Pruebas de hemocompatibilidad de implantes que contactan con la sangre en un modelo de bucle de flujo que imita el flujo sanguíneo humano

Este protocolo presenta un modelo para la investigación de la hemocompatibilidad de los dispositivos de contacto con la sangre de acuerdo con las directrices de la Organización Internacional Estándar. El modelo es ideal para imitar las condiciones fisiológicas que corresponden al implante ya que el fondo bajo para eventos trombóticos y la baja concentración de anticoagulantes permiten un amplio análisis del parámetro sanguíneo. Este método es ideal para la investigación de biomateriales ya que proporciona una manera sencilla de evaluar la hemocompatibilidad.

Además, se puede utilizar para estudios preclínicos. Para la carga de heparina, primero mezcle 5.000 unidades internacionales de heparina sin diluir con 0,9% de cloruro de sodio para obtener 15 unidades internacionales por mililitro de concentración de heparina. A continuación, añada 900 microlitros de la solución de heparina diluida a tres monovettes neutros y tres monovettes reservados por donante y almacene las monovettes cargadas de heparina a cuatro grados centígrados.

30 minutos antes de la recolección de la muestra de sangre, coloque las monovettes a temperatura ambiente. Cuando los monovettes se hayan calentado, recoja nueve mililitros de sangre en cada uno de los tres monovettes por donante antes de agrupar los 27 mililitros de sangre de cada donante en un solo recipiente de plástico. Para preparar el bucle de flujo, cargue al menos un tubo por condición con el implante de corte láser neurovascular de interés y coloque un extremo de cada tubo en un depósito lleno de cloruro de sodio al 0,9%.

Coloque un tubo descargado en el depósito y conecte todos los tubos al cabezal de la bomba. A continuación, inserte el otro extremo de cada tubo en un cilindro de medición y ajuste los ajustes de la bomba peristáltica a un caudal de 150 mililitros por minuto utilizando un temporizador mientras comprueba el nivel de llenado en el cilindro de medición. Para las pruebas de hemocompatibilidad, utilice una jeringa de 12 mililitros para llenar cada tubo con seis mililitros de sangre.

Después de formar un circuito, utilice una longitud de 0,5 centímetros de tubo de conexión de silicona para cerrar los tubos firmemente y colocar los tubos en un baño de agua Celsius de 37 grados. A continuación, encienda el tubo de 60 minutos. Para el análisis de hemograma completo, agregue 1,2 mililitros de sangre no fusionada o 1,2 mililitros de sangre de cada tubo después de la perfusión en monovettes individuales que contengan EDTA.

Invierta cuidadosamente los monovettes cinco veces y cargue los viales en un analizador de sangre para un análisis de hemograma de cada muestra. Al final del análisis, coloque las monovettes sobre hielo durante 15-60 minutos. Para la recogida de plasma de citrato, llene los monovettes que contienen citrato con 1,4 mililitros de sangre no perfundida o perfundida e invierta cuidadosamente cada monovette cinco veces.

Separe el plasma por centrifugación y transfiera tres alícuotas de 250 microlitros de la fracción plasmática en tubos de reacción individuales de 1,5 mililitros. A continuación, congele las muestras de plasma en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 20 grados centígrados hasta su análisis. Para la recolección de plasma EDTA, después de la incubación de cuatro grados Celsius después de la medición del hemograma, separe el plasma por centrifugación y transfiera tres alícuotas de 250 microlitros de la fracción plasmática en tubos de reacción individuales de 1,5 mililitros.

A continuación, congele las muestras de plasma en nitrógeno líquido durante menos 20 grados centígrados de almacenamiento. Para la recogida de plasma CTAD, llene las monovettes que contienen CTAD con 2,7 mililitros de sangre recién extraída o perfundida e invierta cuidadosamente los tubos cinco veces. Colocar los monovettes sobre hielo durante 15-60 minutos antes de recoger el plasma por centrifugación.

Transfiera 700 microlitros de cada fracción de plasma medio a tubos de reacción individuales de 1,5 mililitros y centrifugar de nuevo los tubos de reacción llenos. A continuación, transfiera dos alícuotas de 100 microlitros de la fracción media a tubos de reacción individuales de 1,5 mililitros y congele los tubos en nitrógeno líquido para su almacenamiento a menos 20 grados centígrados. Para medir los niveles de TAT en las muestras de plasma de citrato, agregue 50 microlitros de tampón de muestra ELISA en cada pozo de una placa inferior plana de 96 pozos y 50 microlitros de muestras plasmáticas estándar, de control plasmático y de plasma sin diluir en duplicados a los pozos apropiados de la placa.

Después de sellar la placa, incubar las muestras a 37 grados Celsius durante 15 minutos con un suave temblor. Al final de la incubación, lave la placa tres veces con 300 microlitros de solución de lavado por pozo antes de añadir 100 microlitros de anticuerpos antihumanos anhumanos conjugados de peroxidasa a cada pocómo. Después de una incubación de 15 minutos a 37 grados Celsius con agitación, lave la placa tres veces con 300 microlitros de solución de lavado fresco por pozo.

Después del último lavado, agregue 100 microlitros de solución de cromógeno recién preparada por pozo para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añada 100 microlitros de solución de parada a cada pocótulo y lea la densidad óptica en un fotómetro a 490 a 500 nanómetros utilizando los datos de curva estándar como línea de tendencia para calcular la concentración de TAT de cada muestra. Para preparar los implantes para escanear la microscopía electrónica, utilice fórceps para extraer los implantes de los tubos y enjuague brevemente cada implante tres veces en cloruro de sodio fresco de 0,9% por lavado.

Después del último lavado, almacene los implantes en recipientes individuales de 2%glutaraldehído en PBS sin calcio y magnesio durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, incubar los implantes en recipientes individuales de PBS durante 10 minutos antes de deshidratar los implantes en concentraciones ascendentes de etanol durante 10 minutos por concentración como se indica. Inmediatamente después de la recolección de sangre y la perfusión, no se detectan cambios en el número de glóbulos blancos o rojos o en los valores de hematocrito.

Sin embargo, se detecta una disminución en los niveles de hemoglobina después de la perfusión dentro del sistema de bucle de flujo. También se observa una disminución en el número de plaquetas, que aumenta cuando un stent sin recubrimiento está presente dentro de la tubería. En particular, esta pérdida se reduce cuando la sangre se incuba con un stent recubierto de fibrina-heparina.

La concentración compleja de TAT aumenta ligeramente en respuesta a la perfusión. Sin embargo, cuando se añade un stent de metal desnudo, se detecta un aumento significativo en el TAT que indica una activación profunda del sistema de coagulación. El uso de un stent recubierto de fibrina-heparina impide esta activación.

La perfusión conduce a una mayor activación de la cascada de cumplido que no se ve afectada por la presencia de stents no recubiertos o recubiertos de fibrina- heparina. Del mismo modo, los granulocitos neutrófilos se activan como lo demuestra la cuantificación de los niveles de elastasa de neutrófilos polimorfóloclear. La visualización mediante microscopía electrónica de barrido revela que la presencia de una densa red de células sanguíneas y proteínas en la superficie del stent no recubierto después de la perfusión que no se observa en los stents recubiertos de fibrina-heparina.

Es de suma importancia confirmar que la sangre cumple con los criterios de inclusión para la obtención de muestras y para utilizar sangre recién extraída lo más rápido posible. La sangre humana puede contener virus transmitidos por la sangre y otros agentes y conlleva el riesgo de infección, así que asegúrese de usar siempre un EPP adecuado al manipular las muestras.