Name: Monitoreo de anticuerpos PD-1-Blocking Enlazados a Células T derivadas de una gota de sangre periférica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Aprende a evaluar anticuerpos bloqueadores de PD-1 en células T mediante citometría de flujo usando una pequeña muestra de sangre periférica. Este método permite identificar subpoblaciones inmunitarias relevantes para la inmunoterapia del cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por subvenciones a S.K. de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (JP17K16045) y la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (JP18cm0106335 y 19cm0106310).

El muestreo se realizó durante los procedimientos clínicos de rutina. Todas las muestras humanas se obtuvieron después de que los sujetos proporcionaran el consentimiento informado, de conformidad con la Declaración de Helsinki y con la aprobación de la junta de revisión ética de la Escuela de Posgrado de Medicina de la Universidad de Osaka, Japón (15383 y 752).
1. Preparación y tinción de muestras de sangre enteras
<ol><li>Recoger muestras de sangre entera en tubos de recolección de sangre que contienen ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA). NOTA: La recolección de sangre se puede realizar con una aguja normal o una lanceta de sangre.</li>
	<li>Transfiera 20 ml de muestras de sangre entera a tubos de citometría de flujo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. NOTA: Para reducir la unión no específica de las células a los tubos, se añade 1 ml de suero bovino fetal (FBS) al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en tubos y vórtice durante 10 s antes de la aplicación a las muestras.</li>
	<li>Añadir 20 sl de 2% FBS en PBS.</li>
	<li>Añadir 10 s de reactivo de bloqueo fcR específico para humanos. Mezclar bien e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 500 l de tampón de lisis de glóbulos rojos. Mezclar bien e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 4 ml de 2% DE FBS en PBS y espírelas a 400 x g (1.500 rpm) durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante por aspiración.</li>
	<li>Repita el proceso de lavado y aspiración descrito en el paso 1.6.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 100 s de 2% FBS en PBS y divídalas en dos tubos de 50 ol cada uno.</li>
	<li>Añadir anticuerpos de marcador de superficie (Tabla 1). Mezclar bien e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. NOTA: Al perfilar el estado inmune de los células T, el número de marcadores se puede aumentar en función de la calidad de la máquina de citometría de flujo.</li>
	<li>Lave las muestras 2x como se describe en el paso 1.6.</li>
	<li>Resuspenda las células en 200 s de 2% DE FBS en PBS.</li>
</ol>2. Análisis citométrico de flujo
<ol><li>Inserte tubos en el citómetro de flujo y adquiera células, básicamente siguiendo el protocolo recomendado9.</li>
	<li>Registre 10.000 eventos como la puerta de linfocitos(Figura 1A)y exporte datos de flujo como archivos .fcs para su análisis.</li>
	<li>Abra archivos en el software de análisis. Visualice las células en una dispersión hacia adelante (FSC) (A) frente a la dispersión lateral (SSC) (A) gráfica y linfocitos de puerta(Figura 1A).</li>
	<li>Después de seleccionar celdas individuales usando FSC (H) vs FSC (W) y SSC (H) vs SSC (W)(Figura 1B) y mostrándolas en una gráfica CD3 vs CD8 o CD3 vs CD4, engarre las células CD8 T y las células CD4 T, respectivamente (Figura 1C).</li>
	<li>Después de seleccionar las celdas cerradas y mostrarlas en una gráfica de PD-1 frente a IgG4 humana, identifique las células CD8 y CD4 T enlazadas a anticuerpos PD-1 en función del control de isotipos(Figura 1D).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, informamos de un método utilizando un citómetro de flujo para detectar anticuerpos de bloqueo PD-1 unidos a células T derivados de una gota de sangre periférica, que originalmente desarrollamos para la detección de nivolumab10. Aunque esta técnica es muy simple y fácil de realizar, se deben observar dos puntos importantes para obtener resultados precisos. Una es que para detectar moléculas de PD-1, se debe utilizar un anticuerpo adecuado que compita con nivolumab y pembrolizumab....

Los anticuerpos de bloqueo de PD-1 se han convertido en la opción estándar para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)1,2,3,4. Muestran un efecto terapéutico notable en un subconjunto de pacientes con cáncer que no han respondido a las quimioterapias citotóxicas convencionales. Sin embargo, los inhibidores del punto de control inmune (IIC), que incluyen anticuerpos de bloqueo de PD-1, pueden causar un espectro único y distinto de eventos adversos, llamados eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE)5. Aunque las irAEs pueden afectar casi todos los tejidos, se observan más comúnmente en el tracto gastrointestinal, glándulas endocrinas, piel, y el hígado, y pueden causar prurito, erupción cutánea, náuseas, diarrea, y trastornos de la tiroides6,7. En general, la mayoría de las iAE aparecen entre 1 y 2 meses después del inicio de las IIC. Sin embargo, en algunos casos, pueden ocurrir más tarde de 1 año después del inicio del tratamiento o incluso después de la interrupción del tratamiento6,7. También causan varios síntomas que pueden ser difíciles de discriminar de otras patologías. Por lo tanto, puede ser difícil diagnosticar rápidamente irAEs y tratarlos adecuadamente. irAE puede afectar a todos los tejidos, y su aparición está fuertemente influenciada por las células inmunitarias circulantes, especialmente las células T unidas a los anticuerpos de bloqueo de PD-1. Por lo tanto, un método sencillo y mínimamente invasivo para monitorear las células T dirigidas a anticuerpos es importante en entornos clínicos.
Aquí, desarrollamos un método sencillo para evaluar la unión de los anticuerpos pd-1, bloqueando los anticuerpos a las células T utilizando una gota de sangre entera periférica de pacientes con cáncer que recibieron nivolumab o pembrolizumab. Utilizando este enfoque, pudimos monitorear cada uno de los siguientes: 1) la duración de la unión de anticuerpos a las células T, 2) la ocupación de las moléculas DE PD-1 de células T por anticuerpos terapéuticos, y 3) el estado de activación y las características inmunológicas de los células T. Este método es una modificación de una técnica notificada previamente8. La cantidad de sangre requerida es casi la misma que la necesaria para una prueba de glucosa, y el enfoque no requiere enriquecimiento de células mononucleares o co-cultivo con anticuerpos de bloqueo de PD-1. Confirmamos que este método también se puede realizar utilizando muestras congeladas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica (PPBM) y células de derrame pleural, derrame pericárdico, líquido de lavado broncoalveolar, y líquido cefalorraquídeo, lo que sugiere que esta estrategia puede ser útil en el contexto de un estudio multicéntrico. Este método puede facilitar el diagnóstico precoz de irAEs, y también ayudar a determinar los tratamientos inmunosupresores adecuados para controlar sus síntomas e identificar los tiempos óptimos para iniciar terapias posteriores después de los inhibidores de la PD-1.

<table><tbody><tr><td>Tampón de lisis 10X RBC (multiespecie)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anticuerpo CD4 humano</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>Clon RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Citómetro de flujo Canto II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-humano Anticuerpo CD8a</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>clon RPA-T8</td></tr><tr><td>Fosfato de Dulbecco Solución salina tamponada</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Falcon Tubos de poliestireno de fondo redondo</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo de FcR, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Ratón IgG1 monoclonal - Control de isotipo</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal Anti-Humano IgG4 Fc</td><td></td><td>abcam ab99825</td><td>Clon HP6025</td></tr><tr><td>Pacific Blue Ratón Anti-Humano CD3</td><td>BD</td><td></td><td>558117 Clon UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Ratón anti-humano CD279 (PD-1)</td><td>BD</td><td>561272</td><td>Clon EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Ratón IgG1 &kappa; Control de isotipo</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo de anticuerpos pd-1-blocking enlazados a células t derivadas de una gota de sangre periférica

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Los inhibidores del punto de control inmune, incluidos los anticuerpos que bloquean la DP-1, han mejorado significativamente los resultados del tratamiento en varios tipos de cáncer. La eficacia farmacológica de estas inmunoterapias es de larga duración, extendiéndose incluso más allá de la interrupción de sus inyecciones, debido a las concentraciones persistentes de sangre. Aquí desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar el estado de unión a las células T de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 nivolumab y pembrolizumab. Al igual que una prueba de glucosa, este ensayo requiere una sola gota de sangre periférica. Visualizar la unión de anticuerpos en los células T es más fiable que medir las concentraciones de anticuerpos en la sangre. Además, si es necesario, podemos analizar potencialmente muchos marcadores distintivos relacionados con el sistema inmunitario en células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo PD-1. Por lo tanto, se trata de una estrategia simple y mínimamente invasiva para analizar el efecto farmacológico de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 en pacientes con cáncer.

La estrategia de gating y el análisis de citometría de flujo(Figura 1) pueden detectar la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los glóbulos T obtenidos a partir de una gota de sangre periférica del paciente NSCLC. Antes de administrar el anticuerpo de bloqueo PD-1, no hay células T IGG4 positivas humanas, y la expresión PD-1 puede ser confirmada por un anticuerpo de detección de PD-1 (EH12.1)(Figura 2A). Después de la administración de nivo...

Desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar la unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los células T, que requieren sólo una gota de sangre periférica de los pacientes con cáncer.

Monitoreo de anticuerpos PD-1-Blocking Enlazados a Células T derivadas de una gota de sangre periférica

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Debido a que este método determina las células unidas a anticuerpos que bloquean la DP-1 utilizando sangre periférica de los pacientes, se puede identificar el subconjunto específico responsable de los efectos antitumorales y los eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario. Este método sólo necesita una pequeña cantidad de muestra de sangre y el proceso de análisis es bastante simple y rápido. Sólo necesita una máquina de citometría de flujo.Para comenzar, recoja muestras de sangre entera en tubos de recolección de sangre que contengan EDTA. Tratar cada tubo de citometría de flujo de poliestireno redondo de cinco mililitros con un mililitro de suero bovino 2% fetal en PBS. Vórtice durante 10 segundos.A continuación, transfiera 20 microlitros de muestras de sangre entera a los tubos inferiores redondos de cinco mililitros tratados. Añadir 20 microlitros de 2%FBS en PBS y 10 microlitros de reactivo de bloqueo de receptores FC específicos para humanos. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de lyis de glóbulos rojos. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadir cuatro mililitros de 2%FBS en PBS y girar las células hacia abajo a 400 veces g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Retire el sobrenadante por aspiración. Repita el proceso de lavado y aspiración. Resuspender las células en 100 microlitros de 2%FBS en PBS y dividir en dos tubos de 50 microlitros cada uno.Agregue anticuerpos marcadores de superficie. Mezclar bien e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las muestras dos veces en 2%FBS en PBS como anteriormente.Resuspender las células en 200 microlitros de 2%FBS en PBS. Inserte los tubos en el citometro de flujo y adquiera las células siguiendo el protocolo recomendado. Registre 10.000 eventos como la puerta de linfocitos y exporte datos de flujo como archivos FCS para su análisis.Abra archivos en el software de análisis y haga clic en el archivo de control de isotipo para visualizar las celdas en una dispersión hacia delante frente frente a la gráfica de dispersión lateral y linfocitos de puerta. Seleccione celdas individuales utilizando FSCH frente a FSCW y SSCH frente a SSCW y muésquelas en una gráfica CD3 frente a CD8 o CD3 frente a CD4. Ate la puerta de las células T CD8 y las células T CD4 respectivamente.Seleccione las celdas cerradas y muésquelas en una gráfica PD-1 frente a IgG4 humana. Y luego, en función del control de isotipos, seleccione Q3 para identificar las células T8 y CD4 enlazadas a anticuerpos de bloqueo de PD-1. En este estudio, la estrategia de gating y el análisis de citometría de flujo detectaron la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a las células T obtenidas de una gota de sangre periférica del paciente.La gráfica PD-1 frente a IgG4 humana muestra el estado de unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 en las células T. Los puntos naranjas y los puntos negros indican la tinción de anticuerpos y isotipos anti-IgG4 respectivamente. Antes de administrar el anticuerpo de bloqueo de PD-1, no había células T CD8 o CD4 positivas IgG4 humanas y se confirmó la expresión de PD-1 mediante un anticuerpo de detección de PD-1.Después de la administración de nivolumab o pembrolizumab, IgG4 puede detectarse en células T mediante anticuerpos anti-IgG4, mientras que el PD-1 que detecta anticuerpos EH12.1 no reconoce ningún PD-1 en las células T. Las puertas rojas, azules y verdes indican la unión completa, la unión parcial y la pérdida de enlace respectivamente. Después de que los pacientes interrumpieron nivolumab y pembrolizumab, el estado de la unión de anticuerpos de bloqueo de PD-1 a células T CD8 disminuyó.Hubo un enlace parcial y finalmente la pérdida completa de enlace. Por favor, asegúrese de mezclar la muestra de sangre con la lelisis RBC también. Además, mezclar la lysis RBC antes de la tinción del marcador de superficie es el paso clave en este método.Si el investigador tiene acceso a una máquina avanzada de citometría de flujo, las células T enlazadas a anticuerpos de bloqueo de PD-1 se pueden evaluar con más y más marcadores relacionados con esta estrategia se puede aplicar para perfilar fenotipos de células T responsables de eventos adversos causados por anticuerpos de bloqueo de PD-1. El muestreo de pacientes con eventos adversos desarrollados es importante para evaluar la utilidad de esta estrategia.

monitoring-pd-1-blocking-antibodies-bound-to-t-cells-derived-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este artículo describe una técnica simple para inducir aloantígenos específicos de anergia en las células mononucleares de sangre periférica. La técnica puede aplicarse clínicamente para generar no aloreactivas células del donante. La infusión de estas células podría mejorar la reconstitución inmune y reducir la toxicidad después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

La inducción de anergia aloantígenos específicos en las células mononucleares de sangre periférica mediante estimulación aloantígeno con bloqueo de señales co-estimuladoras

Este video muestra una técnica basada en citometría de flujo que utiliza dos fluorocromos para identificar linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y monocitos en linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Al incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores de superficie, los subconjuntos de células se identifican utilizando una estrategia óptima de activación por citometría de flujo.

Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

El protocolo describe una técnica para estudiar la capacidad del primario policlonal T las células humanas para formar sinápticas interfaces con bicapas lipídicas planares. Utilizamos esta técnica para mostrar la capacidad de formación de sinapsis diferencial de las células T humanas principal derivado de los ganglios linfáticos y la sangre periférica.

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Este protocolo detalla la preparación clínicamente implementable de biomuestras de PBMC y plasma de alta calidad en el sitio del ensayo clínico que se pueden utilizar para el análisis de biomarcadores traslacionales.

Preparación De Pellets De Células Mononucleares De Sangre Periférica Y Plasma De Una Sola Extracción De Sangre En Los Sitios De Ensayos Clínicos Para El Análisis De Biomarcadores

El uso de reactivos de referencia para el ensayo de liberación de citocinas permite obtener perfiles de seguridad in vitro más reproducibles y estandarizados de los anticuerpos monoclonales inmunoterapéuticos. En este artículo describimos cómo se pueden utilizar los ensayos de liberación de citocinas junto con un panel de reactivos de referencia para predecir la seguridad de algunos anticuerpos monoclonales terapéuticos.

Uso de reactivos de referencia para confirmar la solidez de los ensayos de liberación de citocinas para la predicción de la seguridad de los anticuerpos monoclonales

Los inhibidores de puntos de control son objetivos importantes en el desarrollo de terapias para la batalla contra el cáncer. Este informe presenta una nueva vacuna contra el cáncer basada en péptidos PDL1, PDL1-Vaxx, que induce la producción de anticuerpos policlonales neutralizantes que bloquean la formación del complejo PD-1/PDL1. Este trabajo también detalla el desarrollo y prueba de un ensayo basado en perlas fluorescentes para analizar esta actividad.

Análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido PDL1-Vaxx de la interacción PD-1/PD-L1

Este protocolo describe un ensayo de bloqueo para inhibidores de PD-1/PD-L1 utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie. Emplea una estrategia de inmovilización de dos pasos y un sistema de amortiguación personalizado para medir con precisión las unidades de respuesta, lo que facilita la evaluación de las tasas de bloqueo de compuestos o productos biológicos. Además, admite la identificación de alto rendimiento de inhibidores de PD-1/PD-L1.

Identificación de inhibidores de PD-1/PD-L1 con tecnología de resonancia de plasmón de superficie

Aprende a evaluar anticuerpos bloqueadores de PD-1 en células T mediante citometría de flujo usando una pequeña muestra de sangre periférica. Este método permite identificar subpoblaciones inmunitarias relevantes para la inmunoterapia del cáncer.

Monitoreo de anticuerpos PD-1-Blocking Enlazados a Células T derivadas de una gota de sangre periférica

Explorar más videos