque del microscopio durante el experimento de lapso de tiempo y comprometería la adquisición de imágenes.</li>
	<li>Cierre la placa microfluídica. Sustituya el medio del pozo 8 por el de 150 ml de la muestra de cultivo y sustituya el medio del pozo 1 al 5 por el medio deseado con o sin el reactivo que induzca el estrés.</li>
	<li>Selle la placa microfluídica y colóquela en la etapa del microscopio.</li>
	<li>En el software microfluídico (consulte Tabla de materiales)ejecute el procedimiento de carga de celdas. Compruebe que la carga de las células es satisfactoria mirando bajo el microscopio a la luz transmitida. Ejecute el procedimiento de carga de celdas por segunda vez si la densidad de celdas en la cámara es insuficiente.</li>
	<li>Realizar enfoque cuidadosamente en el modo de luz transmitida y seleccionar varios campos de visión que muestran bacterias aisladas. Es importante seleccionar campos que no están superpoblados para poder monitorear el crecimiento de células aisladas a lo largo del tiempo (se recomienda n.o 10 a 20 celdas por 100 m2). Esto también facilitará la detección de celdas durante el análisis de imágenes.</li>
	<li>En el software microfluídico, haga clic en el botón Crear un protocolo. Programe la inyección del medio de crecimiento para equivalentes de tiempo de generación de 1 x 2 para permitir que las células se adapten (opcional). A continuación, programe la inyección del medio inductor de tensión durante 10 min a 2 psi, seguido de la inyección a 1 psi durante la duración deseada del tratamiento de estrés. Si tiene la intención de analizar la recuperación de las células después del estrés, programe la inyección de medio de crecimiento fresco para la duración deseada. NOTA: En el experimento presentado aquí, la cefalexina se inyectó durante 10 min a 2 psi, seguido de 50 min a 1 psi. Luego, se inyectó un nuevo medio de crecimiento a 2 psi durante 10 min, seguido de 3 h a 1 psi.</li>
	<li>Realice imágenes por microscopía en modo time-lapse con 1 fotograma cada 10 min utilizando contraste de fase en la luz transmitida y una fuente de luz de excitación de 560 nm para la señal mCherry si es necesario. NOTA: Es importante iniciar la adquisición microscópica de imágenes al mismo tiempo que el inicio del protocolo de inyección microfluídica.</li>
</ol>6. Análisis de imágenes
NOTA: En esta sección se describen brevemente los pasos clave para procesar y analizar imágenes de microscopía de instantáneas y de lapso de tiempo. La apertura y visualización de imágenes de microscopía se realiza con el código abierto ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. El análisis cuantitativo de imágenes se realiza utilizando el software de código abierto ImageJ/Fiji junto con el plugin gratuito MicrobeJ12 (https://microbej.com). Este protocolo utiliza la versión MicrobeJ 5.13I.
<ol><li>Abra el software Fiji y el plugin MicrobeJ.</li>
	<li>Para el análisis de instantáneas, suelte todas las imágenes correspondientes a una diapositiva de microscopio (una muestra) en la barra de carga de MicrobeJ para concatenar imágenes y guardar el archivo de pilas de imágenes obtenido. Para los datos de lapso de tiempo, simplemente coloque la pila de imágenes en la barra de carga de MicrobeJ.</li>
	<li>Ejecutar la detección automatizada de los contornos de las células en función de la segmentación de la imagen de contraste de fase y, si es relevante, de los nucleoides en función de la segmentación de la señal de fluorescencia de ADN manchado. Compruebe visualmente la precisión de la detección de celdas y utilice la herramienta de edición MicrobeJ para la corrección si es necesario. Guarde el archivo de resultados obtenido. NOTA: Los ajustes utilizados para la detección de células de E. coli se indican en la Tabla de materiales (consulte la columna Comentarios/Descripción de MicrobeJ). Para otras especies bacterianas (especialmente para bacterias que no son de forma de varilla), el usuario debe refinar la configuración antes de la detección (ver tutorial de MicrobeJ). Para las imágenes de lapso de tiempo, es posible que se prefiera ejecutar una detección semiautomática de las celdas mediante la herramienta de edición MicrobeJ para permitir centrarse en el destino de las celdas individuales (consulte el tutorial de MicrobeJ).</li>
	<li>Haga clic en el icono ResultJ para completar el análisis y obtener la ventana ResultJ. Desde ese punto se pueden generar muchos tipos diferentes de gráficos de salida. Trazar los histogramas normalizados de la forma/longitud de la celda y el número medio de nucleoides por celda.</li>
</ol>

<ol><li>Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+length%2C+cell+growth+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell length, cell growth and cell division.</a> Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).</li>
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</ol>

Los autores no declararon intereses competidores.

Es esencial prestar atención al estado de crecimiento de las células durante el procedimiento. Crecer las células durante varias generaciones antes de alcanzar una fase exponencial completa. Para el éxito de este método, es importante que todas las muestras de células se recopilen simultáneamente, y es mejor analizar solo un cultivo tratado y un cultivo no tratado al mismo tiempo. Las muestras celulares para imágenes por microscopía deben mantenerse a la temperatura experimental durante todo el procedimiento. Entonces es esencial precalentar la cámara del microscopio y la cámara microfluídica antes del comienzo del experimento. Si las muestras celulares de citometría de flujo no se pueden analizar fácilmente, se pueden mantener en hielo hasta 6 h. La incubación en hielo limitará el crecimiento y la modificación morfológica de las células. Alternativamente, el usuario podría considerar el uso de la fijación de las células en etanol 75%, que generalmente se recomienda para la citometría de flujo10. Si el protocolo requiere lavar el inductor de tensión desde el medio, las células centrífugas y pipetas con mucho cuidado para evitar dañar las células aberrantes potenciales.
Tanto la citometría de flujo como el análisis de instantáneas dan acceso al tamaño de la célula y a los parámetros de contenido de ADN, con instantáneas que proporcionan una observación adicional de la morfología celular. Se puede realizar la tinción de ADN con DAPI10 (4',6-diamidino-2-phenylindole) u otros colorantes de ADN estables si no hay fusión fluorescente disponible para observar los nucleoides en el organismo de interés. Si no se puede realizar el análisis de citometría de flujo, es importante crear una imagen y analizar un gran número de células mediante microscopía.
Las imágenes por microscopía también se pueden realizar utilizando cepas que transportan fusiones fluorescentes a proteínas implicadas en vías específicas de interés. Esto ayudaría a revelar el efecto del estrés en una variedad de procesos celulares como replicación, transcripción, síntesis de la pared celular, o división celular. El método puede aplicarse a una serie de especies bacterianas, el único requisito es que el aparato microfluídico debe ser compatible con la morfología de las células. Las placas microfluídicas estándar son convenientes para bacterias en forma de varilla con un ancho de célula entre 0,7 y 4,5 m. Sin embargo, los cocci, los ovococci u otras cepas bacterianas con formas peculiares deben ser probados. Alternativamente, si no se pueden realizar experimentos microfluídicos debido a la falta de disponibilidad del equipo o cepas bacterianas incompatibles, la toma de imágenes de lapso de tiempo se puede realizar en diapositivas montadas en agarosa para una duración máxima de 2h.
La ventaja general de este análisis multiescala es proporcionar una visión global del efecto de la inducción de estrés en varios aspectos de la capacidad de crecimiento bacteriano (es decir, síntesis de masa, viabilidad celular, morfología celular, integridad de la membrana, contenido de ADN) y la forma en que estos evolucionan con el tiempo en una población bacteriana que crece bajo condiciones de estrés. También permite analizar la restauración del crecimiento normal a nivel de una sola célula y a nivel de población. El enfoque es aplicable a una amplia gama de especies bacterianas y a prácticamente cualquier tipo de tratamiento contra el estrés, como la exposición a antibióticos u otros compuestos antimicrobianos, análisis de la influencia de la interacción con otros organismos en múltiples especies poblaciones, o el efecto de la mutación genética.

El propósito general de este protocolo es analizar el comportamiento de las células bacterianas expuestas a tratamientos de estrés en la población y a nivel de una sola célula. Tradicionalmente, el crecimiento bacteriano y la viabilidad se abordan a nivel de población mediante el monitoreo de densidad óptica (OD600nm),que es un proxy de síntesis de masa celular bacteriana, o mediante ensayos de chapado para determinar la concentración de células viables en el cultivo (unidad formadora de colonias por mililitro, CFU/ml). En condiciones normales de crecimiento (sin tensión), las mediciones de OD600nm y CFU/ml están estrictamente correlacionadas porque el tiempo de duplicación bacteriana depende directamente del aumento de la masa celular1,2. Sin embargo, esta correlación a menudo se interrumpe en condiciones que afectan la síntesis de masa celular3, división celular4, o que desencadenan la lisis celular. Un ejemplo simple es proporcionado por tratamientos de estrés que inhiben la división celular, que resultan en la formación de células bacterianas filamentosas5,6. Las células filamentosas se alargan normalmente porque la síntesis de masa celular no se ve afectada, pero son incapaces de dividirse en células viables. En consecuencia, la densidad óptica de cultivo aumentará con el tiempo a un ritmo normal, pero no la concentración de células viables determinadapor mediante ensayos de chapado (CFU/ml). En este caso, como en muchos otros, las mediciones de densidad óptica y chapado son informativas, pero no proporcionan una comprensión completa del efecto observado inducido por el estrés. Estos ensayos de conjunto deben combinarse con técnicas de análisis de una sola célula para permitir una caracterización en profundidad de las deficiencias de crecimiento inducidas por el estrés.
Aquí, se describe un procedimiento que combina cuatro enfoques experimentales complementarios: (1) ensayos de chapado tradicionales y monitoreo de densidad óptica básica para monitorear la viabilidad celular y la síntesis de masa celular, respectivamente; (2) citometría de flujo para evaluar el tamaño de la célula y los parámetros de contenido de ADN en un gran número de células; (3) imágenes instantáneas de microscopía para analizar la morfología celular; y (4) imágenes de una sola célula de lapso de tiempo en cámaras microfluídicas para el examen de la dinámica temporal del destino celular. Este marco multiescala permite interpretar los efectos globales sobre el crecimiento celular y la viabilidad a la luz del comportamiento de las células individuales. Este procedimiento se puede aplicar para descifrar la respuesta de diversas especies bacterianas a prácticamente cualquier estrés de interés, incluido el crecimiento en condiciones particulares (es decir, medio de crecimiento, pH, temperatura, concentración de sal) o exposición a antibióticos u otros compuestos antimicrobianos.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Biología molecular certificada agarosa</td></tr><tr><td>Attune NxT Citómetro de enfoque acústico</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A24858</td><td>Citómetro</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX Sistema microfluídico</td><td>Merck Millipore</td><td>CAX2-S0000</td><td>Sistema microfluídico</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>Merck Millipore</td><td>ONIX2 1.0.1</td><td>Software microfluídico</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic</td><td>Merck Millipore</td><td>CAX2-MBC20</td><td>Sistema de colector</td></tr><tr><td>CytoOne Placa de 96 pocillos con tapa</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>Microplaca con volumen de trabajo de pocillos de 0,2 mL y fondo plano transparente, para lector automático de placas</td></tr><tr><td>E. coli cepa portadora de una inserción cromosómica para una fusión</td><td></td><td></td> <td>hupA-mCherryCreado por la transducción P1 de hupA-mCherry en E. coli MG1655</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Software de imagen. Citar Schindelin et al. si se utiliza en la publicación</td></tr><tr><td>Gene Frame</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0578</td><td>Blue frame (125 &mu; L, 1,7 x 2,8 cm)</td></tr><tr><td>Luria-Caldo medio de agarosa</td><td>MP Biomedicals 3002232</td><td></td><td>Medio de crecimiento para el ensayo de enchapado</td></tr><tr><td>MicrobeJ</td><td>Imagej/Fiji plugin</td><td>https://www.microbej.com/</td> <td>Plugin de análisis de imágenes de microscopía. Cita a Ducret et al. Si se utiliza en la publicación; Ajustes de detección: Para bacterias: Área (&mu; m2): 0,1-máx.; Longitud (&mu; m): 0,5-máx.; Anchura (&mu; m): 0,6-máx.; Rango (&mu; m): 0,5-máx.; Angularidad (rad): 0-0,3; 0-max para todos los demás parámetros. Para nucleoide: Tolerancia: 500; Umbral: Local; 0-max para todos los demás parámetros</td></tr><tr><td>Placas microfluídicas CellASIC ONIX</td><td>Merck Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Placa para sistema microfluídico</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio de fluorescencia</td></tr><tr><td>MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>Medio rico en crecimiento, 10x MOPS Mixtura, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucosa. Filtrado a 0,22 &mu; m</td></tr><tr><td>SYTO9 Tinción de ácido nucleico fluorescente verde</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S34854</td><td>Colorante fluorescente de ADN</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000</td><td>TECAN</td><td>30034301</td><td>Lector automático de placas</td></tr></tbody></table>

análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

El análisis de la capacidad bacteriana para crecer y sobrevivir en condiciones de estrés es esencial para una amplia gama de estudios de microbiología. Es relevante caracterizar la respuesta de las células bacterianas a tratamientos que inducen el estrés, como la exposición a antibióticos u otros compuestos antimicrobianos, irradiación, pH no fisiológico, temperatura o concentración de sal. Diferentes tratamientos de estrés pueden perturbar diferentes procesos celulares, incluyendo la división celular, replicación del ADN, síntesis de proteínas, integridad de la membrana, o regulación del ciclo celular. Estos efectos se asocian generalmente con fenotipos específicos a escala celular. Por lo tanto, comprender el alcance y la causalidad de las deficiencias de crecimiento o viabilidad inducidas por el estrés requiere un análisis cuidadoso de varios parámetros, tanto a nivel de una sola célula como a nivel de población. La estrategia experimental presentada aquí combina el monitoreo tradicional de la densidad óptica y los ensayos de chapado con técnicas de análisis de una sola célula, como la citometría de flujo y la imagen por microscopía en tiempo real en células vivas. Este marco multiescala permite una descripción del impacto de las condiciones de estrés en el destino de una población bacteriana.

El procedimiento descrito se utilizó para analizar el comportamiento de las células de Escherichia coli K12 durante la exposición transitoria a la cefalexina, un antibiótico que inhibe específicamente la división celular (Figura 1A)13. La cepa hupA-mCherry E. coli que produce la proteína HU etiquetada fluorescentemente asociada con el ADN cromosómico se utilizó para investigar la dinámica del cromosoma a lo largo de este tratamiento8,9. Las células hupA-mCherry E. coli que crecen exponencialmente se analizaron antes (t0) y 60 minutos después de la incubación con cefalexina (t60). Luego, se lavó el antibiótico y se analizó la recuperación de la población celular después de 1 h (t120) y 2 h (t180)(Figura 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> Figura 1: Procedimiento para el análisis de la respuesta bacteriana a los tratamientos de estrés. (A) Esquema del método. (B) Dibujos animados que ilustran la morfología celular durante el crecimiento normal en medio rico y durante la exposición transitoria a la cefalexina (Ceph.), desde la adición a (t0) y después del lavado de cefalexina de (t60)a (t180). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La evolución paralela de la OD y la CFU/ml es un primer indicador que ayuda a entender el efecto de los tratamientos de estrés. Estos dos parámetros están estrictamente correlacionados durante el crecimiento no perturbado, pero a menudo están desacoplados y evolucionan independientemente bajo estrés. Cultivos celulares que crecen en presencia de cefalexina mostraron oD similar600nm aumenta como los cultivos sin tensión (Figura 2A), mostrando que el fármaco no afectó la síntesis de masa celular. Sin embargo, la concentración de células viables no aumentó cuando la cefalexina estaba presente debido a la inhibición estricta de la división celular(Figura 2B). Las células comenzaron a dividirse de nuevo cuando se extirpó la cefalexina y finalmente alcanzaron una concentración equivalente al cultivo sin tensión en (t180). Estos resultados reflejan el efecto bacteriostático de la cefalexina, que induce una inhibición totalmente reversible de la división celular. Diferentes tensiones darán lugar a diferentes desacoplamientos de las curvas OD y CFU/ml, dependiendo del efecto inducido (por ejemplo, modificación de la morfología celular como filamentación o abultamiento, muerte celular con o sin lisis). En la Figura 2Cse presenta una lista no exhaustiva de posibles resultados indicativos de diferentes efectos inducidos por el estrés.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> Figura 2: Monitoreo del crecimiento bacteriano de células no tratadas y tratadas con cefalexina a nivel de población. (A) Monitorización de la densidad óptica (OD600nm/mL). (B) Concentración de células viables (CFU/ml) dentro de cultivos no tratados y tratados con cefalexina-60min. Las barras de error indican la desviación estándar para un triplicado experimental. (C) Esquemas de posibles resultados y efectos de tensión asociados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El análisis de una sola célula es esencial para interpretar con precisión la respuesta al estrés observada a nivel de población. La citometría de flujo permite el examen del tamaño celular y el contenido de ADN de varios miles de células14,15 (Figura 3). La exposición a la cefalexina provocó el aumento paralelo del tamaño celular y el contenido de ADN (t60). Cuando se eliminó la cefalexina, el tamaño de las células de población y el contenido de ADN disminuyeron gradualmente para llegar a ser similares a la población no testada en t180. Estos resultados muestran que la cefalexina no inhibió la replicación del ADN y provocó la formación de células filamentosas que contenían varios equivalentes cromosómicos. Estos filamentos se dividieron en células con tamaño celular normal y contenido de ADN cuando el fármaco fue lavado. Los resultados de la citometría de flujo serían muy diferentes para las tensiones que inhiben la síntesis de ADN, que conducen a la formación de células filamentosas que contienen sólo un cromosoma no replicante. En ese caso, el tamaño de las células aumentaría de manera similar, pero no se asociaría con el aumento del contenido de ADN.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> Figura 3: Análisis representativo de citometría de flujo de células no tratadas y tratadas con cefalexina-60min. (A) Histogramas de distribución de tamaño de celda (FSC-H). (B) histogramas de contenido de ADN (FL1-SYTO9). n 120.000 células analizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se utilizaron imágenes de microscopía instantánea para examinar la morfología celular y la organización intracelular del ADN mostrado por la localización de HU-mCherry(Figura 4A). La cefalexina provocó la formación de células largas con ancho celular normal y sin septo de división. Estos filamentos lisos contenían estructuras de ADN regularmente espaciadas llamadas nucleoides, lo que confirma que la cefalexina no afectaba a la replicación y segregación cromosómicas. El análisis cuantitativo de imágenes confirmó en gran medida el tamaño celular y el aumento del contenido de ADN observado anteriormente con citometría de flujo(Figura 4B,C). Los resultados serían muy diferentes para las tensiones que inducen daño al ADN, que conducen a la formación de células filamentosas en las que la replicación continúa, pero la segregación se ve afectada. En ese caso, el tamaño celular y el contenido de ADN aumentarían de manera similar, pero las células albergarían una sola masa no estructurada de ADN. Las imágenes instantáneas también podrían revelar otro tipo de formas celulares aberrantes o la presencia de celdas mini, anucleadas o lysed (células fantasma).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> Figura 4: Análisis de instantáneas de microscopía de células no tratadas y tratadas con cefalexina-60min. (A) Imágenes representativas de microscopía que muestran el contraste de fase (gris) y la señal HU-mCherry (rojo). (B) Histogramas de distribución de longitud de celda. Barra de escala: 5 m. (C) Histogramas del número de nucleoides por célula. Se analizaron entre 800 y 2.000 células para cada muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La microscopía de lapso de tiempo asociada con el aparato microfluídico16 ayudó a determinar los fenotipos observados anteriormente y proporciona información adicional sobre el desarrollo y la causalidad de la deficiencia de crecimiento. Las imágenes de lapso de tiempo(Figura 5A y Película 1) confirmaron que el alargamiento celular (síntesis de masa celular) y la replicación y segregación cromosómicas no se inhibiron por la exposición a la cefalexina. Además, reveló el proceso de recuperación cuando se eliminó la cefalexina. El análisis del linaje celular filamentoso mostró que la división celular se reinicia 20 minutos después de lavar el fármaco(Figura 5B). Las células divididas resultantes eran viables, porque a su vez se dividieron, lo que finalmente llevó a la formación de 33 células que exhiben tamaño normal y contenido de ADN. Esto permitió calcular un tiempo de generación total de 31 min durante los 180 min del experimento, que es similar al tiempo de generación calculado para la población no estresada a partir de mediciones de CFU/ml (33 min).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> Figura 5: Análisis de lapso de tiempo de microscopía de células tratadas con cefalexina-60min. (A) Imágenes representativas de microscopía que muestran el contraste de fase (gris) y la señal HU-mCherry (rojo). La celda filamentosa monitoreada está indicada por el contorno blanco, y las celdas divididas por diferentes colores. Barra de escala a 5 m. (B) Representación esquemática del linaje de celdas filamentosas correspondiente al panel (A) y a la película 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> Película 1: Película microfluídica de E. coli HU-mCherry tratada con cefalexina. Cephalexin se inyectó después de 60 min, seguido de la inyección de medio RDM fresco durante 3 h. Tiempo indicado en amarillo (1 fotograma cada 10 min). Barra de escala a 5 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).</a>

Este protocolo permite una descripción del crecimiento bacteriano en condiciones de estrés en los niveles de población de una sola célula y célula.

Análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

El propósito general de este método es analizar el efecto del tratamiento del estrés en las células bacterianas, tanto en la célula única como en el nivel de la población. Proporciona una visión global del efecto del estrés en varios aspectos del crecimiento bacteriano, incluyendo la viabilidad celular, morfología, y el contenido de ADN. También permite caracterizar la recuperación de la población.Este método podría ser utilizado en la industria farmacéutica para detectar la actividad de la nueva molécula antimicrobiana y apreciar su impacto en la viabilidad y el crecimiento de las bacterias. El tratamiento que induce el estrés tiene una ineficiencia, como la dosis y depende del tiempo. Puede ser necesario realizar pruebas preliminares para determinar la dosis óptima y la duración del tratamiento antes de iniciar este protocolo.La demostración visual de este método permite imaginar detalles importantes de cada paso crítico y cómo realizarlos correctamente. Para empezar, inocular cinco mililitros de MOPS EZ Rich Defined Medium con una sola colonia de E. coli MG1655 HU-PAmCherry y crecer a 37 grados celsius con temblores a 140 rotaciones por minuto durante la noche. A la mañana siguiente, extraiga 100 microlitros de la muestra y diluya con 900 microlitros de medio para medir la densidad óptica a 600 nanómetros.A continuación, diluir el cultivo en un tubo de ensayo que contenga un medio fresco a un nanómetro OD600 de 0,01. Incubar el tubo de ensayo inoculado a 37 grados Celsius con agitación a 140 RPM hasta que la densidad óptica alcance 0.2, correspondiente a la fase exponencial completa en medio rico. A continuación, aliquot las muestras de cultivo para la toma de imágenes de microscopía de lapso de tiempo, el ensayo de dilución y chapado, el análisis de citometría de flujo y la imagen de instantánea de microscopía.Exponga los 4,4 mililitros restantes de cultivo celular en el tubo de ensayo a un tratamiento específico contra el estrés. Por ejemplo, 4,4 microlitros de cefalexina a cinco microgramos por mililitro e incubar a 37 grados centígrados con temblores a 140 RPM. Preparar diluciones seriales de diez veces, hasta 10 a menos séptima, de las 200 microlitros de la muestra de cultivo en medio fresco.Mezclar entre cada dilución por vórtices muy suaves o invirtiendo el tubo. Placa 100 microlitros de la dilución apropiada en placas de agarosa LB no seleccionadas e incubar durante la noche a 37 grados celsius. Al día siguiente, cuente el número de colonias para determinar la concentración de células viables en cada muestra de cultivo.Trazar la CFU por mililitro en función del tiempo para los cultivos celulares no tratados y tratados. Mida el OD600 de la cultura en un espectrofotómetro. Diluir la muestra de cultivo con un medio fresco a cuatro grados centígrados para obtener una muestra con OD600 a 0,06, correspondiente a aproximadamente 15.000 células por microlitro.Para la tinción de ADN, mezcle la muestra bacteriana diluida con una solución de 10 microgramos por mililitro de colorante fluorescente de ADN a la ración de volumen de uno a uno e incubar en la oscuridad durante 15 minutos. Antes de la inyección de la muestra, mezcle la muestra por vórtices muy suaves o invirtiendo el tubo. Pase la muestra al citometro de flujo a un caudal de aproximadamente 120.000 células por minuto.Adquiera luz dispersa hacia adelante y dispersa lateralmente, así como una señal fluorescente/fluorescente de ADN con los ajustes adecuados. Trazar el histograma de densidad celular disperso hacia delante para representar la distribución del tamaño de la célula y trazar el histograma de densidad de celda de señal fluorescente/colorante fluorescente de ADN para representar el contenido de ADN en la población celular. Primero, precalienta la cámara del microscopio termostatado a 37 grados Celsius para estabilizar la temperatura.Prepare las diapositivas montadas en agarosa como se describe en el manuscrito. Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y realice la adquisición de imágenes utilizando la luz transmitida con un objetivo de contraste facial y con excitación de fuente de luz a 560 nanómetros para mCherry. Seleccione campos de visión que contengan celdas aisladas para facilitar la detección automatizada de celdas durante el análisis de imágenes.Asegúrese de que al menos 300 celdas se utilizan para permitir un análisis estadístico sólido de la población celular. En primer lugar, retire la solución de conservación de la placa microfluídica y sustitúyalo por un medio fresco precalentado a 37 grados Centígrados como se describe en la Guía del usuario de Microfluidic Software. Fije la placa microfluídica al sistema del colector.Y en el software microfluídico, haga clic en el botón Sellar para sellar en la placa al sistema múltiple. Después de eso, haga clic en el botón Priming. Coloque la placa microfluídica con el sistema del colector en la etapa del microscopio y precaliente a 37 grados centígrados durante dos horas para evitar la dilatación de la cámara microfluídica.Cierre la placa microfluídica del sistema microfluídico haciendo clic en el botón Seal Off. Sustituya el medio de pozo ocho por 150 microlitros de muestra de cultivo y sustituya el medio del pozo uno al cinco por el medio deseado, con o sin el reactivo que induce la tensión. Selle la placa microfluídica y colóquela en la etapa del microscopio.En el software microfluídico, ejecute el procedimiento de carga de celdas. Compruebe que la carga de las células es satisfactoria mirando bajo el microscopio en luz transmitida. Concéntrese cuidadosamente en el modo de luz transmitida y seleccione varios campos de visión que muestren bacterias aisladas y no estén superpoblados, alrededor de 10 a 20 células por cada 100 microlitros cuadrados.En el software microfluídico, haga clic en el botón Ejecutar una secuencia personalizada y, a continuación, programe la inyección del medio inductor de estrés durante 10 minutos a dos PSI, seguido de la inyección en una PSI durante la duración deseada del tratamiento de estrés. Realice imágenes de microscopía en el modo de lapso de tiempo con un fotograma cada 10 minutos, utilizando contraste de fase en la luz transmitida y una fuente de luz de excitación de 560 nanómetros para la señal mCherry si es necesario. Inicie la adquisición de imágenes microscópicas y el protocolo de inyección microfluídica al mismo tiempo.Abra el software Fiji y el plugin MicrobeJ. Para el análisis de instantáneas, suelte todas las imágenes correspondientes a una diapositiva de microscopio en la barra de carga de MicrobeJ para concatenar imágenes y guardar el archivo de pilas de imágenes obtenidas. Para los datos de lapso de tiempo, simplemente suelte la pila de imágenes en la barra de carga de MicrobeJ.Ejecutar la detección automatizada de los contornos de la célula en función de la segmentación de la imagen de contraste de fase y ejecutar la detección de los nucleoides en función de la segmentación de la señal fluorescente de ADN teñido. Compruebe visualmente la precisión de la detección de celdas y utilice la herramienta de edición MicrobeJ para corregirla si es necesario. Guarde el archivo de resultados obtenido.Haga clic en el icono ResultJ para completar el análisis y obtener la ventana ResultJ. Se generan muchos tipos diferentes de gráficos de salida. Trazar los histogramas normalizados de la forma o longitud de la célula y el número medio de nucleoides por celda.Este estudio analizó el comportamiento de las células de Escherichia coli K-12 durante la exposición transitoria a la cefalexina, un antibiótico que inhibe específicamente la división celular. Los cultivos celulares que crecen en presencia de cefalexina exhibieron aumentos similares de OD600 a medida que los cultivos sin estmente. La concentración de células viables no aumentó cuando había cefalexina.Las células comenzaron a dividirse de nuevo cuando se eliminó la cefalexina y finalmente alcanzaron una concentración equivalente al cultivo sin estrés después de dos horas. Diferentes tensiones resultaron en un desacoplamiento de la OD y la CFU por mililitro curvas, dependiendo del efecto inducido. La exposición a cefalexina provocó un aumento paralelo del tamaño de la célula y el contenido de ADN.Cuando se eliminó la cefalexina, el tamaño de las células de la población y el contenido de ADN disminuyeron gradualmente y se volvieron similares a la población sin estes después de dos horas. La cefalexina provocó la formación de células largas con un ancho celular normal y luego sin septa de división. El análisis cuantitativo de imágenes confirmó el tamaño de la célula y el aumento del contenido de ADN.Las imágenes de lapso de tiempo confirman que el alargamiento celular y la replicación y segregación de cromosomas no se inhibieron por la exposición a la cefalexina. El análisis del linaje celular filamentado mostró que la división celular se reinició aproximadamente 20 minutos después de lavar el medicamento. Es crucial asegurarse de que la población bacteriana está en pleno crecimiento exponencial antes de inducir tratamientos de estrés.El tratamiento que induce el estrés utilizado para estos enfoques podría ser peligroso para la experimentalidad, como el compuesto genotóxico. Así que manipule el compuesto con cuidado y use guantes, máscaras, gafas y bata de laboratorio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Análisis microscópico del crecimiento bacteriano bajo estrés utilizando cámaras microfluídicas

Fuente: Jeong, H., et al. Procedimiento para la evolución adaptativa en laboratorio de microorganismos utilizando un quimiostato. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demuestra el aislamiento selectivo y el crecimiento de bacterias adaptadas al estrés a partir de un cultivo expuesto a condiciones prolongadas de estrés. El cultivo se coloca sobre agar que contiene un factor de estrés, y se selecciona una sola colonia para inocular un medio líquido con el factor de estrés. La absorbancia se mide a...

Aislamiento de bacterias adaptadas al estrés mediante selección de colonia única

Hemos desarrollado una plataforma microfluídica para la prueba rápida de la susceptibilidad a los antibióticos. El líquido se pasa a altas velocidades sobre las bacterias inmovilizadas en el fondo de un canal microfluídico. En presencia de estrés y antibióticos, las cepas susceptibles de bacterias mueren rápidamente. Sin embargo, las bacterias resistentes pueden sobrevivir a estas condiciones estresantes.

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ScanLag es un método de alto rendimiento para medir el retraso en el crecimiento, es decir, el tiempo de retraso, así como la tasa de crecimiento de las colonias para miles de células en paralelo. El cribado con ScanLag permite discriminar entre un retraso prolongado y un crecimiento lento a nivel de una sola variante.

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